Klonogeenista määritystä on käytetty lukuisissa tutkimuksissa kvantifioimaan klonogeenista kasvua ja sen kumoamista sytotoksisilla ärsykkeillä, mukaan lukien säteilyllä, kemoterapeuttisilla lääkeaineilla ja / tai molekyylisesti kohdennetuilla tekijöillä, in vitro. Nykyinen vakiomenetelmä eloonjäämisosuuksien määrittämiseksi perustuu oletukseen, että klonogeeninen kasvu käsitellyissä soluviljelmissä voidaan normalisoida käsittelemättömiin kontrolleihin jakamalla solulinjakohtaisella, vakio PE:llä.
Tässä osoitamme kuitenkin, että tämä ei ole yleisesti sovellettavissa. Sen sijaan tietomme osoittavat selvästi, että viljelymaljalle kylvetyn solumäärän ja saatujen pesäkkeiden määrän välinen korrelaatio ei suinkaan aina ole lineaarinen. Yhteistyökykyisten solulinjojen osalta klonogeenisen selviytymistiedon PE-pohjainen analyysi tuotti tuloksia, joissa oli suuria tai jopa valtavia määrityksen sisäisiä virheitä. Vaikka analyysissä käytettiin vain viljelymaljoja, joissa oli kohtuullinen määrä pesäkkeitä (C = 5-100), klonogeeniset eloonjäämisosuudet tietyllä annoksella poikkesivat toisistaan paljon yli yhden suuruusluokan verran solulinjoissa, joissa solujen yhteistyöaste oli korkea. Huomattakoon, että käytännössä mikä tahansa eloonjäämiskäyrä (jyrkkä tai litteä, kohtalaisesti tai voimakkaasti kaareva, lineaarinen, kvadraattinen tai epäsäännöllinen) voidaan johtaa tästä tietystä aineistosta laskettujen tulosten vaihteluvälistä – havainto, jolla voi olla erityistä merkitystä sädehoitobiologeille.
Kokonaisuutena aineistomme osoittavat, että perinteinen PE:hen perustuva klonogeenisten eloonjäämiskäyrästöjen analyysi toimii epätarkoituksenmukaisella tavalla heti, kun soluyhteistyötä esiintyy yhdessä tai useammassa olosuhteessa koejärjestelyjen sisällä, ja että eloonjäämiskäyrästöjen saadut eloonjäämiskäyrästötulokset poikkeavat toisistaan tyydyttävän suurella alueella. Erityisesti tulokset vääristyvät voimakkaasti, jos vain yksi tai muutama samankaltainen solutiheys istutetaan. Tämä käytäntö synnyttää testin sisäisiä virheitä, jotka ovat suora seuraus valituista solutiheyksistä ja jotka eivät siten sovellu tilastollisiin virheanalyyseihin. Yhteistyössä kasvavien solulinjojen osalta havaintomme voivat osittain selittää raportoidut tutkimusten, tutkijoiden ja laboratorioiden väliset epäjohdonmukaisuudet hoitovastetta koskevissa tiedoissa. A549:n pesäkkeiden muodostusmääritystietojen meta-analyysi tukee tätä hypoteesia entisestään: Nuryadi et al. raportoivat 156:sta eri tutkimuksesta koostuvassa paneelissa, että SF4-arvot vaihtelivat tämän solulinjan osalta 5-90 %:iin, ja SF4:n interkvartiiliväli oli yli 25 % . Vaikka erilaiset muut parametrit voivat varmasti vaikuttaa hoitovastetta koskeviin tietoihin, päättelemme tietojemme perusteella, että soluyhteistyö on merkittävä tekijä, joka selittää tutkimusten välistä vaihtelua. Koska pienetkin erot klonogeenisten eloonjäämisosuuksien välillä voivat rohkaista tutkijoita esittämään ja tutkimaan uusia tieteellisiä hypoteeseja, jotka saattavat lopulta perustua väärään tarkkuuteen, kehitimme uudenlaisen analyysimenetelmän, joka on vähemmän altis solutiheyden vaikutuksille – erityisesti, mutta ei ainoastaan yhteistyössä kasvaville solulinjoille. Tässä menetelmässä otetaan huomioon epälineaariset suhteet kylvettyjen solujen lukumäärän ja pesäkkeiden lukumäärän välillä, jotka saadaan pisteyttämällä viljelymaljat, joihin on kylvetty laaja valikoima solujen lukumääriä kaikissa käsittelyolosuhteissa.
