Mikä on yhden molekyylin reaaliaikainen sekvensointi (SMRT)?

Tohtori Maho Yokoyama, Ph.D.Arvostellut Christian Zerfaß, Ph.D.

Siirry osoitteeseen:

• Miten SMRT- sekvensointi toimii?
• Studying DNA Methylation in Bacteria; an Application of SMRT Sequencing

DNA:n sekvensointi toimii käyttämällä DNA-polymeraasia lisäämään nukleotideja malliin. DNA-sekvensointiin on käytettävissä useita tekniikoita. Yksi tällainen on esimerkiksi yhden molekyylin reaaliaikainen sekvensointi eli SMRT-sekvensointi.

Tutkija tutkii DNA-sekvenssin läpinäkyvää diaa. Credit: Shawn Hempel /

Miten SMRT-sekvensointi toimii?

Kuten muissakin DNA-sekvensointitekniikoissa, ensimmäinen vaihe DNA:n uuton jälkeen on ”kirjaston” valmistaminen. Tässä prosessissa DNA valmistellaan sekvensointia varten; tässä tapauksessa kaksoisjuosteisen DNA-molekyylin kumpaankin päähän lisätään adaptaattoreita, jolloin DNA:sta tulee käytännössä yksijuosteinen pyöreä malli. Tämä tarkoittaa, että DNA:ta voidaan sekvensoida yhtäjaksoisesti.

Tämä DNA-kirjasto eli templaatti-DNA laitetaan sitten DNA-sekvensointilaitteeseen, joka sisältää ”nollatilan aaltojohtimia”, joiden toiseen päähän on immobilisoitu DNA-polymeraasi. Yksittäinen DNA-molekyyli immobilisoidaan sitten näihin nollatilan aaltojohtimiin, ja DNA-polymeraasi alkaa lisätä uusia nukleotideja de novo -syntetisoituun DNA-juosteeseen, joka on komplementaarinen templaatti-DNA:n kanssa. Näiden nukleotidien emäkset merkitään, ja näiden emästen liittäminen kasvavaan DNA-juosteeseen aiheuttaa valon emittoitumisen. Valoemissio luetaan sitten reaaliajassa, ja koska kunkin emäksen emissio on erilainen, voidaan tietty emäs tunnistaa.

SMRT-sekvensoinnin tärkein etu on pitkien ja erittäin tarkkojen sekvenssilukujen tuottaminen, mikä parantaa kokonaisten genomien kokoamista. Tämä johtuu siitä, että pidemmät sekvensointilukemat merkitsevät sitä, että genomin kokoamiseen tarvitaan vähemmän ”rakentamista”.

DNA:n metylaation tutkiminen bakteereissa; SMRT-sekvensoinnin sovellus

Mitä on DNA:n metylaatio?

Metyyliryhmän lisäämistä DNA:han eli metylaatiota esiintyy kaikissa elämän valtakunnissa. Bakteereissa esiintyy kolmea metyloitua nukleotidia: m5C (C5-metyylisytosiini, jota esiintyy myös eukaryooteissa), m6A (N6-metyyliadeniini) ja m4C (N4-metyylisytosiini, jota esiintyy vain bakteereissa). Metylaatio tapahtuu uusien DNA-säikeiden synteesin jälkeen, ja se tapahtuu tietyissä nukleotideissa.

Metyyliryhmät työntyvät ulos DNA:n kaksoiskierteestä ja voivat siten vaikuttaa DNA:n ja DNA:ta sitovien proteiinien väliseen sitoutumiseen. Tämä puolestaan vaikuttaa prosesseihin, kuten kromosomien replikaatioon, DNA-virheiden korjaukseen sekä geenien transkription ajoitukseen ja epigeneettisten linjojen muodostumiseen.

Epigeneettiset mekanismit: dna:n metylaatio tai asetylaatio voi aktivoida tai olla aktivoimatta geenin transkriptiota. Image Credit: ellepigrafica /

Miksi DNA:n metylaatio on tärkeää bakteereissa?

