Naaraspuolisen eläimen röntgenkuvaus I. ricinus
Tässä osoitamme, että röntgen CRYTUR-asetelma (joka perustuu X-RayWorx-mikrofokukseen, röntgenlähteeseen ja CRYCAM-röntgensädeilmaisimeen) soveltuu erittäin hyvin naaraspunkkien osmiumilla kyllästettyjen sisäisten rakenteiden nopeaan ja rikkomattomaan havainnointiin. Kuvassa 1A näkyvät jalkojen toisen parin alueelle ulottuvat cheliceraaliset retraktorilihakset, kynsinauhan paksuudet, jalkojen sisällä olevat lihakset ja palpat (kuva 1A, elokuva 1). 2D-röntgenprojektiokuvista saatu 3D-malli antoi lisää paikkatietoa naaraspunkin capitulumin pinnallisista rakenteista (kuva 1B), joka on verrattavissa SEM:llä tehtyyn esikatselukuvantamiseen (kuva 1D), ja sen tuloksena oli mahdollista visualisoida myös joitakin sisäisiä rakenteita (esim. lihakset, cheliceraen ja nielun tyvitumakkeet) virtuaalisesti eri viipaleilla (kuva 1B). Röntgentomografian resoluutio oli 8,060 µm, ja se laskettiin Fourier-analyysin perusteella rekonstruoidusta virtuaalisesta viipaleesta rekonstruoidun kohteen keskellä olevassa lateraalitasossa. Rakensimme kuvaajan säteittäisesti keskiarvoistetusta tehospektristä, ja Rayleighin kriteerin perusteella arvioimme signaalin ja kohinan erottamisen rajan 8,94 prosentin etäisyydellä kohinan alarajan ja huippuarvon välillä. Koska röntgenmalli rekonstruoitiin projektiokuvista välillä 0°-180° askeleella 10°, resoluutio on teknisesti lähes isotrooppinen. Tämä resoluutio ei kuitenkaan riittänyt nymfaalisten suulakien havainnointiin (kuva 1C,D, katso sekä naaraan että nymfaalisten suulakien kokovertailu samalla suurennoksella).
Ixodes ricinus -lajin naaraan (A-C) ja nymfaalivaiheen (D) suulakkeet kuvattu röntgenkuvauksella (A,B) ja SEM-kuvauksella (C,D). (A) Röntgenprojektiokuvassa näkyvät chelicerae ankkuroituneena capitulumin pohjaan (valkoiset nuolet) ja cheliceraen retraktoriset lihakset (mustat nuolet). (B) Röntgenprojektiokuvista saatu 3D-malli antoi naaraan suupuolen topografian, joka on verrattavissa pienen suurennoksen SEM-kuvaan (C). Ainoastaan SEM-kuvausta käytettiin havainnoimaan nymfien suupuolta, myös sen sisäistä morfologiaa (D), toisin kuin naaraan kohdalla, jossa röntgentomografiasta saadut poikittaiset virtuaaliset viipaleet mahdollistivat capitulumin, cheliceraen, nielun ja kitiinieksoskeletin sisäisen rakenteellisen organisaation kuvaamisen. Palpa (P), capitulien pohja (BC), hypostomi (H), chelicerae (Ch), 1. ja 2. jalka (L1, L2). Palkit: 100 μm.
Seriaalileikkaus SEM
Seriaalileikkaus SEM
Seriaalileikkausten ultraohuiden hartsileikkausten perusteella rekonstruoitu 3D-malli I. ricinus nymfin syöntilaitteistosta paljasti syljen ja ravintokanavan suhteet kapitulaarisiin styletteihin (chelikeraeihin, hypostomiin) ja muihin liitännäisrakenteisiin, pääosin lihaksiin, ja niihin liittyviin rakenteisiin (Kuva. 2, kuvat 2 ja 3)14.
Ixodes ricinus -lajin ravitsemattoman nymfivaiheen ravintolaite. 3D-mallit (A,D,I-N) on rekonstruoitu sarjapoikkileikkauksista (B,C,E-H) capitulumin osan läpi, jotka on kuvattu takaisinsironneilla elektroneilla (sisäkuva) SEM-kuvauslaitteella JEOL 7401 F. Palkki: 25 µm.
