Mikrobiologia ja kokeet

Tässä tutkimuksessa eristettiin ja karakterisoitiin bakteerikantoja Barrackporen kunnasta ja Dhapan kaatopaikalta. Bakteerien kasvu riippuu erilaisista fysikaalis-kemiallisista olosuhteista, kuten väliaineesta, pH:sta, lämpötilasta, inkubaatioajasta, hiililähteestä jne. Niinpä erilaisia olosuhteita, joissa bakteerit kasvoivat luonnollisessa elinympäristössä, olisi tutkittava ennen massiivista lisääntymistä, jotta niitä voitaisiin käyttää hajottajina. Näin ollen otettiin huomioon seuraavat parametrit:

Kiinteän yhdyskuntajätteen fyysiset ja kemialliset ominaisuudet

Bakteerit voivat kasvaa laajalla kosteusalueella. Tässä tutkimuksessa todettiin, että Barrackporen kunnasta ja Dhapan kaatopaikalta kerätyn näytteen kosteuspitoisuus oli noin 65,32 % ja 66,45 %. Eri maaperien bakteeripopulaatio korreloi läheisesti niiden kosteuspitoisuuden kanssa. Suurin bakteeritiheys esiintyy alueilla, joiden kosteuspitoisuus on melko korkea, ja aerobisten bakteerien toiminnan kannalta optimaalinen taso on usein 50-75 prosenttia maaperän kosteudensitomiskyvystä.1 Pseudomonas-, Achromobacter- ja Bacillus-sukuja esiintyy useimmissa aerobisissa maaperissä; kun olosuhteet ovat anaerobiset ja kosteat, esiintyy Clostridium-sukuja. Aktinomykeetit osoittivat samanlaista määrällistä kasvua tällaisissa olosuhteissa.15

Tässä tutkimuksessa kahden valitun väliaineen (BCDA ja NA) pH optimoitiin bakteerikantojen viljelyä varten. Kerätyn näytteen ph oli molemmissa näytteissä 7,79. ph on keskeinen tekijä bakteerien kasvattamisessa keinotekoisissa väliaineissa. pH:n optimointi suoritettiin kahdessa valitussa väliaineessa eli Nutrient Agarissa (NA) ja Basic czapek dox agarissa (BCDA). NA:n ja BCDA:n pH-arvojen 7,2 ja 7,6 todettiin olevan sopivia bakteerikantojen maksimaaliseen kasvuun. Tuloksista kävi ilmi, että näytteen pH oli noin 7,79 ja mahdollisesti tästä syystä näiden kantojen todettiin myös kasvavan hyvin in vitro -olosuhteissa pH:ssa 7-8 BCDA:ssa ja NA:ssa. Bakteerit voivat sietää maaperän reaktiota pH-tasojen 4 ja 10 välillä, mutta suurimmalle osalle suotuisin pH on juuri emäksisen puolella neutraaliutta. Bakteerit, kuten Thiobacillus thiooxidans ja Acetobacter sp., pystyvät kasvamaan hyvin alhaisissa pH-arvoissa pH-tasojen 0 ja 2 välillä, ja jotkin Bacillus sp. voivat kasvaa pH:ssa 11. Tämä ei ole mahdollista.15 Thermoactinomycetesin optimaalinen kasvu tapahtuu pH:ssa 8 tai 9, ja noin pH:n 516 suuruiset reaktiot heikentävät sitä huomattavasti Vibrio, Streptococcus faecalis ja Escherichia coli sietävät myös emäksistä reaktiota (pH 8-9).16

Aluksi tutkittiin näytteen NPK-pitoisuus. Orgaanisen aineksen pitoisuuden todettiin olevan 27,84 % (Barrackporen kunta) ja 29,32 % (Dhapa), typpipitoisuuden prosentteina 0,165 (Barrackporen kunta) ja 0,179 (Dhapa), fosforipitoisuuden prosentteina 0,502 (Barrackporen kunta) ja 0,545 (Dhapa) ja kaliumpitoisuuden prosentteina 18,29 (Barrackporen kunta) ja 19,21 (Dhapa). Kaikki nämä analyysit antoivat selkeän käsityksen bakteerien alkuperäisestä ympäristöstä ja olivat siten määrääviä tekijöitä kantojen eristämisessä ja viljelyssä.

