Transkriptomianalyysin avulla
R. solani AG3-PT -isolaatin Ben3 ja keskikestävän perunalajikkeen ’Arkula’ välinen vuorovaikutus analysoitiin transkriptomitasolla RNA-sekvensoinnin avulla. Vuorovaikutuksen syntymisen ja vuorovaikutuksen etenemisen kannalta tärkeiden tekijöiden löytämiseksi käytimme kolmea erilaista näytteenottoa: R. solani AG3-PT -isolaatti Ben3:n puhdasta myseeliä viljeltynä ilman, että kasvava perunakasvi olisi houkutellut sitä (Ben3); perunan versoja 3 dpi:n kohdalla mukuloista, joissa oli R. solani (aikainen) ja 8 dpi:n kohdalla (myöhäinen). Molempina näytteenottopäivinä, jolloin R. solani oli vuorovaikutuksessa perunan verson kanssa, kaikki kehittyvät versot korjattiin ja käytettiin analyysissä. Versojen nekroottiset vauriot tulevat ensimmäisen kerran näkyviin 8 dpi:n kohdalla. Tämän jälkeen suoritettiin RNA:n uuttaminen, RNA:n sekvensointi (RNAseq) ja lukemien kartoittaminen isolaatti Ben334:n genomiin lukemien laskemiseksi lukemia kilobaasia kohti miljoonaa kartoitettua lukemaa kohti (RPKM). Yleensä inokuloitujen näytteiden osalta 1-23 prosenttia kustakin tietokokonaisuudesta kartoitettiin Ben3:n genomiluonnokseen. Kontrollinäytteistä 70-75 prosenttia näistä dataseteistä voitiin kartoittaa Ben3-genomiin.
Kaikissa kolmessa näytteenotossa voitiin havaita vastaava määrä geenejä ilmentyneinä (taulukko 1). Puhtaassa myseelissä 11 206 geeniä R. solani AG3-PT -isolaatin Ben3-genomin tunnistetuista 12 567 geenistä ekspressoitui, kun taas lukemat voitiin kartoittaa 10 181:lle ja 9 939:lle geenille 3 dpi:n ja 8 dpi:n kohdalla. Yhteenvetona voidaan todeta, että kaikissa tämän kokeen transkriptomeissa 11 287 geeniä R. solani AG3-PT -isolaatti Ben3:n genomin tunnistetuista 12 567 geenistä ilmentyi missään analysoiduista näytteistä.
Kuten taulukosta 1 käy selvästi ilmi, kartoitettujen lukemien kokonaismäärät poikkesivat toisistaan huomattavasti. Tämä johtuu siitä, että Ben3-näytteenotossa sekvensoitiin R. solani AG3-PT -isolaatti Ben3:n puhtaan myseelin transkriptomi, kun taas varhaisessa ja myöhäisessä näytteenotossa (3 ja 8 dpi) käytettiin kaksinkertaista RNAseq-menetelmää, jolla päästiin käsiksi molempien vuorovaikutuksessa olevien organismien transkriptomeihin samanaikaisesti30. Koska kirjastojen koot ja kummastakin kirjastosta tuotettujen sekvenssien määrä olivat vertailukelpoisia, Ben3-näytteenotossa lähes kaikki lukemat voitiin kartoittaa Ben3-isolaatin genomiin. Kaksois-RNAseq-menetelmissä 3 ja 8 dpi:n näytteenotoissa vain murto-osa tuotetuista lukemista voitiin kartoittaa Ben3-genomiin, kun taas muut lukemat kartoittuivat pääasiassa perunan genomiin. Koska R. solani AG3-PT -isolaatin Ben3-genomiin kartoitettujen lukujen kokonaismäärä vaihtelee näytteenottokohtaisesti, on otettava huomioon seuraavat seikat: (1) geenit, joiden RPKM-arvo on alhainen vain Ben3-näytteessä, eivät välttämättä ilmentyisi, kun sieni haastaa kasvin, vaan tämä saattaa johtua vain kirjastojen koosta; (2) geenit, jotka ilmentyvät kaikissa kolmessa näytteenotossa, voidaan katsoa yleisesti ilmentyviksi; (3) geenit, jotka ilmentyvät vain paljon pienemmässä kirjastossa, joka on otettu 3 ja 8 dpi:n näytteenotossa, voidaan olettaa vuorovaikutusspesifisiksi.