Matemaattisesti lähestymistapamme käyttää tehoregressiota ja interpolointia sovitettujen pesäkkeiden lukumääristä eri säteilytysannoksilla. Sovellettuna aivan samaan aineistoon, jota käytettiin PE-pohjaisissa laskelmissa, se antoi selvästi vakaampia, solutiheydestä riippumattomia tuloksia. Tarkkasilmäiset lukijat ovat ehkä huomanneet, että tässä esitetyn menetelmän mukaisesti suoritetut eloonjäämisosuuden laskelmat perustuvat yksinomaan tehoregressiosta saatuihin kertoimiin a ja eksponenttiin b. Nämä kertoimet ovat kuitenkin hyvin erilaisia. Vaikka tämä luonnollisesti kompensoi soluyhteistyön vaikutuksia, siihen liittyy toinen virheen laatu, joka johtuu regression epätarkkuudesta ja jota ei voida verrata kvantitatiivisesti vastaavaan virheen laatuun PE:hen perustuvissa eloonjäämisosuuslaskelmissa. Näin ollen tämä virhe olisi minimoitava varmistamalla huolellinen koesuunnittelu riittävällä määrällä riippumattomia toistoja. Lisäksi eloonjäämisfraktiolaskelmat olisi suoritettava vain sellaisten tehoregressiotulosten kanssa, joiden suorituskyky on asianmukainen, kuten regressiokerroin R osoittaa.
Matemaattinen lähestymistapamme periaatteessa korvaa PE-pohjaiset klonogeneettiset eloonjäämislaskelmat kysymyksellä:
Kuinka monta kertaa enemmän soluja on kylvettävä käsiteltyyn viljelymaljaan, jotta saadaan aikaan samanlainen määrä pesäkkeitä kuin vertailulautasessa?
Eksponentti b on tässä suhteessa erityisen tärkeä. Se osoittaa, onko kylvettyjen solujen määrän ja laskettujen pesäkkeiden määrän välinen korrelaatio lineaarinen (b ≈ 1) vai ei. Korkeat b-arvot, kuten BT20- ja SKLU1-soluille saadut arvot, osoittavat, että solujen kasvu in vitro hidastuu (tai katkeaa kokonaan), jos kasvatusalustan tilavuutta solua kohti kasvatetaan – joko käyttämällä suuria määritystilavuuksia tai vähentämällä kylvettyjen solujen määrää. On korostettava, että b-arvot eivät missään tapauksessa ole spesifisiä tietylle solulinjalle, vaan pikemminkin seurausta valitusta soluviljelyalustasta, useista testin inkubaatioparametreista ja kokeellisesta menettelystä, johon sisältyy käytännössä kaikki seikat, jotka voivat vaikuttaa sellaisten solujen klooniseen kasvuun, jotka ovat äärimmäisessä stressitilanteessa, kun ne istutetaan yksittäisinä soluina, kuten elatusaineen formulointi, ravintoaineiden ja kasvutekijöiden lisääminen, solujen erottelussa käytetyt menetelmät, muovitavarat jne. Esimerkiksi lähes valuvien BT20-solujen ehdollistetun väliaineen käyttö heikensi voimakkaasti BT20-solujen yksittäisten solujen yhteistoiminnallista käyttäytymistä, kun taas tällä menettelyllä ei ollut vaikutusta ei-yhteistoiminnallisesti kasvavien MDA-MB231-solujen klonogeeniseen kasvuun. Lisäksi yhteistyöhön kykenevien BT20-solujen kaksinkertaistumisaika riippui sekä testin inkubaatioajasta että solutiheydestä kuopassa, mikä antaa itsestään selvän biologisen selityksen PE:hen perustuvilla laskelmilla saaduille epätäsmällisille klonogeneettisille eloonjäämisosuuksille: Proliferoivan soluklusterin kasvunopeus voi yksinkertaisesti olla liian hidas, jotta se ei