Kryptokromit

Biologiset kiertokellot ovat biokemiallisia oskillaattoreita, jotka kiertävät noin vuorokauden välein ja jotka voidaan nollata altistumalla valolle ja muille ympäristösignaaleille. Eläimillä on aivoissa keskusoskillaattori, joka ohjaa koko elimistön vuorokausikäyttäytymistä, sekä perifeerisiä oskillaattoreita joissakin kudoksissa. Oskillaatio syntyy transkriptionaalisesta palautesilmukasta, johon osallistuu joukko kellon transkriptiotekijöitä, kuten timeless (Tim), periodi (Per), clock (Clk) ja Bmal1 sekä kryptokromit. Kryptokromit ilmentyvät kaikkialla kaikkien organismien elimissä ja kudoksissa, ja ne ovat yleensä ydinproteiineja, jotka säätelevät geeniekspressiota. Parhaiten tutkittuja eläinten kryptokromeja ovat Drosophilan kryptokromi Cry ja hiiren kryptokromit Cry1 ja Cry2 , ja myös Arabidopsiksen kahta kryptokromia CRY1 ja CRY2 on tutkittu laajasti.

Drosophilan kryptokromit

Drosophilan Cry on pääasiassa ydinkeräysproteiini, joka välittää valon avulla tapahtuvaa vuorokausikellon säätelyä , vaikkakin sitä voi löytyä myös sytosolista . Se säätelee vuorokausikelloa olemalla suoraan vuorovaikutuksessa Tim-proteiinin kanssa tukahduttaakseen kellon negatiivisen takaisinkytkennän (kuva 3a). Valo stimuloi Cry-Timin vuorovaikutusta, mikä edistää Timin ubikitinaatiota ja proteosomi-riippuvaista hajoamista ja tukahduttaa Per-Tim-heterodimeerin muodostumisen. Clock- ja Cycle-proteiinien heterodimeerin Per-Tim-heterodimeerin inhibitio vapautuu näin ja sirkadiaanisen oskillaation vaihe nollautuu (kuva 3a). Kryptokromi ei kuitenkaan ilmeisesti ole ainoa valoreseptori, joka virittää Drosophilan sirkadiaanista kelloa. Cryb-mutaatiokärpäsen, jolta puuttuu Cry-toiminto, käyttäytymisrytmitys voidaan kuitenkin ohjata valon vaikutuksesta, ellei myös näköpigmentin signaalinsiirtoa eliminoida. Sen lisäksi, että Cry toimii valoreseptorina Drosophilan keskusoskillaattorin virittämisessä, sillä on myös valosta riippumaton rooli perifeerisen sirkadiaanisen oskillaattorin toiminnassa .

Nisäkkäiden kryptokromit

Drosophilan Cryn kaksi tehtävää – valoreseptorina vuorokausikellon virittämisessä yhdessä näköpigmenttien kanssa ja vuorokausivärähtelijäproteiinikompleksin erottamattomana komponenttina – ovat myös nisäkkäiden kryptokromien ominaisuuksia. Nisäkkäiden kryptokromit ovat pääasiassa ydinproteiineja, mutta niitä esiintyy myös sytosolissa. Nisäkkäiden kryptokromit suorittavat Drosophilan Cryn tavoin sekä valosta riippuvia että valosta riippumattomia tehtäviä vuorokausikellon säätelyssä. Useat havainnot osoittavat nisäkkäiden Cry-proteiinien valoriippuvaisen roolin. Knockout-hiirillä, joilta puuttuu toinen tai molemmat Cry-geenit, on heikentynyt tai hävinnyt kyky indusoida per-geenin ja protoonikogeenin c-fos:n kaltaisten geenien ilmentymistä valon vaikutuksesta. Lisäksi sellaisten mutanttihiirten pupillit, joilta puuttuu sekä Cry1 että Cry2, ovat heikentyneet refleksivasteet valolle .

