MDM2:n estäminen Nutlin-3A:n avulla:

Abstract

Ryhmämme osoitti aiemmin, että E3-ubikitiiniligaasi (MDM2) E3-ubikitiiniligaasin (MDM2) ydinekspressio pahanlaatuisessa pleuraalisessa mesotelioomassa (MPM) liittyy merkitsevästi heikentyneeseen kokonaiselossaoloon. Mahdollinen selitys voi olla, että MDM2:n yliekspressio johtaa TP53:n proteasomaaliseen hajoamiseen, joka lopulta johtaa TP53:n aiheuttaman apoptoosin ja senesenssin häviämiseen. Muista kasvainkokonaisuuksista tiedetään hyvin, että TP53:n aktiivisuuden palauttaminen esimerkiksi MDM2:n estolla johtaa syöpäsolujen välittömään TP53:n aiheuttamaan stressi- ja/tai DNA-vauriovasteeseen. Nutlin-3A (cis-imidatsoliinianalogi) on kuvattu voimakkaaksi ja selektiiviseksi MDM2:n estäjäksi, joka estää MDM2-TP53-vuorovaikutuksen sitoutumalla spesifisesti MDM2:n hydrofobiseen TP53:a sitovaan taskuun. Tässä tutkimuksessa testattiin vertailevasti MDM2:n estämisen vaikutuksia MPM:ssä Nutlin-3A:n ja tavanomaisten platinapohjaisten kemoterapeuttisten aineiden avulla kolmella MPM-solulinjalla (NCI-H2052, MSTO-211H ja NCI-H2452), joilla oli erilaiset TP53:n, MDM2:n ja sen fysiologisen inhibiittorin MDM2-P14/ARF:n ilmentymisprofiilit. MPM-solulinjoilla tekemämme in vitro -kokeet osoittivat, että Nutlin-3A yhdessä sisplatiinin kanssa johti jopa 9,75 kertaa korkeampaan senesenssin induktioon (p=0,0050) ja jopa 5 kertaa korkeampaan apoptoosiin (p=0,0067) verrattuna yleisesti käytettyihin sisplatiini- ja pemetreksedihoitoihin. Näin ollen Nutlin-3A, voimakas MDM2:n estäjä, liittyy merkittävään senesenssin ja apoptoosin induktioon MPM-solulinjoissa, mikä tekee Nutlin-3A:sta lupaavan aineen kohdennetuksi hoidoksi MPM:n alaryhmässä, jossa esiintyy MDM2:n yliekspressiota.

1. Johdanto

Maligni mesoteliooma on erittäin aggressiivinen kasvain, joka syntyy mesoteelin vuoratuilta pinnoilta, useimmiten pleuraonteloista (maligni pleuraalinen mesoteliooma, MPM) . Hoitamattomana potilaiden elossaoloajan mediaani on yhdeksän kuukautta . MPM-potilaat kärsivät kielteisesti nykyisistä enimmäkseen riittämättömistä hoitomuodoista, jotka koostuvat platinaa sisältävistä hoidoista, joissa ensimmäisenä vaihtoehtona käytetään sisplatiinia tai karboplatiinia. Sisplatiinihoito johtaa vain 14 prosentin vasteeseen ja alle seitsemän kuukauden mediaanielinaikaan. Karboplatiinihoito johti samankaltaisiin vasteisiin, jotka vaihtelivat 6-16 prosentin välillä. Kliinisessä käytännössä pemetreksediä, joka on ainoa FDA:n MPM:n hoitoon hyväksymä lääke, käytetään yhdessä platiiniyhdisteiden kanssa.

Monissa tutkimuksissa on osoitettu, että foolihappoaineenvaihdunnan jäsenten intratumoraalisen ilmentymisen arviointi on tehokasta foolihappoaineenvaihdunnan jäsenten foolihappoaineenvaihdunnan jäsenten ilmentymisen arvioinnissa, jotta voidaan ennustaa monikohdistetun foolihappoaineen vastetta potilailla, joilla on eri syöpäkasvainryhmät, mutta niistä keskustellaan ristiriitaisesti . Koska platina-analogit ovat genotoksisia yhdisteitä, jotka aiheuttavat DNA-vaurioita, jotka johtavat TP53:n aiheuttamaan solusyklin pysähtymiseen ja apoptoosiin, on periaatteessa ajateltavissa, että DNA:n korjausmekanismi voisi olla yksi avaintekijä, joka liittyy heikentyneeseen hoitovasteeseen. Koska MPM:ien yhteisten molekyyliominaisuuksien tunnistaminen voi auttaa ratkaisemaan havaitun huonon hoitovasteen, useat tutkimukset käsittelivät tätä kysymystä. Platinayhdisteiden melko heikon tehon syyt ovat kuitenkin edelleen suurelta osin tuntemattomia.

Yhteenvetona voidaan todeta, että toistaiseksi MPM:lle ei ole olemassa luotettavia ennakoivia biomarkkereita eikä yksilöllisiä hoitokonsepteja. Siksi nykyisissä ohjeissa korostetaan innovatiivisten ja uusien hoitomuotojen tarvetta .