Bakteeri-isolaattien viljelyominaisuudet

Tutkimuksessamme BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 ja C3 – nämä yhdeksän bakteerikantaa eristettiin viljelyalustoista. Czapek dox agar ja Nutrient agar valittiin, jotta voitiin määrittää parhaiten soveltuvat väliaineet eristettyjen kantojen massiivisen kasvun varmistamiseksi. czapek dox agar (BCDA) soveltui BM3:n, D1,C2:n massiiviseen kasvuun ja Nutrient agar (NA) -alusta soveltui BM1:n, BM2:n, D2:n, D3:n, D4:n ja C3:n massiiviseen kasvuun. Nähtiin, että hiivauutetta ja ksylaania sisältävä väliaine soveltui bakteerien maksimaaliseen kasvuun, mutta Pseudomonas sp., Bacillus spp. ja Aeromonas sp. kasvavat hyvin ravintoagarissa. Valittujen kantojen karakterisoinnissa käytettiin visuaalista ja mikroskooppista havainnointia. Bakteerien pesäkkeiden ominaisuudet on merkitty yksityiskohtaisesti (taulukko 1). Gram-värjäys on vanha ja luotettava menetelmä bakteerien havainnointiin. Gramnegatiiviset bakteerit värjäytyivät alkoholilla, jolloin ne menettivät kristallivioletin violetin värin. Grampositiiviset bakteerit eivät värjäytyneet ja pysyivät violetteina.

Tässä tutkimuksessa, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 ja C3 – nämä 9 bakteerikantaa eristettiin ja mikrobiologinen karakterisointi suoritettiin. Tulokset osoittivat, että BM1, BM3, D1 ovat grampositiivisia bakteereita, BM2 grampositiivisia lyhyitä bakteereita, D2 grampositiivisia diplobakteereita, D3, C2 gramnegatiivisia bakteereita, D4 gramnegatiivisia lyhyitä bakteereita ja C3 grampositiivisia kokkibakteereita. Yhdeksälle isolaatille tehtiin myös erilaisia biokemiallisia testejä niiden biokemiallisten ominaisuuksien selvittämiseksi. Yksityiskohtaiset tiedot bakteerien biokemiallisista ominaisuuksista on esitetty taulukossa 2.

Yllä olevat tulokset antoivat käsityksen eristettyjen kantojen morfologiasta, pesäkkeiden ominaisuuksista ja biokemiallisesta luonteesta, mikä auttaisi eristettyjen bakteerikantojen tunnistamisessa ja luonnehdinnassa tulevaisuudessa.

Kasvuolosuhteiden optimointi

Tässä tutkimuksessa havaittiin eristettyjen kantojen kasvua erilaisissa kasvualustoissa, kuten NA, ACDA ja BCDA. Nähtiin, että basic czapek dox agar (BCDA) soveltui BM3:n, D1:n ja C2:n massiiviseen kasvuun ja Nutrient agar (NA) -alusta soveltui BM1:n, BM2:n, D2:n, D3:n, D4:n ja C3:n massiiviseen kasvuun.

Tässä kokeessa yhdeksän kannan bakteeriviljelmiä inkuboitiin eri lämpötiloissa, kuten 25-, 29-, 34-, 37- ja 40 °C:ssa. Kaikkien kantojen optimaalinen kasvu havaittiin 37 °C:ssa. Bakteerien optimaalinen lämpötila-alue on noin 25-36 °C. Suuri osa bakteereista voi kasvaa melko hyvin yli 10-4 °C:n lämpötilassa.6 Sultana17 havaitsi, että 33 ± 4 °C:n lämpötila oli ihanteellinen bakteerien kasvulle.17 Tietyt bakteerit kehittyvät voimakkaimmin alle 20 °C:n lämpötiloissa. Termofiilit kasvavat hyvin 45-65 °C:n lämpötiloissa, ja jotkut termofiilit eivät kykene lisääntymään alle 40 °C:n lämpötiloissa.1