Toisaalta Cry1-Cry2-kaksoismutanttihiirellä on näennäisesti normaali rytmitys valon ja pimeän välisissä sykliolosuhteissa, mutta se menettää rytmityksensä välittömästi ja täydellisesti vapaana juoksevissa (aina pimeässä) olosuhteissa . Nämä havainnot osoittavat, että Cry-proteiineilla on olennainen ja valosta riippumaton tehtävä nisäkkäiden keskeisessä sirkadiaanisessa oskillaattorissa ja että kryptokromit eivät ole ainoat valoreseptorit, jotka välittävät kellon valon ohjausta. Koska kryptokromit ovat olennainen osa hiiren keskusoskillaattoria, on lähes mahdotonta testata suoraan niiden roolia kellon valo-ohjauksessa. On kuitenkin havaittu, että hiukan Drosophilan tilannetta vastaavasti hiiren cry-mutantti säilyttää kykynsä välittää valonsyöttöä, ellei samanaikaisesti häiritä myös näköpigmenttien toimintaa. Kolminkertaiset mutanttihiiret, joilla on molempien kryptokromien mutaatioita yhdessä verkkokalvon degeneratiivisen mutaation kanssa, ovat lähes rytmihäiriöisiä valon ja pimeyden vaihteluolosuhteissa. Nämä tulokset osoittavat, että nisäkkäiden Cry-proteiinit todellakin osallistuvat valon avulla tapahtuvaan vuorokausikellon säätelyyn, mutta niiden rooli vuorokausikellon säätelyssä valon avulla on redundantisti muiden fotoreseptorien hoitama. Nyt näyttää selvältä, että nisäkkäiden sirkadiaarisen oskillaattorin säätelyssä yhdessä kryptokromien kanssa toimivat muut fotoreseptorit ovat visuaaliset sauvakalvon opsiinit ja niihin liittyvä proteiini melanopsiini .

Nisäkkäiden kryptokromit ovat Drosophilan Cry-proteiinien tavoin vuorovaikutuksessa fysikaalisesti kelloproteiinien kanssa, mukaan luettuina promoottoria sitovat transkriptiosäätelijät Per, Clk ja Bmal1 (kuva 3b). Toisin kuin Drosophilan Cry, nisäkkäiden Cry-proteiinit ovat osia vuorokausikellon negatiivisen takaisinkytkennän silmukasta (kuva 3b). Cryptokromin fyysinen vuorovaikutus muiden kellokomponenttien kanssa vaikuttaa niiden aktiivisuuteen, vuorovaikutukseen, hajoamiseen tai ydinkuljetukseen ja muuttaa näin ollen kellogeenien transkriptionaalista säätelyä . Valo ei kuitenkaan näytä vaikuttavan kryptokromien ja muiden kelloproteiinien, kuten Perin, Clk:n ja Bmal1:n, väliseen vuorovaikutukseen, mikä viittaa siihen, että tällaiset vuorovaikutukset eivät ehkä ole sirkadiaanisen kellon valo-ohjausmekanismi, kuten Drosophilassa. Transkription suoran säätelyn lisäksi fysikaalisen vuorovaikutuksen kautta promoottoria sitovien transkription säätelijöiden kanssa kryptokromit voivat vaikuttaa vuorokausikelloon myös osallistumalla histonimodifikaatioiden säätelyyn , mutta se, miten tämä toimii, on vielä selvittämättä.

Arabidopsikryptokromit

Arabidopsiksen kryptokromit CRY1 ja CRY2 ovat pääasiassa ydinvalkuaisia proteiineja, jotka välittävät geenien ilmentymisen säätelemistä ja vuorokausikellon säätelyä vasteena valolle . CRY1:llä ja CRY2:lla on merkittävä rooli kasvien fotomorfogeneesissä, kuten varren pidentymisen estämisessä sinisen valon vaikutuksesta, lehtien laajenemisen stimuloimisessa sinisen valon vaikutuksesta ja kukinnan käynnistymisen säätelyssä päivän pituuden mukaan . Näyttää siltä, että kryptokromit säätelevät kasvien kehitysmuutoksia valon vaikutuksesta tapahtuvien geeniekspressiomuutosten kautta. CRY1 ja CRY2 ovat yhdessä vastuussa sinisestä valosta riippuvaisista muutoksista geeniekspressiossa jopa 10-20 %:ssa Arabidopsiksen genomia.