Sen vuoksi, että TP53-geenin mutaatiot ovat erittäin harvinaisia MPM:ssä , muut mekanismit, kuten lokuksen deletoituminen tai epigeneettiset muutokset, voivat vaikuttaa TP53:n inaktivoitumiseen . MDM2:n yliekspressio joissakin kasvaintyypeissä voi johtaa TP53:n säätelytoiminnan häviämiseen syöpäsoluissa sen lisääntyneen proteasomaalisen hajoamisen kautta . MDM2:n fysiologinen inhibiittori P14/ARF tunnustetaan kasvainsuppressoriksi, ja se osallistuu tähän mekanismiin indusoimalla solusyklin pysähtymisen sekä TP53-riippuvaisella että TP53-riippumattomalla tavalla. Lisäksi miRNA-säätelyllä näyttää olevan tärkeä rooli . Aiemmissa tutkimuksissa olemme osoittaneet, että noin 25 prosentissa MPM:stä esiintyy voimakasta ydinkudoksen MDM2:n yliekspressiota; tämä havainto rajoittui epitelioidiseen MPM:ään tai kaksivaiheisen MPM:n epitelioidisiin osiin . MDM2-positiivista MPM:ää sairastavilla potilailla kokonaiselossaoloaika (OS) ja etenemisvapaa elossaoloaika (PFS) heikkenivät merkittävästi verrattuna MDM2-negatiiviseen MPM:ään . Tämä saattaa selittyä merkittävästi heikentyneellä tai kokonaan hävinneellä TP53:n aktiivisuudella ja/tai stabiilisuudella, jota MDM2:n yliekspressio välittää .

TP53:n aktiivisuuden palauttaminen esimerkiksi MDM2:n estolla saattaa johtaa siihen, että TP53:n indusoima stressi- ja/tai DNA-vauriovaste syöpäsoluissa on välitön. Nutlin-3A (cis-imidatsoliinianalogi) on voimakas ja selektiivinen MDM2:n estäjä, jonka IC50-arvo on 90 nM, ja se estää MDM2-TP53-vuorovaikutuksen sitoutumalla MDM2:n hydrofobiseen TP53:a sitovaan taskuun .

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli siis testata MDM2:n eston vaikutusta MPM:ssä Nutlin-3A:n avulla verrattuna nykyisin käytössä oleviin yleisiin kemoterapeuttisiin strategioihin käyttäen kolmea solulinjaa, joilla on erilaiset merkkiprofiilit TP53-statuksen, P14/ARF- ja MDM2-ekspressiotason suhteen.

2. Aineisto ja menetelmät

2.1. Tutkimusmenetelmät. Solulinjakokeet

Kirjallisuuden tarkastelun perusteella arvioitiin sytostaattien pitoisuudet (Nutlin-3A , sisplatiini ja pemetreksedi).

Human MPM-solulinjat saatiin American Type Culture Collectionista 2012-08 (Manassas, VA, USA). Solulinjat autentikoitiin ja testattiin kontaminaatioiden varalta käyttäen kaupallista palvelua (Multiplexion, Heidelberg, Saksa), ja ne testattiin viimeksi uudelleen heti kokeiden päätyttyä.

NCI-H2052, NCI-H2452 ja MSTO-211H kasvatettiin Roswell Park Memorial Instituten (RPMI) elatusaineessa (Invitrogen, CA, USA), joka sisälsi 10 %:n nautaeläinten fetaalista seerumia (”fetaalista naudan seerumia”) (Invitrogen, CA, USA), 37 ° C:n lämpötilassa 5 %:n hiilidioksidilla kostutetussa ilmakehässä. Soluja kasvatettiin 85-95-prosenttiseen konfluenssiin asti, minkä jälkeen ne pestiin fosfaattipuskuroidulla keittosuolaliuoksella (Invitrogen) ja trypsiinöitiin 1 ml:lla 0,05-prosenttista trypsiiniä-0,53 mM etyleenidiamiinitetraetikkahappoa, fenolipunaista (Invitrogen). Trypsinisointi lopetettiin lisäämällä reaktioon tuoretta elatusainetta. Noin 10 μl siirrettiin hemosytometriin (BRAND, Wertheim, Saksa) solujen laskemista varten. 1000 solua kuoppaa kohti (100 μl) kylvettiin mikrolevyihin 96/U (Eppendorf, Hampuri, Saksa), jotka soveltuivat luminesenssin ja fluoresenssin havaitsemiseen. Solujen annettiin kiinnittyä yön yli 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa. Seuraavana päivänä väliaine poistettiin ja kuhunkin kuoppaan annosteltiin tuoretta väliainetta, joka sisälsi joko yhtä sytostaattia tai ilman lisäainetta. Sisplatiinia (10μM; TEVA, Petah Tikva, Israel), pemetreksediä (200μM; Lilly, IN, USA) ja Nutlin-3A:ta (5, 10 tai 20μM; Sigma-Aldrich, MO, USA) käytettiin joko yksinään tai yhdessä. Nutlin-3A oli liuotettava dimetyylisulfoksidiin (Sigma-Aldrich). Käytettyjen sytostaattien pitoisuudet on esitetty taulukossa 1. Soluviljelmiä, jotka sisälsivät sytostaatteja ja tyhjää elatusainetta, inkuboitiin kolmen päivän ajan 37 °C:ssa ja 5 % CO2:ssa. Nekroosi, apoptoosi ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin 72 tunnin kuluessa käyttämällä seuraavia luminesenssimäärityksiä: CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay (Promega), Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega) ja CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega). Määritykset tehtiin toimittajan suositusten mukaisesti. Sytostaattista lääkettä ja luminesenssimääritystä kohden mitattiin vähintään neljä datapistettä. Luminesenssi arvioitiin SpectraMax L Luminescence Microplate Reader -laitteella (Molecular Devices, CA, USA). Luminesenssi (suhteelliset luminesenssiyksiköt; RLU) mitattiin 570 nm:ssä ja integrointiaika säädettiin 1 sekunniksi. SpectraMax L -laitteen lämpötila pidettiin 21,5 °C:n ja 24,5 °C:n välillä mittausten aikana. Lisäksi kustakin solulinjasta valmistettiin FFPE-lohko immunohistokemiallisia ja qPCR-analyysejä varten.