Tässä tutkimuksessa saatuja kantoja inkuboitiin eri inkubaatioaikoja (6, 12, 24, 36, 48 ja 72 tuntia). Inkubaatioaika 24 tuntia oli sopiva BM1:lle, BM2:lle, D2:lle, D3:lle, D4:lle ja C3:lle, kun taas BM3:n, D1:n ja C2:n todettiin olevan sopiva 36 tunnin inkubaatioajalla. Koliformiset bakteerit kasvavat inkubaatioajalla 24 ± 2 tuntia 32 °C:n lämpötilassa, ja ne kasvavat hyvin 37 °C:n lämpötilassa 48 tunnin inkubaation ajan. Silmämääräisessä havainnoinnissa havaittiin, että 24 tunnin inkuboinnin jälkeen BM2:n väri oli vaalean oranssi, BM1:n valkoinen ja BM3:n kermanvalkoinen niiden suosimassa väliaineessa (BCDA ja NA). 48-72 tunnin inkuboinnin jälkeen BM2:n väri oli oranssi, BM1, D1 keltainen, C2 punainen ja BM3, D2, D3, D4, C3 kermanvalkoinen. BM1-, BM2-, D2- ja D4-kantojen pesäketyypit olivat märkiä ja loput kermanvärisiä. Stafylokokit ja mikrokokit tuottavat kullanruskeita, keltaisia tai valkoisia pesäkkeitä tavallisilla väliaineilla. Jotkin enterokokit, coryneformit ja enterobakteerit voivat tuottaa mustia pesäkkeitä tavallisilla väliaineilla.8

Antagonismimääritys

Bakteerikantojen välisen antagonismin määrittämiseksi käytettiin ristiraidoitusmenetelmää, jotta niitä voitaisiin tulevaisuudessa käyttää eri näkökohdissa. Bakteeri-isolaattien antagonismin yksityiskohdat on kuvattu (taulukko 3).

BM2:lla on antagonismia kaikkien muiden kantojen kanssa, joten ei ole mahdollista kehittää konsortiota käyttäen tätä kantaa yhtenä isolaattina. D1:llä ja D3:lla on myös antagonismia useimpien muiden kantojen kanssa. BM1 on voimakkain kanta, sillä sillä ei ole antagonismia minkään muun isolaatin kanssa. BM3:lla, D2:lla, D4:llä, D5:llä ja D6:lla on antagonismia muutamien isolaattien kanssa, ja näitä kantoja voidaan yhdessä BM1:n kanssa testata erilaisissa yhdistelmissä konsortion valmistamiseksi.

Raskasmetallien sietokyvyn määritys

Viisi raskasmetallia (As, Zn, Pb, Hg, Cd) valittiin määritettäväksi erillisten bakteerikantojen metallin sietokyvyn määrittämiseksi (BM1, BM2, BM3, DF1, DF2, D2, D3, D4, C2, C3). Sietokykytesti osoitti, että viidestä kokeellisesta raskasmetallista suurin sietokyky oli Pb:n sietokyky, joka osoitti mikro-organismien kasvua 4000 ppm:iin asti, ja pienin sietokyky Cd:n sietokyky, joka ei osoittanut kasvua yli 30 ppm:n. MIC-arvo todettiin, kun isolaatit eivät kasvaneet levyillä edes 10 päivän inkuboinnin jälkeen. Tulokset osoittavat, että kaikkien kolmen bakteerin MIC-arvo vaihteli 250 ja 350 ppm välillä As:n, Cd:n (10-30 ppm), Zn:n (200-300 ppm), Hg:n (200-300 ppm) ja Pb:n (3000-4000 ppm) osalta (taulukko 4). Tässä tutkimuksessa suurin As:n ja Cd:n sietokyky havaittiin BM1:ssä, kun taas suurin Zn:n sietokyky havaittiin BM2:ssa ja BM3:ssa Hg:n ja Pb:n kertyminen oli suurinta. Tutkimuksessamme myrkyllisin metalli (alhaisin MIC-arvo) oli cd, kun taas vähiten myrkyllinen metalli oli Pb (taulukko 4).