Yhteenvedetyt kartoitustulokset (taulukko 1) viittasivat jo siihen, että on oltava monia geenejä, jotka ilmentyvät yleisesti kaikissa kolmessa näytteenotossa. Sen vuoksi muodostettiin Venn-diagrammi, jossa verrattiin kolmea näytteenottoa ja visualisoitiin niiden yhteisten geenien laskennallinen määrä verrattuna niiden geenien määrään, joka erottaa yksittäiset näytteenotot toisistaan (kuva 1). Yli 9 000 geenin havaittiin ilmentyvän kaikissa kolmessa näytteenotossa, kun taas 871 geeniä ilmentyi yksinomaan myseelissä ilman kasvikontaktia. Yhteistä 3 ja 8 dpi:n näytteissä oli 29 geenin ilmentyminen, jotka edustavat geenejä, jotka ilmentyvät vain elävän perunakasvin läsnä ollessa. Lisäksi 3 dpi:n kohdalla 27 geeniä ilmentyi yksinomaan, ja pienelle 21 geenin joukolle kuuluvia sekvenssilukuja oli havaittavissa yksinomaan 8 dpi:n kohdalla. Luettelot näistä geeneistä sekä niiden RPKM-arvot ja kuvaukset ovat lisätaulukoissa 1-4.
Venn-kaavio transkriboituneista geeneistä kolmessa analysoidussa näytteessä. R. solani AG3-PT -isolaatti Ben3:n puhdas myseeli viljeltynä ilman kasvavan perunakasvin vetovoimaa (Ben3); Ben3 vuorovaikutuksessa perunan versojen kanssa 3 dpi:n kohdalla (varhainen); Ben3 vuorovaikutuksessa perunan versojen kanssa 8 dpi:n kohdalla (myöhäinen).
Yhteensä elävän perunakasvin läsnäollessa ekspressoituneista 29:stä geenistä neljä geeniä koodaa kasvin soluseinän hajoamiseen osallistuvia proteiineja. Tämä vastaa nekrotrofisen patogeenin virulenssistrategiaa, jossa soluseinää hajottavia entsyymejä erittyy isäntäsolun nekroosin ja ravinteiden vuotamisen aikaansaamiseksi21. Lisäksi yksi geeni, joka koodaa proteiinien hajottamiseen osallistuvaa proteiinia, tukee tätä hyökkäyslinjaa. Lisäksi kaksi geeniä, jotka koodaavat proteiineja, joilla on DNA:ta sitovia domeeneja ja jotka oletettavasti toimivat transkriptionaalisessa säätelyssä, ovat myös tässä luettelossa, ja niillä on todennäköisesti merkitystä hyökkäyksen transkriptionaalisessa säätelyssä (esim. Ben3g4553, ks. taulukko 2). Suurin osa 27 geenistä, jotka ilmentyvät yksinomaan 3 dpi:ssä, koodaavat hypoteettisia proteiineja, joille ei voida osoittaa oletettua tehtävää. Niistä 21 geenistä, jotka ilmentyivät yksinomaan vuorovaikutuksen myöhemmissä vaiheissa (8 dpi), kahdeksan geeniä koodaa proteiineja, jotka osallistuvat kasvin soluseinän hajoamiseen, ja kaksi koodaa proteaaseja. Tämä osoittaa jälleen kerran nekrotrofiselle patogeenille tyypillisen strategian.
Yhteenvetona voidaan todeta, että kolmen näytteenoton transkriptomidatan ensimmäinen tarkastelu paljasti selviä ja kohtuullisia eroja, mikä osoittaa tämän tutkimuksen potentiaalin löytää vuorovaikutuksen syntymiselle tärkeät tekijät välillä R. solani AG3-PT -isolaatti Ben 3:n ja herkän perunalajikkeen välisen vuorovaikutuksen ja vuorovaikutuksen etenemisen kannalta tärkeitä tekijöitä.