Bakteerit ovat virustartunnan saaneita, joten ne tarvitsevat suojamekanismin selvitäkseen virusinfektioista. Tällöin tulevat kyseeseen restriktiomodifikaatiojärjestelmät; tämä järjestelmä koostuu restriktioentsyymistä, joka pilkkoo DNA:ta tietyissä kohdissa, ja DNA-metyylitransferaasista, joka lisää metyyliryhmän adeniiniin (A) tai sytosiiniin (C).

Vähemmistössä restriktiomodifikaatiojärjestelmistä DNA-metyylitransferaasi toimii suojellakseen bakteerin DNA:ta restriktioentsyymiltä. DNA-metyylitransferaasin läsnäolo tarkoittaa, että bakteeri-DNA metyloituu, kun taas infektoiva virus-DNA ei metyloitu. Tämä puolestaan tarkoittaa, että restriktioentsyymi hajottaa virus-DNA:n, kun taas bakteeri-DNA on suojassa, koska restriktioentsyymi ei vaikuta metyloituneeseen DNA:han. On kuitenkin huomattava, että on olemassa restriktioentsyymejä, jotka vaikuttavat muunnettuun DNA:han.

Uudemmat tutkimukset ovat viitanneet siihen, että restriktiomodifikaatiojärjestelmillä voi olla muitakin tehtäviä. Esimerkiksi tiettyjen restriktiomodifikaatiojärjestelmien tyrmääminen johti muutokseen geeniekspressiossa, joka on yhteydessä eroihin DNA-metylaatiossa. Restriktiomodifikaatiojärjestelmät voivat myös aiheuttaa kaksoisjuostekatkoksia ja C-T-mutaatioita ja siten vaikuttaa bakteerien evoluutioon. Viime aikoina on kehitetty tekniikoita, joilla voidaan määrittää koko bakteerigenomin metylaatio, jota kutsutaan ”metyloomiksi”.

Miten metyloomi määritetään SMRT-sekvensoinnilla?

Koska SMRT-sekvensointi antaa reaaliaikaisia tuloksia, sillä voidaan havaita DNA-modifikaatiot, mukaan lukien metylaatiot. DNA-polymeraasi sisällyttää nukleotideja vakionopeudella, mutta tämä nopeus voi muuttua, jos templaatin nukleotidia on muutettu. Tämä voidaan huomata sekvensointiprosessin aikana.

Blow at al. käyttivät SMRT-sekvensointia kartoittaakseen DNA-modifikaatioita 230 mikro-organismissa. He etsivät muun muassa m5C-, m6A- ja m4C-modifikaatioita. Kirjoittajat havaitsivat, että 93 prosentissa näistä mikro-organismeista esiintyi DNA-metylaatiota, ja he löysivät myös 834 motiivia, jotka olivat metyloituneet. Tämän avulla kirjoittajat pystyivät tunnistamaan, mitkä motiivit ovat 620 DNA-metyylitransferaasin kohteita.

Interventoisesti kirjoittajat totesivat, että vaikka 48 prosentilla tutkituista organismeista oli DNA-metyylitransferaasi, ei ollut todisteita myös restriktioentsyymin esiintymisestä. Siksi on mahdollista, että DNA-metylaatiolla on tärkeä rooli genomin säätelyssä tai jokin muu tärkeä rooli mikro-organismeissa, jota ei ole vielä tunnistettu.

Lisälukemista

• All DNA Sequencing Content
• DNA Sequencing
• DNA Sequence Assembly
• DNA microarray
• High-throughput DNA Sequencing Techniques

Kirjoittanut

Tohtori Maho Yokoyama

Tohtori Maho Yokoyama on tutkija ja tiedekirjailija. Hän väitteli tohtoriksi Bathin yliopistossa Yhdistyneessä kuningaskunnassa mikrobiologian alalta, jossa hän sovelsi funktionaalista genomiikkaa Staphylococcus aureukseen. Väitöskirjaopintojensa aikana Maho teki yhteistyötä muiden tutkijoiden kanssa useissa artikkeleissa ja jopa julkaisi joitakin omia töitään vertaisarvioiduissa tieteellisissä lehdissä. Hän myös esitteli työtään akateemisissa konferensseissa ympäri maailmaa.

Sitaatit