saavuttaisi 50 solun kynnysarvoa pesäkettä kohti määrityksen inkubaatioajassa. Näin ollen esimerkiksi 35 hitaasti lisääntyvän soluryhmän näennäinen ”ei-kloonisuus” pysäytyshetkellä on vain väistämätön seuraus testin inkubaatioajasta, joka on ainakin jossain määrin mielivaltaisesti valittu. Tässä yhteydessä analysoimme lisäksi inkubaatioajan vaikutusta saatuihin klonogeenisiin eloonjäämisfraktioihin ja havaitsimme, että lopettamisajankohdan määrittäminen pelkän kontrollimaljojen tarkastelun perusteella ei riitä, kuten muut ovat ehdottaneet: Inkubaatioajan ennenaikainen päättäminen voi johtaa erittäin alhaisiin eloonjäämisfraktioihin aggressiivisemmin käsitellyillä levyillä, joilla vaurioiden korjaaminen ennen solukasvun jatkamista vaatii lisäaikaa.
Tärkeää on, että tietomme ovat täysin samansuuntaisia kuin uraauurtavien soluviljelytutkijoiden 1940- ja 1950-luvuilla tekemät merkittävät havainnot, ja ne yksinkertaisesti heijastavat ilmiötä, jota tutkittiin tuolloin laajasti. Puck ja kollegat julkaisivat ensimmäisenä säteilytettyjen yksittäisten solujen eloonjäämiskäyrän vuonna 1956. Suurin tieteellinen haaste tälle perustavanlaatuiselle saavutukselle oli kuitenkin nisäkässolujen soluviljelyn tuohon aikaan ratkaisematon ongelma: Solulinjat lakkasivat kasvamasta in vitro heti, kun soluja istutettiin pienellä tiheydellä. Tämän ongelman yrittivät ratkaista vuonna 1948 Sanford ja muut, jotka onnistuivat kasvattamaan yksittäisistä soluista peräisin olevia fibroblastipesäkkeitä pienissä kapillaareissa, joissa soluista peräisin olevien tekijöiden diffuusio väliaineeseen oli voimakkaasti vähentynyt, mikä mahdollisti riittävän autokriinisen kasvustimulaation. He totesivat, että viljeltyjen solujen on tärkeää esikäsitellä elatusainetta, ja totesivat, että soluviljelyalusta, joka riittää mahdollistamaan suuritiheyksisen soluviljelmän äärettömän kasvun, on itse asiassa ”kaukana optimaalisesta yksittäisen solun kasvulle”. Tämän mukaisesti Earle et al. kuvasivat, että kyseisen solutyypin kasvattaminen hyvin alhaisella tiheydellä johti solukuolemaan , ja tämä työ muodosti perustan Puckin ja Marcuksen vuonna 1955 tekemälle ensimmäiselle julkaisulle nisäkässolujen klonogeenisesta kasvusta in vitro . He käyttivät HeLa-yksisoluista ja vahvasti säteilytetyistä saman tyyppisistä syöttösoluista koostuvaa rinnakkaisviljelyjärjestelmää, jonka innoittajana oli ilmastoidun elatusaineen tarve yksittäisten solujen kasvun helpottamiseksi. He päättelivät aiempien tutkimusten mukaisesti, että yksittäisten solujen kasvun estyminen suurissa testitilavuuksissa johtui ”lyhytikäisen, diffusoituvan tekijän häviämisestä” . Myöhemmissä julkaisuissa, kuten julkaisussa, jossa esitettiin ensimmäinen säteilytettyjen nisäkässolujen eloonjäämiskäyrä, Puck ja kollegat jättivät usein syöttökerrosten käytön pois, koska he olivat kehittäneet kehittyneitä viljelytekniikoita, jotka mahdollistivat yksisoluisen kasvun 100-prosenttisella PE:llä ilman kasvutekijöiden syöttösoluilla tapahtuvaa lisäystä. He totesivat, että huolelliset pesu- ja trypsinisointiprotokollat