MIC todettiin, kun isolaatit eivät kasvaneet levyillä edes 10 päivän inkubaation jälkeen.18 Mergeay et al.19 testasivat useiden eri metallien minimaalisia inhiboivia pitoisuuksia (MIC-pitoisuuksia) ja havaitsivat, että myrkyllisin metalli (pienimmällä MIC-pitoisuudella) oli elohopea, kun taas vähiten myrkyllinen metalli oli mangaani.19 Mikrobien sietokykyä kullakin raskasmetallipitoisuudella kuvattiin kuppitestiä käyttäen. Inhibitiovyöhykkeen halkaisija kunkin kupin ympärillä kasvoi raskasmetallien pitoisuuden kasvaessa, mikä osoittaa raskasmetallien toksista vaikutusta mikro-organismien kasvuun. Barrackporen kunta ja Dhapan kaatopaikka keräävät kaiken kiinteän kotitalous- ja teollisuusjätteen Barrackporen kaupungista, Kolkatan kaupungista ja sen lähialueilta. Kotitalouksista ja teollisuudesta peräisin oleva jäte on sopiva ympäristö, jossa mikro-organismit voivat kehittää vastustuskykyä raskasmetalleja vastaan. Pieni määrä raskasmetalleja kiinteässä jätteessä voi saada aikaan raskasmetalleille vastustuskykyisten mikro-organismien kehittymisen. Mikrobien resistenssi raskasmetalleja vastaan johtuu erilaisista detoksifikaatiomekanismeista, joita resistentit mikro-organismit ovat kehittäneet, kuten kompleksinmuodostus eksopolysakkarideilla, sitoutuminen bakteerisolukuoriin, metallin pelkistyminen, metallien poistuminen jne. Nämä mekanismit on joskus koodattu plasmidigeeneihin, jotka helpottavat myrkyllisten metallien resistenssin siirtämistä solusta toiseen.20 Raskasmetalleille vastustuskykyinen organismi voisi olla potentiaalinen aine raskasmetallien aiheuttaman pilaantumisen biologisessa kunnostuksessa. Koska raskasmetallien myrkyllisyysmekanismit ovat kaikki samankaltaisia, useiden metallien sietokyky on yleinen ilmiö raskasmetalleille resistenttien bakteerien keskuudessa.21

Antibioottiherkkyysmääritys

Antibioottiherkkyysmääritys auttaa määrittämään, kuinka tehokas antibiootti on testin kohteena olevaa organismia vastaan. Yhdeksästä isolaatista tutkittiin sen herkkyys neljälle antibiootille, ja tulos on merkitty (taulukko 5). Useimmat isolaatit tuottavat antimikrobisia yhdisteitä, jotka voivat palvella lääketiedettä. D1, D3 ja D5 eivät osoittaneet antimikrobista aktiivisuutta.

Antimikrobisen aktiivisuuden määritys

Antimikrobisten yhdisteiden tuottaminen näyttää olevan yleinen ilmiö useimmille bakteereille. Tässä tutkimuksessa 3 isolaattia osoitti antibakteerista aktiivisuutta ja 5 isolaattia antifungaalista aktiivisuutta, mutta 3 isolaattia ei osoittanut antibakteerista eikä antifungaalista aktiivisuutta patogeenejä vastaan. Tulos on esitetty (taulukko 6). Subramaniam et al.22 Subramaniam et al. raportoivat samankaltaisesta tutkimuksesta. Bacillus-suvun jäsenet tuottavat erilaisia antimikrobisia yhdisteitä, joista monet on tunnistettu peptideiksi, lipopeptideiksi ja fenolijohdannaisiksi. Viime vuosina on kiinnitetty entistä enemmän huomiota sellaisten uusien sekundaaristen aineenvaihduntatuotteiden etsimiseen, joilla on monipuolinen biologinen aktiivisuus erilaisissa ympäristöissä.