2.2. RNA:n eristäminen ja reaaliaikainen qPCR

ACTB:n (referenssigeeni), MDM2:n ja P14/ARF:n ekspressiotasoja tutkittiin TaqMan-reaaliaikaisella qPCR:llä kolmessa MPM-solulinjassa. Tämän vuoksi RNA eristettiin leikkaamalla FFPE-lohkosta kolmesta viiteen 4μm:n leikettä mikrotomilla (Leica, SM 2000 R, Wetzlar, Saksa). Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä miRNeasy FFPE -kittiä (Qiagen, Hilden, Saksa) ja valmistajan protokollaa kahta muutosta lukuun ottamatta (proteinaasi K:n sulatus yön yli; eluointi 25μl:ssä). RNA-pitoisuudet mitattiin UV/VIS-spektrometrillä (NanoDrop ND-1000, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Saksa). RNA säilytettiin -80 °C:ssa. cDNA-synteesiä varten käytettiin iScript Select cDNA-synteesikittiä ja protokollaa (Bio-Rad Laboratories, Inc., CA, USA) käytettiin 1μg kokonais-RNA:ta reaktiota kohti.

Reaaliaikaista qPCR:ää varten käytettiin TaqMan Gene Expression Assays on Demand (AoD) ACTB:lle (Hs03023943_g1), MDM2:lle (Hs01066942_m1) ja P14/ARF:lle (Hs99999189_m1) tarkoitettuja TaqMan Gene Expression Assays on Demand (TaqMan Gene Expression Assays on Demand (AoD) ACTB:lle (Hs03023943_g1), MDM2:lle (Hs01066942_m1) ja P14/ARF:lle (P14/ARF (Hs99999189_m1)) testejä ja protokollaa (Applied Biosystems®; CA, USA). Reaktiotilavuuksia muutettiin käyttämällä 50 % suositelluista kokonaisreaktiotilavuuksista 50 ng cDNA:n syötteen kanssa. Kukin kohde mitattiin kolmena kappaleena. P14/ARF:n ja MDM2:n Ct-arvot normalisoitiin ACTB:n keskiarvoihin. Reaaliaikainen qPCR ja tietojen analysointi suoritettiin Roche LightCycler 480 II -laitteella (Roche, Basel, Sveitsi) ja vastaavalla ohjelmistolla. Kaikki reaaliaikaiset qPCR-kokeet tehtiin MIQE-ohjeiden .

2.3 mukaisesti. Immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin standardiprotokollien mukaisesti käyttäen automaattista värjäyslaitetta (Ventana Discovery XT, München, Saksa). Vertailukudoksilla (liposarkooma MDM2:n osalta, keuhkojen adenokarsinooma TP53:n osalta) tehdyn validoinnin jälkeen immunohistokemialliset tutkimukset suoritettiin MDM2:n (klooni IF2, Calbiochem, Darmstadt, Saksa, laimennos: 1:80) ja TP53:n (klooni BP53-12, Zytomed, Berliini, Saksa; laimennos: 1:5000) vasta-aineilla. Esikäsittely antigeenin talteenottoa varten suoritettiin kuumentamalla deionisoidussa vedessä pH 6:ssa 30 minuutin ajan. Proteiiniekspressio arvioitiin neliportaisella IHC-pisteytysjärjestelmällä, joka perustui positiivisen immunoreaktion saaneiden kasvainsolujen ytimien prosenttiosuuteen (pistemäärä 0: ei signaalia; pistemäärä 1 (heikko ekspressio): 1-25 %; pistemäärä 2 (kohtalainen ekspressio): 26-50 %; pistemäärä 3 (voimakas ekspressio): >50%).

2.4. Tilastollinen analyysi

Statistiset ja graafiset analyysit suoritettiin R-tilasto-ohjelmointiympäristöllä (v3.4.2).

Yksittäisten ryhmien väliseen analyysiin käytettiin joko Wilcoxonin Mann-Whitneyn rank-summatestiä (ei-parametrinen) tai kaksipuolista opiskelijoiden t-testiä (parametrinen). Ordinaalimuuttujiin, joissa oli enemmän kuin kaksi ryhmää (luminesenssisignaalin erot kaikkien hoitoryhmien välillä), käytettiin joko Kruskal-Wallisin testiä (ei-parametrinen) tai ANOVA:ta (parametrinen) ryhmien välisten erojen havaitsemiseksi.

Tilastollinen merkitsevyystaso määriteltiin arvoksi p<0,05.

3. Tulokset

MDM2:n, TP53:n ja P14/ARF:in ilmentymiskuvaukset erosivat toisistaan eri selitysmalleissa, ja ne on esitetty yhteenvetona taulukossa 2. Immunohistokemiallisten värjäysten skannaukset on esitetty kuvassa 1; qPCR-tulokset on visualisoitu kuvassa 2. NCI-H2052:ssa todettiin voimakas MDM2-immunoekspressio, mutta vähäinen P14/ARF- ja TP53-ekspressio. Immunohistokemiallisesti MSTO-211H:ssa ei näkynyt MDM2- ja P14/ARF-ekspressiota, mutta TP53-ekspressiota esiintyi. NCI-H2452:ssa ei havaittu MDM2- eikä TP53-ekspressiota, mutta P14/ARF-ekspressiota havaittiin. Tutkitut solulinjat edustavat molekyylikonstellaatiota, joka on raportoitu aiemmissa MPM-potilaita koskevissa tutkimuksissa.