On ainakin kaksi mekanismia, joilla kryptokromit voivat vaikuttaa ydinkromin geeniekspressiomuutoksiin valon vaikutuksesta. Ensinnäkin kryptokromimolekyyli voi olla vuorovaikutuksessa transkriptiokoneistoon liittyvien proteiinien kanssa vaikuttaakseen suoraan transkriptioon. Arabidopsis CRY2 sitoutuu kromatiiniin DNA-sekvenssistä riippumattomalla tavalla ( ja M. Maymon ja C.L., julkaisemattomat havainnot), mutta on epäselvää, miten sekvenssistä riippumaton kromatiiniin vuorovaikutuksessa oleva proteiini voi säädellä geeniekspressiota. Toisin kuin eläinten kryptokromien, joiden on osoitettu säätelevän transkriptiota fysikaalisten vuorovaikutusten kautta promoottoria sitovien transkription säätelijöiden kanssa, kasvien kryptokromeista ei ole raportoitu tällaista vuorovaikutusta. Vaihtoehtoinen malli on, että kasvien kryptokromit voivat olla vuorovaikutuksessa proteiinien kanssa, joilla on muita solutoimintoja ja jotka säätelevät transkriptionaalisten säätelijöiden stabiilisuutta, modifikaatiota ja soluliikennettä. Esimerkiksi kasvien kryptokromien on havaittu olevan vuorovaikutuksessa E3-ubikitiiniligaasi COP1:n kanssa, mikä viittaa siihen, että kasvien kryptokromit voivat toimia tavalla, jota ei ole vielä löydetty eläinten kryptokromien osalta. Tämän näkemyksen kanssa sopusoinnussa on myös äskettäin havaittu, että Arabidopsiksen kryptokromit estävät sinisen valon vaikutuksesta tärkeän kukinnan säätelijän CONSTANSin proteasomista riippuvan hajoamisen. Sitä, miten kryptokromit tekevät tämän, on tutkittava tarkemmin.

Mekanismi

Kryptokroomien katalyyttistä mekanismia ei ole täysin selvitetty, mutta joitakin johtolankoja löytyy CPD-fotolyaasien mekanismista, jossa FAD:lla on tärkein katalyyttinen rooli . DNA:n korjausreaktiossa CPD-fotolyaasi sitoutuu DNA:n pyrimidiinidimeeriin ja ”kääntää” sen pois DNA-dupleksin sisältä entsyymin FAD:lle tarkoitettuun onteloon muodostaakseen vakaan kompleksin. Toinen kromofori (pteriini tai deatsaflaviini), jota kutsutaan myös ”antenni”-kromoforiksi, absorboi sinisen tai UV-A-valon fotoneja ja siirtää kiihdytysenergian FAD:n flaviiniin. Virittyneessä tilassa oleva flaviini luovuttaa elektronin pyrimidiinidimeerille syklobutaanirenkaan jakamiseksi. Elektroni siirtyy tässä prosessissa takaisin flaviiniin, jolloin perustilassa oleva flaviini regeneroituu. Korjattu dinukleotidi ei enää mahdu FAD:n pääsyonteloon, joten se irtoaa fotolyaasista. FAD:n ja FAD-access-ontelon tarkka rooli kryptokromien toiminnassa on edelleen epäselvä, mutta on ajateltavissa, että se voi olla mukana myös elektroninsiirtoreaktioissa.

Vaikka kromoforin (kromoforit) sisältävä PHR-alue on proteiinien konservoitunein osa, karboksiterminaalisella domeenilla on osoitettu olevan merkitystä sekä eläin- että kasvikryptokromien toiminnassa tai säätelyssä. Arabidopsiksen kryptokromien karboksiterminaalisten domeenien ilmentäminen fuusioituneena b-glukuronidaasi-entsyymiin antaa konstitutiivisen kasvuvasteen valolle myös pimeässä ilman PHR-aluetta . Sitä vastoin Drosophilan ja Xenopuksen kryptokromien PHR-alueet ovat fysiologisesti aktiivisia ilman karboksiterminaalista domainia . Drosophila Cryn karboksiterminaalinen domeeni on tärkeä proteiinin vakaudelle, vuorovaikutukselle Timin kanssa ja fotoreseptorin herkkyydelle sirkadiaanisille valosignaaleille , kun taas Xenopus Cryn karboksiterminaalista domeenia tarvitaan sen ydinalueelle lokalisoitumiseen .