Extrasellulaarinen entsyymituotanto

Ympäristönsuojelua koskevan tietoisuuden lisääntyessä entsyymien, erityisesti extremofiileistä peräisin olevien entsyymien, käyttö on saanut huomattavaa huomiota monissa teollisissa prosesseissa. Viime vuosina mikrobientsyymit ovat korvanneet kemiallisia katalyyttejä kemikaalien, tekstiilien, lääkkeiden, paperin ja maatalouden elintarvikekemikaalien valmistuksessa. Entsyymipohjaiset teolliset bioprosessit kilpailevat nyt suoraan vakiintuneiden kemikaalipohjaisten prosessien kanssa. Tässä tutkimuksessa yhdeksälle isolaatille tehtiin kvalitatiivinen määritys kahdeksan eri entsyymin, kuten proteaasin, lesitinaasin, DNaasin, lipaasin, sellulaasin, amylaasin, katalaasin ja oksidaasin, tuottamiseksi. Subramani ja Narayanasamy ovat raportoineet samankaltaisesta tutkimuksesta.23 Mielenkiintoista oli, että tutkimuksessamme kuusi niistä tuotti proteaasientsyymiä, jolla on suuri markkina-arvo. Kaikki 9 kantaa tuottivat katalaasi- ja oksidaasientsyymiä. Tulos on merkitty (taulukko 7).

Proteaasimääritys

6 kantaa (BM1, BM3, D1, D3, C2 ja C3) yhdeksästä isolaatista osoittivat proteaasituotantoa. Proteaasia käytetään laajalti elintarviketeollisuudessa, pesuaineteollisuudessa, lääketeollisuudessa ja kiinteän jätteen hajottamisessa, joten tuotetun proteaasin kvantitatiivinen määritys suoritettiin. Näin tuotetun proteaasientsyymin aktiivisuus määritettiin ja tulos ilmaistiin IU/ml. Tulos on esitetty taulukossa 8. Proteaasin kvantitatiivinen määritys osoitti poikkeuksetta, että kuudesta kannasta BM1 tuottaa proteaasia korkealla titteriarvolla ja Gupta et al.,24 raportoivat vastaavalla tavalla emäksisen proteaasin tuotannosta bakteerilajeista ja sen teollisesta käytöstä.

Isoloiduilla bakteereilla

Jätteen hajotuspotentiaali

Proteaasientsyymillä on laaja käyttömahdollisuus jätteen hajotuksessa. Niinpä kuudelle proteaasientsyymiä tuottamaan kykenevälle kannalle tehtiin jätteiden hajotustehokkuustesti. Tutkimuksessamme voidaan havaita, että BM1:llä on korkein hajoamispotentiaali ja seuraavaksi korkein BM3:lla. BM1 on myös voimakas proteaasientsyymin tuottaja, joten sillä on myös parempi hajotuskyky (kuva 1). Kun mikro-organismit (bakteerit) hajottavat jätettä, kuivikkeen paino pienenee. Tässä hajoamistutkimuksessa havaittiin, että käsitellyn jätteen paino väheni, koska bakteerit hajottivat sen ja muuttivat sen yksinkertaisiksi molekyyleiksi. Jätenäytteiden painohäviöprosentti kasvoi hajoamisprosessin edetessä, kuten kuvasta 1 käy ilmi. Samanlaisen havainnon raportoivat Zaved et al. 25, jotka tutkivat tiettyjen bakteerien aiheuttamaa roskien painonhäviötä Bangladeshissa. Tutkimuksessamme voidaan havaita, että BM1:llä oli suurin hajoamispotentiaali. Näin ollen BM1:tä voidaan käyttää tehokkaasti kiinteiden jätteiden bioremediaatioon.