(a) NCI-H2052, anti-P53-värjäys

(b) NCI-H2052, anti-MDM2-värjäys

(c) NCI-H2452, anti-P53-värjäys

(d) NCI-H2452, anti-MDM2-värjäys
(d) NCI-H2452, anti-MDM2-värjäys

(e) MSTO-211H, anti-P53-värjäys
(e) MSTO-211H, anti-P53-värjäys

(f) MSTO-211H, anti-MDM2-värjäys

(a) NCI-H2052, anti-P53-värjäys
(b) NCI-H2052, anti-MDM2-värjäys
(c) NCI-H2452, anti-P53-värjäys(d) NCI-H2452, anti-MDM2-värjäys
(d) NCI-H2452, anti-MDM2-värjäys(e) NCI-H2452, anti-MDM2-värjäys
(d) NCI-H2452, anti-MDM2-värjäys(e) NCI-H2452, anti-P53-värjäys
(e) MSTO-211H, anti-P53-värjäys
(f) MSTO-211H, anti-MDM2-värjäys

Kuva 1

Tutkittujen MPM-solulinjojen immunohistokemiallinen värjäys, jossa käytettiin P53:n ja MDM2:n suhteen suunnattuja vasta-aineita. NCI-H2052:ssa P53 (a) ja MDM2 (b) värjäytyvät voimakkaasti (pistemäärä 2). NCI-H2452 ei osoittanut immunoekspressiota P53:n ((c), pistemäärä 0) eikä MDM2:n ((d), pistemäärä 0) osalta. MSTO-211H värjäytyi positiivisesti P53:n ((e), tulos 1) ja MDM2:n ((f), tulos 1) suhteen. Mittakaavapalkit osoittavat 100 μm kuvissa (a) ja (b) ja 500 μm kuvissa (c), (d), (e) ja (f).

Kuva 2

Pylväskaavio esittää MDM2:n, P53:n ja P14/ARF:n suhteellista mRNA:n ilmentymää tutkituissa MPMsolulinjoissa. x-akselilla on esitetty tutkitut solulinjat ja niiden P53:n, MDM2:n ja P14/ARF:n vastaava mRNA-ekspressio. Y-akselilla esitetään tutkittujen kohdegeenien suhteellisen mRNA-ekspression 2∧ΔCt-arvot sen jälkeen, kun ne on normalisoitu referenssigeeniä ACTB (aktin, beta) vastaan. NCI-H2052 ja MSTO-211H osoittavat kohonnutta MDM2:n ilmentymistä, kun taas NCI-H2452:ssa MDM2:n ilmentyminen oli vähäistä. TP53:n mRNA-ekspressio oli vähentynyt NCI-H2452:ssa verrattuna molempiin muihin solulinjoihin. P14/ARF-ekspressio oli alle havaitsemisrajan tutkituissa näytteissä.

3.1. JOHTOPÄÄTÖKSET. MPM-solulinjojen vaste pemetreksedille, sisplatiinille ja vaihteleville Nutlin-3A-pitoisuuksille

Sisplatiinia (10μM) ja pemetreksediä (200μM) yksinään sekä yhdistelmänä testattiin suhteessa kolmeen Nutlin-3A-pitoisuuteen (5μM, 10μM ja 20μM).

3.1.1. Solujen elinkelpoisuus

NCI-H2052. Mikä tahansa Nutlin-3A-pitoisuus vähensi solujen elinkelpoisuutta paremmin kuin sisplatiini tai pemetreksedi tai niiden yhdistelmä (p=0,0039). Sitä vastoin pelkkä pemetreksedihoito osoitti merkittävästi kohonnutta solujen elinkelpoisuutta. Käsittely pelkällä sisplatiinilla osoitti suurempaa solujen elinkykyisyyttä kuin sisplatiinin ja pemetreksedin yhdistelmä.

MSTO-211H. Pemetreksediin yhdistettynä sisplatiiniin liittyi korkein solujen elinkelpoisuus, seuraavaksi korkein solujen elinkelpoisuus oli pelkällä sisplatiinilla ja alhaisin Nutlin-3A-pitoisuus (p=0,0952). Pemetreksedi yhdistettynä sisplatiiniin vähensi solujen elinkelpoisuutta merkittävästi, mutta Nutlin-3A (10μM) vähensi sitä hieman voimakkaammin. Korkein Nutlin-3A-pitoisuus vähensi solujen elinkelpoisuuden minimiin.

NCI-H2452. Korkein Nutlin-3A-pitoisuus (20μM) vähensi solujen elinkelpoisuuden minimiin (p=0,0017). 10μM Nutlin-3A oli toiseksi voimakkain solujen elinkelpoisuuden estäjä, jonka jälkeen tulivat pelkkä sisplatiini, pelkkä pemetreksedi ja sisplatiini yhdessä pemetreksedin kanssa. Pienin Nutlin-3A-pitoisuus vaikutti heikoimmin solujen elinkelpoisuuden vähenemiseen.