olivat tässä suhteessa olennaisen tärkeitä, ja keksivät termin ”yhteistoiminta” kuvaamaan sitä, että viljelymaljassa olevat solut voivat erota toisistaan sekä genotyypin että fysiologisen tilan suhteen . Tuloksemme toistavat nämä havainnot: Havaitsimme 50 syöpäsolulinjan paneelissa, että yksittäisten solujen suboptimaalinen kasvu nykyaikaisissa, standardoiduissa kasvatusmedioissa, joita on täydennetty FCS: llä, on edelleen hyvin yleinen ilmiö, kuten voidaan päätellä havainnosta, että yli puolet solulinjoista osoitti yhteistyöhön perustuvaa kasvukäyttäytymistä. Näin ollen, jos tietylle solulinjalle havaitaan suboptimaalisia PE:itä, klonogeneettinen määritys todennäköisesti havaitsee samanaikaisesti sekä kiinnostavan hoidon vaikutuksen että solujen yhteistyön vaikutuksen. Tässä tutkimuksessa ei ollut tarkoitus tunnistaa erityisiä kasvua tukevia tekijöitä, jotka voisivat vaikuttaa analysoitujen solulinjojen PE:hen. Oletamme kuitenkin, että tietyn solulinjan yksittäisten solujen epäoptimaaliset kasvuolosuhteet voivat johtua hyvin erilaisista parametreista, kuten klassisten kasvutekijöiden ja/tai hormonien (esim. epidermaalisen kasvutekijän tai estrogeenin) alhaisista pitoisuuksista, mutta myös erilaisista matala- ja korkeamolekyylipainoisista aineenvaihduntatuotteista, joiden suhteen ainakin murto-osalla yksittäisistä soluista on aksotrofia. Lisäksi yksittäisten solujen ravinnelisäykseen viljelymaljassa vaikuttavat todennäköisesti ympäröivän väliaineen ja muovitavaran fysikaalis-kemialliset parametrit, mukaan lukien vastaavien auxotrofisten tekijöiden proteiinisidonnaisuuden aste tai niiden adsorptio muovin pintaan. Teoriassa tähän ongelmaan voitaisiin puuttua toteuttamalla toimenpiteitä, joilla palautetaan PE:n maksimiarvo alhaisen tiheyden olosuhteissa siten, että S:n ja C:n välinen lineaarinen korrelaatio (palautuu) (b = 1). Puckin suositukset syöttösolujen, ilmastoidun väliaineen ja/tai yksittäisten solujen upottamisesta pehmeään agariin voivat olla riittäviä tämän saavuttamiseksi tietyissä solulinjoissa, ja niiden pitäisi lisätä PE:hen perustuvien laskelmien kestävyyttä vastaavasti. On kuitenkin ilmeistä, että voi olla enemmän kuin haastavaa tarkentaa ja standardoida määritysolosuhteita siten, että yksittäisten solujen eloonjäämis- ja kasvunopeudet ovat optimaaliset jokaiselle kiinnostavalle yksittäiselle solutyypille. Päätimme hyväksyä suboptimaaliset määritysolosuhteet yksittäisten solujen kasvua varten ja kehitimme sen sijaan laskennallisen menetelmän klonogeneettisen eloonjäämisdatan analysointia varten, jossa otetaan huomioon tämä hyvin kuvattu ilmiö. On selvää, että voimaperäistä regressiota ja interpolointia käyttävä lähestymistapamme ylitti 1950-luvun tekniset mahdollisuudet, kun eloonjäämisdataa sovitettiin silmämääräisesti . Jotenkin soluyhteistyön merkitys kuitenkin siirtyi seuraavien vuosikymmenten aikana syrjään. Vaikka ajan mittaan raportoitiin muutamia raportteja pesäkkeiden muodostusmääritysten epälineaarisuudesta, PE-pohjaisten analyysien rajallista suorituskykyä ei käsitelty .