Runsaslukuisimmat R. solani AG3-PT:n transkriptit kolmessa näytteenotossa
R. solani AG3-PT -isolaatti Ben 3:n ja keskikestävän perunalajikkeen ’Arkula’ välistä vuorovaikutusta arvioitiin aluksi tarkastelemalla kolmessa näytteenotossa esiintyviä runsaslukuisimpia transkriptejä. Nesteviljelyssä viljellystä kasvavasta sienirihmastosta löydettiin isolaatti Ben3:n genomin 11 206 geenin transkriptejä. Näistä geeneistä havaittiin yhteensä 698 transkriptiä, joiden RPKM-arvojen mediaani oli vähintään 100 ja 37:n RPKM-arvojen mediaani oli yli 1 000. Varhaisessa vuorovaikutusvaiheessa (3 dpi) mukuloiden versojen ja taudinaiheuttajan välillä havaittiin 10 181 geenin transkriptejä, joista 729:n RPKM-arvon mediaani oli 100 tai suurempi ja 25:n RPKM-arvon mediaani oli suurempi kuin 1 000. R. solani AG3-PT:n 9 939 geeniä transkriboitiin, ja 742 geenin RPKM-arvojen mediaani oli 100 tai suurempi ja 26 RPKM-arvojen mediaani oli suurempi kuin 1 000 8 dpi:n kohdalla (täydentävät taulukot 5-7). Kaikkiaan 9 679 geeniä isolaatti Ben3:n genomista havaittiin ilmentyvän kaikissa kolmessa näytteenotossa, ja niiden joukossa ovat runsaimmat transkriptiot jokaisessa analysoidussa yksittäisessä näytteenotossa. Viisi näistä eniten ekspressoituneista geeneistä (Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326 ja Ben3g675) koodaa R. solani -spesifisiä hypoteettisia proteiineja, joiden toimintaa ei tunneta. Näin ollen näillä proteiineilla ei odotettu olevan erityisiä tehtäviä vuorovaikutuksessa kasvin kanssa, vaan ne saattavat pikemminkin olla tärkeitä yleisen kasvun ja solujen aineenvaihdunnan kannalta. Kussakin yksittäisessä näytteenotossa runsaimpien transkriptien joukossa on myös useita proteiineja, jotka sisältävät lektiinidomeeneja (Ben3g9146, Ben3g9350 ja Ben3g8869). Useat tällaiset proteiinit, jotka sisältävät risiinityyppisen beta-trefoil-lektiinidomeenin, on myös aiemmin raportoitu R. solani AG1-IB -isolaatin 7/3/14 runsaimmiksi R. solani AG1-IB -isolaatissa vuorovaikutuksen aikana isäntäkasvinsa salaatin kanssa30. Vaikka näiden lektiinidomeeniproteiinien erityisiä tehtäviä ei ole määritetty, on ehdotettu, että R. solani -lektiinit voisivat toimia varastoproteiineina sienirihmastossa37. Lisäksi kaksi geeniä, jotka koodaavat thuringiensis-toksiinidomeenin omaavia proteiineja (Ben3g8806 ja Ben3g11931), transkriboituivat voimakkaasti kaikissa kolmessa analysoidussa näytteessä. Bacillus thuringiensis -toksiinit ovat bakteeriproteiineja, jotka tunnetaan niiden biosidisesta aktiivisuudesta hyönteisiä vastaan38 , mutta niiden kohteena ovat myös monet muut organismit39. Tällaisten toksiinidomeenin homologien voimakas ilmentyminen R. solani -bakteerissa osoittaa, että näillä toksiineilla voi olla yleistä merkitystä R. solani AG3-PT -isolaatille Ben3 sen sijaan, että niillä olisi erityinen rooli sieni-kasvi-vuorovaikutuksessa. Geeni, joka koodaa septal pore cap -proteiinia (Ben3g7115), oli myös runsaimpien transkriptien joukossa kaikissa kolmessa näytteenotossa, mikä viittaa sen osuuteen basidiomykeettisten sienten hyfaalisessa homeostaasissa40. Septal pore cap -proteiinia muistuttava transkripti (RSOLAG1IB_6054) oli myös erittäin runsas R. solani AG1-IB -isolaatin 7/3/14 transkripteissa, joita löydettiin oireettomalta vyöhykkeeltä vuorovaikutuksessa salaatin kanssa30. Tämä R. solani -lajille spesifinen proteiini on osa tulppamateriaalia, joka sulkee hyfaalisolujen väliseinän huokoskorkin reiät ja estää sytoplasmanesteiden kulkeutumisen naapurisolujen välillä. Lisäksi hemopeksiinidomeeniproteiinia koodaava geeni (Ben3g6614) oli myös korkeimmin ilmentyneiden geenien joukossa, mikä oli yhteistä kaikille kolmelle näytteenotolle. Tämä domeeni tarkoittaa sinkki-riippuvaisia metalloproteinaaseja, joilla on laajalti tunnustettu olevan tärkeä rooli solunulkoisen ympäristön homeostaattisessa säätelyssä41 , mutta niiden biologiset tehtävät voivat ulottua myös solunulkoisen matriisin hajottamisen ulkopuolelle42. Koska kaikkia näitä proteiineja esiintyi runsaasti R. solani AG3-PT:ssä sekä kosketuksessa isäntäkasviin että ilman kosketusta isäntäkasviin, ne voivat olla tärkeitä yleisen kasvun ja aineenvaihdunnan kannalta, mutta niillä ei näytä olevan erityistä merkitystä sienen ja kasvin välisessä vuorovaikutuksessa.