Solujen elinkelpoisuutta kuvaavat laatikkokuviot korostavat solujen elinkelpoisuuden vähenemistä Nutlin-3A-pitoisuuden kasvaessa testatuissa solulinjoissa. Kaikkien solulinjojen tulokset senesenssin/solujen elinkelpoisuuden osalta on esitetty yhteenvetona kuvissa 3(a)-3(c).

(a)

(b)

(c)

(c)

(a)
(b)
(c)

Kuva 3

MPM-solulinjojen senesenssin indusoiminen pemetreksedillä, sisplatiinin ja vaihtelevien Nutlin-3A-pitoisuuksien sekä vaihtelevien Nutlin-3A-pitoisuuksien ja sisplatiinin yhdistelmän vaikutuksesta. Kuvassa 3 esitetään solujen elinkelpoisuuden/senesenssin boksikaaviot kolmesta tutkitusta MPM-solulinjasta. Y-akselilla esitetään RLU (suhteelliset luminesenssiyksiköt). Korkeat RLU-arvot viittaavat solujen korkeaan elinkelpoisuuteen, kun taas alhaiset RLU-arvot viittaavat senesenssiin. x-akselilla esitetään käytettyjen sytostaattien ja kontrollin pitoisuudet. Kaikissa kolmessa MPM-solulinjassa 20μM Nutlin-3A osoitti voimakkainta solujen elinkelpoisuuden estoa verrattuna muihin käytettyihin yksittäisiin sytostaatteihin ja pitoisuuksiin. Tämä pätee muihin Nutlin-3A-pitoisuuksiin (NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,007, NCI-H2452: p<0,001), sisplatiiniin (NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,018, NCI-H2452: p=0.004), pemetreksedi (NCI-H2052: p=0,032, MSTO-211H: p=0,008, NCI-H2452: p=0,006) ja näiden yhdistelmä (NCI-H2052: p=0,003, MSTO-211H: p=0,002, NCI-H2452: p<0,001). Lisäksi Nutlin-3A:n korkeammat pitoisuudet (10μM, 20μM) yhdistettynä sisplatiinihoitoon estivät voimakkaimmin solujen elinkelpoisuutta verrattuna nykyisin hyväksyttyihin sytostaatteihin joko yksittäisinä aineina (sisplatiini: NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,022, NCI-H2452: p=0,006; pemetreksedi: NCI-H2052: p=0,014, MSTO-211H: p=0,029, NCI-H2452: p<0,001) tai yhdistelmänä (NCI-H2052: p=0,003, MSTO-211H: p=0,014, NCI-H2452: p<0,001). Apoptosis

NCI-H2052. NCI-H2052-solulinjassa korkein apoptoosin määrä havaittiin 20μM Nutlin-3A:lla, kun taas muilla hoitomenetelmillä havaittiin samanlainen apoptoosin induktio (p=0.14).

MSTO-211H. MSTO-211H:ssa korkein apoptoosinopeus havaittiin pemetreksedillä, jota seurasi pemetreksedi yhdessä sisplatiinin ja eri Nutlin-3A-pitoisuuksien kanssa (p=0,0219). Pelkällä sisplatiinilla ja Nutlin-3A:lla ei havaittu lähes lainkaan apoptoosia.

NCI-H2452. NCI-H2452 osoitti suurimman apoptoosin määrän vasteena Nutlin-3A:lle suurimmassa pitoisuudessa (20μM) ja sen jälkeen sisplatiinille (p=0,0359). Muiden sytostaattien kohdalla havaittiin huomattavasti alhaisempia apoptoosinopeuksia.

Apoptoosia koskevat tulokset on esitetty yhteenvetona kuvissa 4(a)-4(c).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Kuva 4

Kuvassa 4 on esitetty tutkittujen MPM-solulinjojen apoptoosia kuvaavat boxplotit. Y-akselilla on esitetty RLU (suhteelliset luminesenssiyksiköt). RLU ja lisääntyvä apoptoosinopeus osoittavat suoraa korrelaatiota. X-akselilla esitetään käytettyjen sytostaattien ja kontrollin pitoisuudet. Solulinjojen NCI-H2052 ja NCI-H2452 (kuvissa 4(a) ja 4(c)) osalta 20μM Nutlin-3A indusoi voimakkaimmin apoptoosia, kun verrattiin yksittäisiä aineita (sisplatiini: NCI-H2052: p=0,084, NCI-H2452: p=0,028; pemetreksedi: NCI-H2052: p=0,011, NCI-H2452: p=0,049) mutta myös sisplatiiniin yhdistettynä pemetreksediin (NCI-H2052: p=0,015, NCI-H2452: p=0,008). MSTO-211H (esitetty kuvassa 4(b)), korkein apoptoosinopeus todettiin pemetreksedille, jota seurasivat 5μM, 20μM Nutlin-3A ja pemetreksedin ja sisplatiinin yhdistelmä (kaikki p<0,001). Analysoitaessa Nutlin-3A:ta yhdessä sisplatiinin kanssa solulinjan NCI-H2052 osalta (a) korkein apoptoosinopeus havaittiin 10μM Nutlin-3A:lla yhdessä sisplatiinin kanssa (kaikki p<0,001). MSTO-211H (b) 10μM Nutlin-3A yhdistettynä sisplatiiniin apoptoosiasteet olivat verrattavissa pelkällä pemetreksedillä annettuun hoitoon (p=0,493), ja ne paranivat merkittävästi kaikkia muita lähestymistapoja vastaan (p=0,016). NCI-H2452:ssa (c) hoito sisplatiinilla yhdistettynä 20μM:n ja 10μM:n Nutlin3A:n kanssa osoitti voimakkainta apoptoosin induktiota verrattuna 20μM:n Nutlin-3A:han yksinään (p=0,004), mutta ei osoittanut tilastollisesti merkitseviä eroja verrattuna 20μM:n Nutlin-3A:n yksinomaiseen hoitoon (p=0,199).