Interenkiintoista on, että näissä tutkimuksissa raportoitiin pesäkkeiden lukumäärän vähemmän kuin lineaarisesta kasvusta kylvettyjen solujen lukumäärän kasvaessa tiettyjen solutyyppien kohdalla tietyissä olosuhteissa. Tämän mukaisesti saimme muutamille paneelimme solulinjoille myös b-arvoja, jotka olivat hieman alle 1,0. Kolme erilaista skenaariota voi selittää tämän havainnon, joista kaksi johtuu metodologisista artefakteista: Ensinnäkin b-arvot, jotka ovat hieman alle 1,0, voivat johtua siitä, että lasketaan kuoppia, joissa on paljon umpeenkasvaneita pesäkkeitä ja joissa tutkija ei huomaa pieniä pesäkkeitä (ks. kuopat, jotka on merkitty ”nd”-merkinnällä kuvassa 1a). Toiseksi, solujen kasvu maljoissa, joissa solujen määrä on suuri, voi estyä melko varhaisessa vaiheessa ravinnepitoisuuden nopean laskun vuoksi, jolloin pesäkkeitä ei synny. Kolmas – ja biologisesti vähemmän intuitiivinen – vaihtoehto on solujen kasvun kilpaileva käyttäytyminen, joka johtuu esimerkiksi kasvua estävien tekijöiden erittymisestä. On tärkeää, että mikä tahansa näistä ilmiöistä otetaan huomioon regressio- ja interpolointimenetelmällä, koska siinä otetaan huomioon kaikki poikkeamat lineaarisuudesta, jotka näkyvät b-arvossa.
Lisäksi on huomionarvoista, että eri solulinjojen b-arvot käsittelemättömissä ja säteilytetyissä olosuhteissa eivät ole identtiset. Suurimmassa osassa näistä tapauksista säteilytettyjen solujen b-arvot ovat yleensä korkeampia kuin käsittelemättömien kontrollien vastaavat b-arvot, mikä osoittaa, että solujen yhteistyö lisääntyy säteilytyksen yhteydessä. Näin ollen C = 5-100 pesäkkeelle saatujen eloonjäämisosuuden arvojen vaihteluväli on laajempi kuin lähes identtisten b-arvojen tapauksessa (ks. solulinjat HCC1806 ja A549). Tämä merkitsee sitä, että teknisesti ei ole mahdollista saada tarkempia eloonjäämisarvoja klonogeenisen määritysmenetelmän avulla, ellei analyysiä varten valita yhtä kiinteää pesäkemäärää (C). Lisäksi solulinjat, joissa käsiteltyjen solujen b-arvot ovat erittäin korkeat, voivat olla erityisen kiinnostavia hoitoresistenssitutkimusten kannalta. Esimerkiksi tietyn solutyypin erittämä(t) säteilyn aiheuttama(t) eloonjäämistekijä(t) saatetaan tunnistaa, koska b-arvo on vastaavasti korkea.
Yhteenvetona voidaan todeta, että tietomme osoittavat, että pesäkkeiden muodostuskokeista saatuja tietoja on analysoitava huolellisesti ja että on otettava huomioon solujen yhteistoiminnan aliarvioitu vaikutus eloonjäämisfraktiolaskelmiin. Tämä voi lisätä huomattavasti klonogeneettisen kokeen luotettavuutta – ja kaikkien siihen perustuvien hypoteesien kestävyyttä.