Vuorovaikutus R. solani AG3-PT:n ja isäntäkasvin välillä. solani AG3-PT:n ja perunan välinen vuorovaikutus
Jotta löydettäisiin elementtejä, joilla on merkitystä R. solani AG3-PT -isolaatin Ben3:n ja perunan verson välisen vuorovaikutuksen tukemisessa, suoritettiin differentiaalinen geeniekspressio, joka on integroitu ReadXplorer-alustaan (v2.2)43. Tämä pareittainen vertailu isolaatti Ben3:n puhtaan myseelin transkriptomeista transkriptomeihin joko 3 dpi:n tai 8 dpi:n vuorovaikutuksesta perunan versojen kanssa suoritettiin DESeq2-ohjelmalla. Geenit luokiteltiin differentiaalisesti ilmentyneiksi, kun korjattu P-arvo oli alle 0,05 ja vähintään 2-kertainen muutos. Näillä kriteereillä 592 geeniä voitiin määritellä eri tavoin indusoituneiksi 3 dpi:ssä (242 geeniä, jotka indusoituvat yksinomaan varhaisessa vaiheessa, ja 350 geeniä, jotka indusoituvat 3 dpi:ssä ja myös 8 dpi:ssä; early up), kun taas 520 geeniä on vähentynyt 3 dpi:ssä (412 geeniä, jotka vähenevät yksinomaan varhaisessa vaiheessa, ja 108 geeniä, jotka vähenevät 3 dpi:ssä ja myös 8 dpi:ssä; early down). Kahdeksan dpi:n kohdalla 688 transkriptiä todettiin eri tavoin indusoituneiksi (338 yksinomaan myöhään indusoitunutta geeniä ja 350 indusoitunutta geeniä kahdeksan dpi:n kohdalla ja myös kolmen dpi:n kohdalla; myöhään ylöspäin) ja 233 geeniä eri tavoin redusoituneiksi (125 yksinomaan myöhään redusoitunutta geeniä ja 108 myöhään redusoitunutta geeniä kahdeksan dpi:n kohdalla ja myös kolmen dpi:n kohdalla; myöhään alaspäin suuntautuva redusoitunut geenien summa). Venn-diagrammit rakennettiin vertailemaan ja havainnollistamaan eri tavoin ylös- ja alasreguloituja geenejä molempina ajankohtina vuorovaikutuksen aikana (kuva 2). Luettelot näistä geeneistä yhdessä niiden taitekertaisen muutoksen arvojen kanssa on esitetty lisätaulukoissa 8-9.
Venn-diagrammit näytteenottokertojen välillä eri tavoin ilmentyneistä geeneistä. R. solani AG3-PT -isolaatti Ben3:n puhdas myseeli viljeltynä ilman kasvavan perunakasvin houkuttelemaa (Ben3) verrattuna Ben3:een vuorovaikutuksessa perunan versojen kanssa 3 dpi:n kohdalla (aikainen); Ben3:n puhdas myseeli verrattuna Ben3:een vuorovaikutuksessa perunan versojen kanssa 8 dpi:n kohdalla (myöhäinen).
Tässä DESeq2-analyysissä havaitut ekspressioerot validoitiin kokeissa, joissa käytettiin qRT-PCR:ää. Siksi on määritettävä sopiva kontrolligeeni, jonka ilmentymismalli on muuttumaton. Glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi (Ben3g7151, GAPDH), ubikitiinikonjugaatioentsyymi E2 (EUC63156, UBC), ubikitiini-proteiiniligaasi E3 (Ben3g494, UBI), elongaatiotekijä 2 (Ben3g3364, EF-2) ja beeta-tubuliinigeenit (Ben3g4099; TUB1) ja (Ben3g5288, TUB2) testattiin, ja beeta-tubuliinigeeni Ben3g5288 (TUB2) osoittautui sopivimmaksi referenssiksi kokeissamme. Kolmen ehdokasgeenin, joilla oli erilaiset ilmentymismallit, suhteelliset transkriptiotasot normalisoitiin tämän muuttumattoman kontrollin ilmentymisen perusteella. ΔΔCq-arvot laskettiin ja niitä verrattiin vastaavaan DESeq2-analyysiin (taulukko 2).