3.1.3. Nekroosi

Solujen nekroosiin ei vaikuttanut mikään kemoterapia verrattuna kontrolliin (tietoja ei ole esitetty).

3.2. MPM-solulinjojen vaste vaihteleviin Nutlin-3A-pitoisuuksiin yhdistettynä sisplatiiniin

Jatkokokeissa testattiin apoptoosin induktiota käyttämällä joko Nutlin-3A-hoitoa tai Nutlin-3A:n ja sisplatiinin yhdistelmää. Kolmea Nutlin-3A:n (5μM, 10μM ja 20μM) ja sisplatiinin (10μM) yhdistelmää verrattiin pelkkään sisplatiiniin (10μM), pelkkään pemetreksediin (200μM), pelkkään Nutlin-3A:han (10μM) ja sisplatiinin ja pemetreksedin yhdistelmään.

3.2.1. Fosfoptiokokeita. Solujen elinkelpoisuus

NCI-H2052. Nutlin-3A yksinään ja sen yhdistelmä sisplatiinin kanssa osoitti merkitsevästi lisääntynyttä senesenssin induktiota verrattuna muihin hoitomuotoihin (p=0,0051). Ainoastaan 5μM Nutlin-3A yhdessä sisplatiinin kanssa osoitti pienempää tehoa senesenssin indusoimiseen kuin 5μM Nutlin-3A ilman sisplatiinia. Korkeammat Nutlin-3A-pitoisuudet (10 ja 20μM) yhdessä sisplatiinin kanssa vähensivät solujen elinkelpoisuuden minimiin. Suurin solujen elinkelpoisuus havaittiin pemetreksedillä, jota seurasi pemetreksedin ja sisplatiinin yhdistelmä.

MSTO-211H. Mikä tahansa Nutlin-3A:n ja sisplatiinin yhdistelmä indusoi merkittävästi lisääntynyttä solujen vanhenemista verrattuna sisplatiiniin, pemetreksediin tai molempien yhdistelmään (p=0,0059). Sisplatiinin ja pemetreksedin yhdistelmällä oli kuitenkin samanlainen teho kuin pienimmällä Nutlin-3A:n ja sisplatiinin yhdistelmällä ja pelkällä Nutlin-3A:lla. Nutlin-3A:n korkeammat pitoisuudet yhdistettynä sisplatiiniin vähensivät solujen elinkelpoisuuden minimiin.

NCI-H2452. Nutlin-3A yhdessä sisplatiinin kanssa tai yksinään oli ylivoimainen muihin sytostaatteihin verrattuna lukuun ottamatta pienintä pitoisuutta 5μM (p=0,0089). Mielenkiintoista oli, että sisplatiinin teho oli verrattavissa 10μM Nutlin-3A:n tehoon yksinään ja sisplatiinin tehoon yhdessä 5μM Nutlin-3A:n kanssa. Suurin solujen elinkelpoisuus havaittiin pemetreksedillä, sisplatiinilla yhdessä pemetreksedin kanssa ja 5μM Nutlin-3A:lla. Korkein Nutlin-3A-pitoisuus (20μM) yhdessä sisplatiinin kanssa osoitti korkeinta senesenssinopeutta.

Solujen elinkelpoisuutta kuvaavat laatikkokuvioinnit korostavat, että solujen elinkelpoisuus väheni sisplatiinin ja Nutlin-3A:n yhdistelmän pitoisuuden kasvaessa testatuissa solulinjoissa. Senesenssiä/solujen elinkelpoisuutta koskevat tulokset on esitetty yhteenvetona kuvissa 3(a)-3(c).

3.2.2. Apoptosis

NCI-H2052. NCI-H2052-solulinjassa korkeammat Nutlin-3A-pitoisuudet yhdistettynä sovellettuun sisplatiiniin indusoivat merkittävästi lisääntynyttä apoptoosia verrattuna pelkkään pemetreksediin tai yhdistettynä sisplatiiniin (p=0,0069). Korkeimmat apoptoosiluvut havaittiin 10μM Nutlin-3A:lla yhdessä sisplatiinin kanssa.

MSTO-211H. Solulinjan MSTO-211H soluilla oli korkein apoptoosi, kun niitä hoidettiin pelkällä pemetreksedillä (p=0,0035). Toiseksi eniten apoptoosia havaittiin 10μM Nutlin-3A:lla yhdistettynä sisplatiiniin. Pemetreksedi yhdessä sisplatiinin kanssa johti kolmanneksi korkeimpaan apoptoosiin. Sisplatiini yhdessä 20μM Nutlin-3A:n kanssa oli tehokkaampi kuin sisplatiini yksinään, Nutlin-3A yksinään ja pienin Nutlin-3A-pitoisuus (5μM) yhdessä sisplatiinin kanssa.

NCI-H2452. Korkeimmat apoptoosinopeudet havaittiin 20μM Nutlin-3A:n yksittäisellä aineella sekä 10μM:n ja 20μM:n Nutlin-3A-pitoisuuksilla yhdistettynä sisplatiiniin, ja seuraavaksi korkein apoptoosinopeus oli sisplatiinilla (p=0,1).