Kryptokromeja säädellään fosforylaatiolla . On osoitettu, että Arabidopsiksen kryptokromit fosforyloituvat vasteena siniselle valolle ja että tämä liittyy fotoreseptorien toimintaan ja säätelyyn . Lisäksi kun Arabidopsis CRY1:tä ekspressoitiin hyönteissoluissa, sen havaittiin käyvän läpi ATP-riippuvaista ja sinisestä valosta riippuvaista autofosforylaatiota . Ei tiedetä, sitoutuvatko myös eläinten kryptokromit ATP:hen, vaikka on osoitettu, että hiiren kryptokromit fosforyloituvat .

Arabidopsis CRY1:n PHR-alueen ja ATP:n välisessä vuorovaikutuksessa on muutamia mielenkiintoisia piirteitä, jotka muistuttavat pyrimidiinidimeerin ja fotolyaasin välistä vuorovaikutusta : ATP:n fosfaattiryhmät ovat alttiina liuottimelle; adeniini- ja riboosiryhmät ovat haudattuina syvälle FAD:n kulkuonteloon; ja ATP:llä voi olla vesivälitteinen kontakti FAD:n kanssa . Arabidopsis CRY1:n pHR-alueen vuorovaikutuksesta ATP:n kanssa puuttuu myös useita proteiini-ATP-vuorovaikutuksissa yleisesti esiintyviä piirteitä, kuten proteiinin ja fosfaatin välinen vuorovaikutus, proteiinin ja Mg2+:n välinen kontakti ja läheinen seriinijäännös fosforinsiirtoa varten . CRY1:n PHR-alueen rakenteen topologian tarkastelu osoittaa kuitenkin, että kryptokromin karboksiterminaalinen domeeni voisi mahdollisesti tarjota kaikki nämä ominaisuudet (kuva 4). Havainto, että β-glukuronidaasiin fuusioidun Arabidopsis-kryptokromin seriinirikkaat karboksiterminaaliset domeenit ovat konstitutiivisesti fosforyloidut in vivo (, viittaa siihen, että fosforinsiirto voi tapahtua FAD:n pääsyonteloon sitoutuneesta ATP:stä läheiseen karboksiterminaaliseen domeeniin (kuva 4a). On myös ajateltavissa, että fotonien herättämä FAD voi käynnistää elektroninsiirron nukleotidiin ja fosforinsiirron ATP:stä karboksiterminaalisen domeenin seriinijäämiin. Koska PHR-alueen pinta on pääasiassa negatiivisesti varautunut, erityisesti paikassa, jossa karboksiterminaalinen domeeni on todennäköisesti vuorovaikutuksessa sen kanssa, fosforyloitunut karboksiterminaalinen domeeni hylkääntyisi tällöin PHR-alueen pinnalta, mikä johtaisi kryptokromin konformaation muuttumiseen. Tämä konformaatiomuutos mahdollistaisi sen vuorovaikutuksen muiden signaaliproteiinien kanssa ja valosignaalin levittämisen (kuva 4a). Vaihtoehtoisesti toinen kryptokromin molekyyli, joka sitoutuu FAD:n pääsyonteloon, voi myös tarjota puuttuvat ominaisuudet, joita tarvitaan tuottavaan ATP:n ja kryptokromin vuorovaikutukseen. Arabidopsiksessa voidaankin havaita sekä CRY2-CRY2- että CRY1-CRY2-vuorovaikutusta (D. Shalitin, X. Yu ja C.L., julkaisemattomat havainnot). Joko kryptokromien homo- tai hetero-oligomeerin muodostuminen tarjoaisi mekanismin molekyylien väliselle fosforinsiirrolle, joka voi muuttaa kryptokromien rakennetta (kuva 4b, c).