Kaikkien kolmen kandidaattigeenin, joilla oli hyvin erilainen ilmentymismalli, lasketut ΔΔCq-arvot vastasivat DESeq2-analyysissä laskettuja log2-kertaisia muutosarvoja, mikä osoittaa ilmentymiserojen validoitumisen.
Lisäksi suoritettiin geeni-ontologian (GO) annotaatioita vastaavien funktioiden määrittelemiseksi tietyille geeneille. Jatkoanalyysissä keskityttiin erityisesti merkittävästi indusoituneisiin geeneihin, jotta saataisiin ensisijaisesti kiinni molekyylikandidaatteja, jotka saattavat olla tärkeitä vuorovaikutuksen käynnistämisessä ja vakiinnuttamisessa kasvin kanssa.
Differentiaalisesti ilmentyneet geenit (DEG:t) isolaatti Ben3:ssa perunan versojen kanssa vuorovaikutuksessa 3 dpi:ssä
Differentiaalisesti indusoituneet geenit isolaatti Ben3:ssa vuorovaikutuksessa perunan versojen kanssa vuorovaikutuksessa 3 dpi:ssä verrattuna isolaatin puhtaaseen myseeliin valittiin olettaen, että niillä on toimintoja vuorovaikutusprosessin käynnistämisessä ja tukemisessa perunan versojen kanssa. Tiettyjen geenituotteiden oletetut toiminnot ja niiden jakautuminen biologisen prosessin (BP), molekyylitoiminnon (MF) ja solukomponentin (CC) yhteisiin GO-aspekteihin on esitetty kuvassa 3.
Kuva 3
GO- termien jakauma biologiseen prosessiin (BP), molekyylitoimintoon (MF) ja solukomponenttiin (CC) 3 dpi:ssä lisääntyneille geeneille eriytyy. R. solani AG3-PT -isolaatti Ben3:n puhdas myseeli viljeltynä ilman kasvavan perunakasvin vetovoimaa (Ben3) verrattuna Ben3:een vuorovaikutuksessa perunan versojen kanssa 3 dpi:n kohdalla (varhainen).
3 dpi:n kohdalla differentiaalisesti indusoituneet geenit osoitetaan pääosin osallistuviksi hiilihydraattien ja typpiyhdisteiden solun sisäisiin aineenvaihduntaprosesseihin ja kuljetukseen. Lähes 10 prosenttia (50 geeniä) eri tavoin ylössäätyneistä geeneistä koodaa erilaisia peptidaaseja (esim. Ben3g2070, ks. taulukko 2), kun taas 53 geeniä koodaa soluseinää hajottavia entsyymejä, mukaan luettuina useat erilaiset hydrolaasit, jotka vaikuttavat glykosyylisidoksiin, sekä pektaattilyaaseja (esim. Ben3g3530, ks. taulukko 2) tai ksylanaaseja. Näiden soluseinää hajottavien entsyymien tarkemmaksi määrittelemiseksi kaikki DEG:t annotoitiin myös Carbohydrate Active enZyme (CAZy) -tietokannan mukaisesti (lisätaulukko 11). R. solanin kaltaisten nekrotrofisten kasvipatogeenien, kuten R. solani, on erittävä vuorovaikutuksen aikana suuri joukko hydrolyyttisiä entsyymejä, kuten proteaaseja ja soluseinää hajottavia entsyymejä44,45 , jotta ne voivat aiheuttaa solunekroosin hajottamalla kasvin soluseinän rakenteellisia proteiini- ja hiilihydraattikomponentteja ja aiheuttamalla ravintoaineiden vuotamisen9,30,46,47. Näin ollen oletetaan, että indusoidut soluseinää hajottavat entsyymit ja useat indusoidut peptidaasit tukevat R. solani AG3-PT:n vuorovaikutusta perunan verson kudoksen kanssa. Erittyviä peptidaaseja on kuitenkin tutkittu laajasti myös niiden roolista gramnegatiivisten bakteerien48 ja myös sienten47,49 vaikuttajina. Patogeenivaikuttajat kulkeutuvat yleensä virulenssitekijöinä isäntäsoluihin tukahduttamaan peruspuolustusreaktiot ja luomaan sopivan ympäristön patogeenin leviämiselle50,51,52. Näin ollen isäntäproteiinien translaation jälkeinen muokkaus proteolyyttisen prosessoinnin avulla on laajalti käytetty mekanismi kasvien puolustusreaktion säätelyssä. Tämänhetkisen tietämyksen perusteella voidaan olettaa, että yhdellä tai useammalla näistä indusoiduista proteaaseista on oletettu rooli efektoreina, jotka tukevat R. solani AG3-PT:n vuorovaikutusta perunan isännässä. Yksittäisten proteaasien funktionaalisia lisäanalyysejä tarvitaan kuitenkin, jotta niiden funktionaalinen rooli patogeeni-isäntä-vuorovaikutuksessa voidaan selkeästi määrittää.