Capitulumin ulkopuolelta sylki ja verijauho karkotetaan/imetään kapeaan rakoon, preoraaliseen kanavaan, joka muodostuu ventraalipuolella olevan hypostomin uran ja dorsaalipuolella olevien cheliceraen väliin (kuva 2A). Rhipicephalus (aiemmin Boophilus) microplus -lajissa hypostomaalisen uran päällä on ohut kalvo, jota kutsutaan myös kouruksi12. Mielenkiintoista on, että tämä rakenne puuttui Ixodes hexagonus9-, Haemaphysalis longicornus15- ja I. ricinus -lajeista. Capitulumin sisällä sylki/veri jatkuu sylkikammion onteloon, ja tämä yhteinen reitti päättyy ravintokanavan erottamiseen sylkikammiosta (kuva 2A,B). Punkin selkäpuolelta katsottuna ravintokanava sijaitsee sylkiraon alapuolella. Syljenerotus ei ole pysyvästi kiinteä rakenne, vaan se syntyy pikemminkin sijoittamalla chelicerae-kappaleet hypostomin selkäpuolen yläpuolelle. Ravintokanava erottuu yhteisestä reitistä avautumalla nieluun. Sen katto muodostuu aluksi pienestä lamellista (kuva 2B, vihreä nuoli), joka laajenee lyhyeksi sauvaksi capitulumin syvyydessä (kuva 2C,I vihreä) ja jatkuu suurempana sklerotoituneena siipimäisenä levynä (tunnetaan myös nimellä alae) (kuva 2E,I, vihreä). Kaikki nämä rakenteet muodostavat yhdessä labrumin. Labrumin alaosassa on nieluaukon vieressä hammasmainen uloke (kuva 2C,E, mustat nuolet). Tämä hammasmainen rakenne on kuvattu I. hexagonuksella, I. holocyclusilla ja Rhipicephalus microplusilla9,12,16. Hammasmainen uloke näyttää sopivan nielun suuaukon uraan, joten sen oletetaan olevan tärkeä osa nieluläppää. Tämän hammasmaisen ulokkeen tunnistaminen labrumiksi on perusteltua, koska se on samankaltainen kuin argasidipunkkien labrum, joka myös ulottuu nielun katolta ravintokanavaan13,16. I. ricinuksen ravintokanavan, pikkuruisen labrumin ja venttiilin anatominen rakenne sopii yhteen näiden punkkien hitaan ravintoprosessin kanssa, jossa pitkät imupulssit vuorottelevat syljen erityksen pulssin kanssa niiden pitkän verensyöntijakson aikana. Pehmeillä punkkeilla labrum ulottuu kuitenkin distaalisesti koko ravintokanavan pituudelta. Tämä on sopusoinnussa niiden punkkien nopean ravintoprosessin kanssa, joissa labrumin nopea räpyttely synkronoituu nopeaan imemiseen ja syljeneritykseen, jotta ravintoa saadaan vain 1-2 tunnin kuluessa13. EM-havaintojemme perusteella tämä nielun katon etuosa ei ollut yhteydessä lihaksiin ja muodostaa todennäköisesti venttiilin paikallaan pysyvän (tukevan) osan (kuva 2B). Nielun katto on yhteydessä subhypostomilevyihin, jotka muodostavat nielun sivut ja pohjan (kuva 2C, valkoiset nuolet). Nämä levyt ovat yhteydessä suuriin laajentajalihasnauhoihin, jotka ovat kiinnittyneet vastakkaisilta puoliltaan ventraaliseen kynsinauhaan. Nielun anterioriset laajentajalihakset (ADM, kuvissa 2C,E,I vaaleanpunaisina rakenteina) sijaitsevat vain nielun etuosassa, ja niiden supistuminen/rentoutuminen mahdollistaa nieluaukon venttiilin avaamisen/sulkemisen9,12. ADM on kiinnittynyt nielun etuosan yläkulmaan ja syvälle sivuille. Nielun seinämien keskiosaan liittyy toinen ryhmä laajentajalihaksia, joiden supistuminen laajentaa nielun luumenia sivulle. Nämä nielun lateraaliset laajentajalihakset (LDM) näkyvät kuvassa 2G ja syvän vaaleanpunaisina rakenteina kuvissa 2I,J. Nämä lihakset ovat nielun lateraaliset laajentajalihakset. LDM mahdollistaa nielun luumenin massiivisen laajentumisen, mikä johtuu mahdollisesti myös Arthurin ym. 9 sekä Sonenshinen ja Andersonin13 kuvaamasta kaksois-Y:n muotoisesta seinämästä nielun etuosassa (kuva 2G) ja kolmois-Y:n muotoisesta seinämästä nielun takaosassa poikittaisleikkauksessa (kuva 2H). Molempien laajentajalihasryhmien supistumisen ja rentoutumisen vuorottelu laajentaa nielua synkronoituna etuläpän avautumisen kanssa, jolloin syntyy voimakas imupulssi. LDM:n rentoutuminen nieluläpän venttiilin sulkeutumisen jälkeen puristaa nielua ja ajaa niellyn veren posteriorisesti ruokatorveen ja välikarsinaan. Nieluaukon avautumisen/sulkeutumisen ajallinen synkronointi, joka on koordinoitu nieluläpän venttiilin avautumisen ja sulkeutumisen sekä nielun keskiosan luumenin puristumisen/laajenemisen kanssa, mahdollistaa imemisen sekä ruoan siirtymisen ruokatorveen ja estää myös veren regurgitaation takaisin isäntään9,12. Nielun sisempi limakalvo on sklerotisoitunut, kun taas ruokatorven seinämää vuoraa epiteelisolut (kuva 2A). Ruokatorvi kulkee synganglion läpi ja sulautuu keskisuoleen (tietoja ei ole esitetty).