Apoptoosia koskevista tuloksista on yhteenveto kuvissa 4(a)-4(c).

3.2.3. Apoptoosia koskevat tulokset. Nekroosi

Solujen nekroosiin ei vaikuttanut mikään kemoterapia verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (tietoja ei ole esitetty).

Kaikki solulinjojen estokokeiden tulokset on esitetty yhteenvetona taulukossa 3.

(a) MPM-solulinjojen vaste pemetreksedille, sisplatiinille, ja vaihteleviin Nutlin-3A-pitoisuuksiin

– 211H Solujen elinkelpoisuus Solujen elinkelpoisuus 10um. Cis 200um Pem 10um Cis+200um Pem 5um Pähkinä 10uM Pähkinä 20uM Pähkinä H2052 + – + ++ +++ ++++ MSTO-211H 0 + 0 0 ++ +++ H2452 0 0 0 – – + +++ Apoptoosi 10um Cis 200um Pem 10um Cis+200um Pem 5um Pähkinä 10uM Pähkinä 20uM Pähkinä H2052 0 0 ++ + + 0 ++ ++ H2452 0 0 0 0 0 ++ +++

(b) MPM-solulinjojen vaste vaihteleviin Nutlin-3A-pitoisuuksiin yhdistettynä sisplatiiniin

. – Solujen elinkelpoisuus 10uM Cis 200um Pem 10um Cis+200um Pem 5um Pähkinä+10um Cis 10uM Pähkinä+10um Cis 20uM Pähkinä+10um Cis 10uM Pähkinä H2052 0 – 0 + ++ +++ + MSTO-211H + + + ++ +++ +++ +++ ++ H2452 + – – + ++ +++ + Apoptoosi 10uM Cis 200um Pem 10um Cis+200um Pem 5um Nut+10um Cis 10uM Nut+10um Cis 20uM Nut+10um Cis 10uM Nut H2052 0 0 0 0 0 +++ ++ 0 MSTO-211H + +++ +++ + +++ +++ +++ + H2452 + 0 + 0 ++ +++ +

Taulukko 3

4. Keskustelu

Aiemmissa tutkimuksissa tunnistimme MDM2:n ennusteelliseksi biomarkkeriksi MPM-potilailla ja että sen ilmentymistä säätelevät tietyt miRNA:t . Nutlin-3A estää MDM2-TP53-vuorovaikutusta ja indusoi siten solusyklin pysähtymistä, senesenssiä ja apoptoosia solutyypistä riippuen . Lisäksi se on ei-genotoksinen lääke, jolla on vain vähän toksisuutta eläinmalleissa ja johon liittyy pienempi resistenssiriski kuin tavanomaisiin lääkkeisiin .

Tässä tilanteessa oletimme, että MDM2:n yliekspressio, ehkä yhdessä P14/ARF:n osittaisen tai täydellisen menetyksen kanssa, voidaan kohdistaa Nutlin-3A:han perustuvalla hoito-ohjelmalla TP53:n aktiivisuuden palauttamiseksi MPM:n alaryhmässä.

Tässä in vitro -lähestymistavassa tutkittiin nykyään uusimpien kemoterapeuttisten lääkeaineiden, sisplatiinin ja pemetreksedin, yksinään ja yhdistelmänä Nutlin-3A:han verrattuna kolmessa potilailta löydetyn kuvion kattavassa solulinjassa. Nutlin-3A indusoi tehokkaasti senesenssiä kaikissa kolmessa MPM-solulinjassa ja oli ylivoimainen verrattuna sisplatiiniin ja/tai pemetreksediin, kun taas apoptoosia voitiin indusoida vain suurilla pitoisuuksilla. Kirjallisuudesta tiedetään, että Nutlin-3A:n vaikutukset ovat solutyyppispesifisiä ja aiheuttavat pikemminkin solusyklin pysähtymistä ja senesenssiä kuin apoptoosia. Näin ollen tutkimme sisplatiinin ja Nutlin-3A:n yhdistelmää solustressin lisäämiseksi indusoimalla platiinipohjaisia DNA-vaurioita. Nutlin-3A:n ja sisplatiinin yhdistelmä johtaa lisääntyneeseen apoptoosiin ja senesenssiin verrattuna pelkkään Nutlin-3A:han , koska TP53:n tärkein tehtävä on DNA-vaurio- ja stressivaste .

Sama mekanismi näyttäisi pitävän paikkansa, kun Nutlin-3A:ta ja sädehoitoa yhdistetään niin, että saadaan aikaan lisäsoluvaurioita ja siirretään solujen TP53-vastetta apoptoosiin, mikä on jo osoitettu TP53-villiintyneen tyypin ruokatorven levyepiteelisolusyövän kohdalla in vitro ja in vivo . Mielenkiintoista on, että Shimazu et al. havaitsivat MPM:ssä ylimääräisen kasvua estävän vaikutuksen, kun Nutlin-3A yhdistettiin metformiiniin, joka on mTOR:n estäjä, mikä viittaa mahdolliseen ristikkäiseen vuorovaikutukseen mTOR- ja TP53-reitin välillä. Huomionarvoista on, että kirjoittajat vahvistivat havaintomme, joiden mukaan solulinjat NCI-H2052 ja MSTO-211H reagoivat parhaiten Nutlin-3A-hoitoon, ja asettivat IC50-arvoksi 0,37μM (MSTO-211H) ja 0,50μM (NCI-H2052) .