Toinen suuri ryhmä, joka koostuu 100:sta vuorovaikutuksen 3 dpi:ssä eri tavoin ylössäätyneiden geenien jäsenestä, kuvataan hypoteettisia proteiineja koodaaviksi. Suurin osa näistä geeneistä on R. solani -spesifisiä, ja homologeja löytyi viidestä muusta annotoidusta genomista: R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8 ja R. solani AG1-IA ja AG1-IB. Erilaisen geeniekspressioanalyysimme perusteella voidaan olettaa, että jotkin näistä geeneistä osallistuvat R. solani AG3-PT:n vuorovaikutuksen tukemiseen perunan versolla. On jo tiedossa, että sienipatogeenien erittyvät efektorit kohdistuvat isännän immuniteettiin erilaisilla strategioilla, esimerkiksi hydrolysoimalla salisyylihapon esiastetta53 tai sitoutumalla transkriptiotekijöihin ja estämällä siten niiden toimintaa54. Tarvitaan lisäanalyysejä, jotta saadaan selville toistaiseksi hypoteettisten proteiinien oletetut toiminnot, jotka liittyvät niiden erilaisiin mahdollisiin rooleihin R. solani AG3-PT:n ja perunan vuorovaikutuksessa.
Mielenkiintoista on, että voimakkaimmin differentiaalisesti lisääntynyt geeni (Ben3g6247) homologisoituu lipiditranslokaatioita vieviin (LTE) perheen proteiineihin, kuten Saccharomyces-heimon proteiiniin RTA1. RTA1-proteiini sisältää seitsemän potentiaalista membraanin ylittävää segmenttiä55 , ja sen ennustetaan olevan integraalinen membraaniproteiini, jonka tehtävänä on huolehtia solujen vastustuskyvystä ksenobiootteja vastaan56. Muut LTE-perheen geenit voivat koodata kuljettajia tai antureita, jotka helpottavat biosynteettisten välituotteiden erittymistä joko suoraan tai välillisesti56. Nämä LTE-perheen proteiinien oletetut tehtävät tekevät geenistä Ben3g6247 suosikkiehdokkaan, joka osallistuu patogeenihyökkäyksen kannalta tärkeiden komponenttien eritykseen.
Nekrotrofisen vuorovaikutuksen varhaisvaiheeseen liittyy kasvi-isännän solukuolema ja erilaisten sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden tuotanto sekä reaktiivisten happilajien kertyminen21. On osoitettu, että antioksidanttiset prosessit ja vastaava geeniekspressio korreloivat nekroottisten kudosten kanssa useissa R. solani -patosysteemeissä (perunan verso-R. solani AG3; soijan hypokotyyli-R. solani AG4 ja soijan lehdet-R. solani AG1-IA)27. Perunan isännän ja isolaatin Ben3 vuorovaikutuksen varhaisvaiheessa (3 dpi) ei voitu havaita vahvaa näyttöä antioksidanttisten prosessien induktiosta patogeenihyfeissä transkriptiotasolla, koska glutationi-S-transferaasi-geenien ilmentyminen ei lisääntynyt voimakkaasti eikä muiden reaktiivisten happilaatujen torjuntaan osallistuvien geenien ilmentyminen lisääntynyt. Näin ollen voidaan olettaa, että järjestelmässämme, jossa perunan verso kolonisoidaan R. solani AG3-PT:llä, kudosanalyysi 3 dpi:n kohdalla muistuttaa kasvipatogeenin vuorovaikutuksen varhaista vaihetta, ehkä ennen versokudoksen infektiota. Näkyviä oireita ei havaittu tässä vaiheessa.