Sylkiuoma on suuri ontelo, joka sijaitsee nielun ja cheliceraen välissä (kuva 2A-E). Sylkiraon etuosa on yhteinen sekä veren että syljen kulkua varten, minkä jälkeen nielu on erotettu sylkiraon pohjasta pienellä lamellilla (ks. edellä). Sylkiuoman kattoa ja sivusivuja vahvistaa sklerotisoitunut cheliceral plate (ChP kuvissa 2C,E,F ja kuvassa 2M esitetty punainen rakenne), joka ulottuu syvemmälle punkin ruumiin onteloon. Tämän levyn sivusivut ovat sylkiosan takaosassa yhteydessä lihaksiin, jotka on kiinnitetty vastakkaisista päistä punkin ruumiinontelon sivusivuihin. Nämä lateraaliset sylkilihakset (LMS) näkyvät kuvissa 2E,F,K,L vaalean violetilla värillä merkittyinä. Lihasten supistuminen litistää levyä, joka on tiukasti kiinni sylkirauhasen seinämässä, mikä johtaa sylkirauhasen sisätilan kaventumiseen/sulkeutumiseen, kuitenkin vain sen takaosassa nielun erotuksen takana.
Lisäksi sylkiluun takimmaisen pään lattia on yhteydessä pieneen vinoon lihasryhmään (sylkiluun lattiaan kiinnittyneet lihakset, MS kuvissa 2E,F,J,N, merkitty vaaleansinisellä), joka on liitetty vastakkaisista osista nielun etuosan yläosaan. Nämä lihakset mahdollistavat syljenpohjan takaosan ylös- ja alaspäin suuntautuvan liikkeen. Nämä lihakset on kuvattu I. holocyclus -naaraalla16. Mahdollisuutta siihen, että sylkikammion lattiaa voidaan laskea tai nostaa, on ehdotettu aiemmin syljen nopean purkautumisen yhteydessä R. microplusin ja Dermacentor andersonin syljenerityksen aikana tapahtuvan sähköisten signaalien tallentamisen perusteella12,17,18,19,20. R. microplusin syljenerityksen aikana havaittiin nopeita (jopa 30 sekunnissa) alaspäin suuntautuvia johtokyvyn muutoksia, joita seurasivat suuremmat piikit syljenerityksen lopussa. Yksi selitys näille mittauksille on nielun etuosan lihasten supistuminen, johon liittyy samankaltainen ruokakanavan (hypostomaalinen kouru) yläpuolella olevan kalvon pulssaatio, joka avaa kanavan syljen poistumiselle20. Oletamme, että syljenpohjaan kiinnittyneet pienet vinot lihakset voivat synnyttää syljen liikkumista helpottavaa värähtelyä. Kuitenkin myös lateraaliset lihakset, jotka vaikuttavat sylkiraon sisätilan halkaisijaan, voivat osallistua syljen poistamiseen suupielistä (ei mukana animaatiossa). Ehdotamme, että myös chelicereiden liike isännän ihossa voi auttaa syljen karkottamisessa syljenerottimesta isännän ihoon. Cheliceraalien pohjat (ChB kuvissa 2A,B) sijaitsevat suoraan sylkiraon yläpuolella (selkäpuolelta katsottuna), ja arvelemme, että nämä rakenteet voivat paikallisesti puristaa sylkiraon auttaakseen syljen poistumista. Chelicerae-akselien pidennykset, jotka olivat hieman epäsynkronisia, havaittiin kaksifotonisella intra-vitaalimikroskopialla suoraan ravintokohdan sisällä koko I. scapularis -eläimen nielemisen ajan21. Huomasimme, että poskihampaat alkoivat liikkua hieman epäsynkronisesti sen jälkeen, kun pilokarpiinia oli levitetty ruokkimattomien ja osittain