Kuten edellä mainittiin, MDM2:n yliekspressio voi johtaa P53:n säätelytoiminnan häviämiseen lisääntyneen proteasomaalisen hajoamisen kautta . Fysiologisen inhibiittorinsa P14/ARF:n lisäksi näiden geenien välisen signalointisuhteen analyysi viittaa RB1:n lisärooliin tässä signalointiverkostossa . On osoitettu, että MDM2-TP53-vuorovaikutuksen estämisen lisäksi Nutlin-3A vaikuttaa myös MDM2-RB1-vuorovaikutuksiin, mikä on mahdollinen selitys Nutlin-3A:han perustuville TP53-riippumattomille vaikutuksille .

Mielenkiintoista on, että jopa vähän MDM2:ta ilmentävässä MSTO-211H-solulinjassa sekä MDM2- ja TP53-negatiivisessa NCI-H2452-solulinjassa on havaittavissa vähäisempi, mutta selvästi havaittavissa oleva apoptoosin indusoituminen Nutlin-3A:n vaikutuksesta, kun se on yhdistetty sisplatiiniin. Myös immunohistokemiallisesti negatiivisilla soluilla on, kuten aiemmin on raportoitu , havaittavissa oleva MDM2:n geeniekspressiomalli, mikä johtaa MDM2-proteiinipitoisuuksiin, jotka ovat alle IHC:n havaitsemisrajan. Oletamme, että koska MDM2:n ohjaama TP53:n säätely on olennainen apoptoosin ja solujen tilan välittäjä fysiologisessa tilanteessa, myös TP53-MDM2-vuorovaikutuksen estäminen näillä alhaisilla MDM2-pitoisuuksilla vaikuttaa suotuisasti platinayhdisteiden sytotoksisuuteen, mikä selittää Nutlin-3A-hoidon esiintyvät sivuvaikutukset. NCI-H2452-solulinjassa, jossa TP53:n ilmentyminen puuttuu, havaitun vaikutuksen on oltava TP53:sta riippumaton, ja se perustuu todennäköisesti RB1:n estovaikutuksiin.

Nykyisin Nutlin-3A:ta annetaan per os aineena R05045337 monikeskuksisessa vaiheen I kliinisessä tutkimuksessa hematologisten kasvainten hoidossa . Lisäksi Nutlin-3A:n johdannainen RG7112 on edennyt vaiheen I kliinisiin tutkimuksiin potilailla, joilla on liposarkoomia, jotka ovat TP53-villiintyneitä kasvaimia, joissa on monistunut MDM2 . Tässä kliinisessä tutkimuksessa RG7112:ta annettiin per os 20 potilaalle neoadjuvanttihoitona . Yhdellä potilaalla todettiin osittainen remissio ja 14:llä vakaa tauti, mutta kaikki potilaat kärsivät sivuvaikutuksina neutropeniasta . Mahdollinen selitys saattaa olla suuret lääkeannokset 1440 mg m-2 day-1 per os . Aikaisemmissa in vivo -tutkimuksissa Nutlin-3A:n oraalisessa annostelussa ilmeni useita rajoituksia, kuten Nutlin-3A:n suuret annosmäärät (200-400 mg/kg) ja vaikeudet näiden suurten annosten antamisessa . On huomionarvoista, että tehokkaita annostelujärjestelmiä on kehitetty käyttämällä polymeerejä, kuten poly(laktidi-ko-glykolidia) (PLGA) ja monoklonaalisia vasta-aineita .

5. Johtopäätökset

Tässä in vitro -tutkimuksessa todistettiin hypoteesimme, jonka mukaan MDM2:ta yliekspressoivaan MPM:ään voidaan kohdistaa Nutlin-3A-pohjainen kemoterapia. Erityisesti optimaalisessa biomarkkeriasetelmassa, jossa MDM2-overexpressio ja matala/poissaoleva P14/ARF-ekspressio, havaittiin ylivoimainen apoptoosi- ja senesenssiaste verrattuna tavanomaisiin kemoterapioihin. Jopa vähemmän optimaalisessa biomarkkeriasetelmassa, jossa MDM2:n ilmentyminen oli vähäistä, Nutlin-3A:n ja sisplatiinin yhdistelmällä oli ilmeisen suotuisa apoptoosin ja senesenssin induktio verrattuna tavanomaiseen lääkehoitoon. Näin ollen Nutlin-3A:han perustuvalla hoitomenetelmällä voisi olla suuri arvo MPM-potilaiden alaryhmälle.

Tietojen saatavuus

Tämän tutkimuksen tulosten tukena käytetyt tiedot ovat pyynnöstä saatavissa vastaavalta kirjoittajalta.

Julkistaminen

Tämän tutkimuksen tulokset on esitelty Saksan syöpäkonsortiossa (DKTK), 1. Essenin translationaalisen onkologian symposiumissa (1. Essen Translational Oncology Symposium, ETOS) (Essen, 2018) ja 33. Saksan syöpäkongressissa (Berliini 2018).

Interintäristiriidat

Tekijät eivät ilmoita eturistiriitoja.

Kiitokset

Tutkimuksen rahoittivat Patologian instituutti, Essenin yliopistollinen sairaala ja Ruhrlandklinik Essen.

Tutkimuksen rahoittivat Patologian instituutti, Essenin yliopistollinen sairaala ja Ruhrlandklinik Essen.