Erottelevasti ilmentyvät geenit isolaatti Ben3:ssa 8 dpi:n kohdalla perunan versoissa
Vuorovaikutuksen edistyneessä vaiheessa tärkeiden transkriptien löytämiseksi seulottiin eroavasti indusoituneita geenejä isolaatti Ben3:n puhtaan myseelin ja perunan versoihin 8 dpi:n kohdalla houkutellun Ben3:n välillä. Geenituotteiden vastaavat toiminnalliset merkinnät ja niiden jakautuminen yhteisiin GO-ominaisuuksiin esitetään kuvassa 4. 8 dpi:n kohdalla eri tavoin indusoituneet geenit liittyvät pääasiassa hiilihydraattien ja makromolekyylien aineenvaihduntaprosesseihin ja kuljetukseen. Tässä vuorovaikutuksen myöhemmässä vaiheessa ylösreguloituneet 152 geeniä (> 22 %) koodaavat erilaisia soluseinää hajottavia entsyymejä (esim. Ben3g3530, ks. taulukko 2). Lisäksi kaikki DEG:t annotoitiin myös Carbohydrate Active enZyme (CAZy) -tietokannan mukaisesti (lisätaulukko 11). Soluseinän hydrolyyttisiä entsyymejä koodaavien geenien lisääntynyt ilmentyminen osoittaa hienosti Ben3-isolaatin lisääntyvää patogeenistä aktiivisuutta sekä soluseinän komponenttien hajottamisen tärkeyttä ravintoaineiden saamiseksi vuorovaikutuksen aikana, mikä vahvistaa kuvatun nekrotrofisen patogeenin virulenssistrategian21,57. Tähän tuhoamistaktiikkaan liittyi kalvojen olennaisia komponentteja koodaavien geenien ilmentymisen induktio. Nämä 154 enimmäkseen karakterisoimatonta integraalista kalvoproteiinia ja oletettuja transportereita osallistuivat oletettavasti ravinteiden ja hydrolaasitoiminnan hajoamistuotteiden ottoon. Vuorovaikutuksen tässä vaiheessa peptidaaseja koodaavien geenien hallitseva merkitys näytti vähenevän, mutta silti 33 peptidaaseja koodaavaa geeniä oli eri tavoin ylössäätynyt (esim. Ben3g2070, ks. taulukko 2). Tämä voisi selittyä myös sillä, että kokonaiset versot kerättiin, mukaan lukien versot, jotka olivat olleet vuorovaikutuksessa haastavan taudinaiheuttajan kanssa jopa 8 päivää, ja myöhemmin syntyneet versot, joiden vuorovaikutusjakso oli lyhyempi. Yleisesti ottaen tämä näkyy myös siinä 350 geenissä, jotka olivat yhteisesti differentiaalisesti lisääntyneet 3 ja 8 dpi:n kohdalla (Kuva 2).
GO termi jakautuminen differentiaalisesti lisääntyneiden geenien biologisen prosessin (BP), molekulaarisen toiminnon (MF) ja solukomponentin (CC) osalta 8 dpi:n kohdalla. R. solani AG3-PT -isolaatti Ben3:n puhdas myseeli viljeltynä ilman kasvavan perunakasvin vetovoimaa (Ben3) verrattuna Ben3:een vuorovaikutuksessa perunan versojen kanssa 8 dpi:n kohdalla (myöhäinen).
Lisäksi toinen suuri ryhmä DEG:itä 8 dpi:n kohdalla koostuu 98 geenistä, joilla on tuntematon tehtävä. Koska nämä geenit ovat Rhizoctonia-spesifisiä, eikä niillä ole yhtään samankaltaisuusaluetta sellaisten sekvenssien kanssa, joilla on määritettyjä toimintoja, niiden roolista patogeenin ja kasvin vuorovaikutuksen tukemisessa voidaan vain spekuloida. Näiden geenien funktionaaliset lisävertailut ja esimerkiksi niiden erilainen ilmentyminen kyseisissä patosysteemeissä saattaisivat antaa viitteitä niiden oletetusta tehtävästä.
Tässä kuvatussa koejärjestelmässä, jossa perunan verso kolonisoidaan R. solani AG3-PT -isolaatilla Ben3, vauriot näkyvät ensimmäisen kerran 8 dpi:ssä. Muissa kokeissa25,27 on osoitettu, että nekrotrofinen vuorovaikutus ja solukuolema kasvi-isännässä korreloivat vastaavien geenien ilmentymisen kanssa kasvissa ja sienessä. Samsatly ja työtoverit27 osoittivat kvantitatiivisen RT-PCR:n avulla, että glutationi-S-transferaasia ja katalaasia koodaavien antioksidanttigeenien ilmentyminen lisääntyi merkittävästi R. solani AG3:ssa viisi päivää irronneiden perunanversojen inokulaation jälkeen. Näin voimakkaasti lisääntynyttä näiden antioksidanttigeenien ilmentymistä ei kuitenkaan havaittu tässä kuvatuissa kokeissa. Syyt näihin eroihin voivat johtua siitä, että inokuloinnissa käytettiin R. solani AG3:n isolaatteja, joilla on eroja patogeenisyydessä. Toinen ero on kuitenkin se, että Samsatly ja työtoverit27 tekivät kokeita irrallisilla versoilla rajoitetussa in vitro -järjestelmässä, kun taas meidän koejärjestelymme vastaa täysin in vivo -ympäristön olosuhteita, kun versoja kasvatetaan viljellyissä siemenmukuloissa. Jatkotutkimukset yhdessä samanaikaisen transkriptomianalyysin kanssa perunan isännässä lisäävät lopulta ymmärrystä vastavuoroisesta suhteesta isäntäpatogeenin vuorovaikutuksessa ympäristössä, joka muistuttaa luonnollista tilannetta.