ruokittujen I. ricinus -naaraiden selkäpuolen kynsinauhaan (kuvat 5 ja 6). Cheliceraalien pohjat (ChB kuvissa 2A,B) sijaitsevat suoraan sylkiraon yläpuolella (selkäpuolelta katsottuna), ja voimme olettaa, että nämä rakenteet voivat laajentaa tai puristaa sylkiraon ja auttaa syljen poistamisessa. Pilokarpiinin, ei-endogeenisen kolinergisen lääkeaineen, käytön tiedetään aiheuttavan syljeneritystä epäsuorasti punkin keskushermoston kautta22 , mutta sen vaikutus muihin punkin kudoksiin on edelleen hämärän peitossa. Näin ollen emme voi sulkea pois sitä, että pilokarpiinin välittämää keliakroosien liikettä voitaisiin kokeissamme pitää tämän lääkkeen lisävaikutuksena punkkeihin. Bockenstedt et al. ehdottivat, että chelicerae pakottaa takaisin kollageenikuituja, jotka saattavat puristaa ruokintapaikkaa, mikä vahvistaa suuresti hypoteesejamme chelicerae-välitteisestä syljen karkottamisesta isäntään21.
Hetkellä ennen sylkiontelon loppua parittaiset sylkykanavat astuvat sen sivukulmiin12. Molempia sylkykanavia ympäröi kudoslevy (TSD kuvissa 2C,E,F,M,N, tummanvioletti), joka todennäköisesti kiinnittää sylkykanavat joustavasti sylkykotelon sivukulmiin.
Syljenerityksen ja veren imemisen simulointi 3D-mallin perusteella
Iksodidipunkkien ruokailun aikana syljeneritys vuorottelee joko hitaan tai nopean veren imemisen kanssa, ja se voi sisältää myös lepojakson. Kumpaankin toimintaan naaraan nielemisen aikana käytetyn ajan prosenttiosuudet vaihtelevat ja perustuvat muun muassa vuorokaudenaikaan ja punkkien kokoon18. Elokuvassa 4 animoimme sekä ravintokanavan että syljen kulkukanavan ja niihin liittyvät rakenteet ja näytämme, miten nämä rakenteet toimivat. Useimpien ixodid-punkkien ravintoprosessi alkaa sementin kaltaisten aineiden erittymisellä, minkä ansiosta punkki kiinnittyy isännän ihoon ja sulkee ravintovaurion ja sen sisään työnnettyjen suulakkeiden välisen raon23,24,25. Syljeneritysjakso voi päättyä lyhyeen syljeneritykseen16,17,18,19. Syljeneritystä helpottaa luultavasti syljenerotusaltaan lattian takaosan värähtely; myös poskionteloiden pohjien liike voi vaikuttaa asiaan (kuva 6). Ennen kuin veren imeminen alkaa, sylkiraon takaosan aukkoa kaventavat sylkiraon katon ja punkin rungon sivuseinämän väliin venytetyt lateraalilihakset. Tätä toimintaa seuraa nieluläpän avautuminen ja nielun etuosan laajentuminen, joka johtuu etuosan laajentajalihasten supistumisesta. Tämän jälkeen nielun keskiosa venyy pituussuuntaista akselia pitkin ja veri imeytyy nieluun. Nielun etuläppä sulkeutuu ennen kuin nielun seinämä supistuu uudelleen ja veri työntyy taaksepäin ruokatorveen. Tämä peristalttinen aalto toistuu, kunnes syljeneritys alkaa. Syljenerityksen alkaessa sylkirauhasen lateraaliset restriktorilihakset rentoutuvat, jolloin sylkirauhasen ontelo laajenee. Sylkikammion katon toistuva laskeminen ja nostaminen sen takaosassa todennäköisesti helpottaa syljen kulkeutumista preoraaliseen kanavaan.