erilaisesti ilmentyvät geenit isolaatissa Ben3, kun verrataan perunan versoja 3 ja 8 dpi:n välillä
Erotaaksemme R. solani AG3-PT:n transkriptien, jotka olivat pääasiassa merkityksellisiä varhaisessa aikapisteessä, ja niiden, jotka tulevat tärkeämmiksi vuorovaikutuksen pitkälle edenneissä vaiheissa, eroteltiin DESeq2:lla myös differentiaalisesti ilmentyneitä geenejä vuorovaikutuksen 3 ja 8 dpi:n välillä. Käyttämällä edellä mainittuja kriteerejä, joiden mukautetut P-arvot olivat alle 0,05 ja vähintään 2-kertainen muutos vähintään 173 geeniä voitiin määritellä differentiaalisesti vähentyneeksi ilmentymäksi 3 ja 8 dpi:n välisenä aikana, kun taas 400 geeniä oli differentiaalisesti lisääntynyt ilmentymä myöhemmässä ajankohdassa. Täydelliset luettelot näistä geeneistä sekä niiden baseMean- ja fold-muutosarvot on esitetty lisätaulukossa 10. Taulukoissa 3 ja 8 dpi:n välisenä aikana eniten eroavasti ilmentyneiden 20 geenin luettelot on esitetty taulukoissa 3 ja 4. Kun 20:stä eniten erilaista ilmentymää vähentäneestä geenistä 10 koodaa proteiineja, jotka osallistuvat proteiinien hajoamiseen sekä typen ottoon ja assimilaatioon (taulukko 3), suurin osa geeneistä, joiden ilmentymää on lisätty erilaista ilmentymää 3 ja 8 dpi:n välisenä aikana, osallistuu polysakkaridien hajoamiseen keskittyen kupari-riippuvaisiin lyytisiin polysakkaridi-monooksygenaaseihin, jotka pilkkovat selluloosaketjuja hapettamalla eri hiilareita (taulukko 4).
Tiedetään, että typpiaineenvaihdunnalla ja typen säätelemällä geenien ilmentymisellä kasvipatogeenisissä sienissä on suuri merkitys taudin vakiintumiselle isäntäkasvissa58. Nitraatti on kuitenkin ammoniumiin ja L-glutamiiniin verrattuna vähemmän suosittu typpilähde sienien ravinnekäytön kannalta ainakin lehtien infektion aikana59. Sienissä tätä ensisijaista ravinnekäyttöä säädellään typpimetaboliittien repression avulla ja varmistetaan ammoniumia ja ureaa aktiivista permeaasia koodaavien geenien transkriptio. Ammoniumia ja typpiyhdisteitä kuljettavia permeaaseja koodaavien geenien (Ben3g6147, Ben3g6767, Ben3g4369 ja Ben3g7775) voimakkaan ohimenevän ilmentymisen lisäksi R. solani AG3-PT -isolaatti Ben3 indusoi ja ilmentyi voimakkaasti myös nitraatin ottoon ja assimilaatioon osallistuvien geenien (Ben3g6360, Ben3g6359 ja Ben3g6361). Tarvitaan lisätutkimuksia siitä, onko tämä Ben3-isolaatin erityispiirre vai maaperän kasvipatogeenisille sienille ominainen piirre.
Vähemmistö geeneistä, joiden ilmentyminen lisääntyi eri tavoin 3 ja 8 dpi:n välisenä aikana, osallistuvat soluseinän hajotukseen ja koodaavat glykosyylisidoksiin vaikuttavia hydrolaaseja ja pektaattilyaaseja. Tämä oli odotettavissa ja osoittaa jälleen kerran soluseinän komponenttien hajottamisen kasvavan merkityksen nekrotrofisen patogeenin virulenssistrategian määrittelyssä21.
.