Kirjahylly

Korjaavat tekijät ja tunnistussignaalit

Mallijärjestelmä entsyymikorvaushoitoa varten syntyi tutkimuksista, joissa viljeltiin ihofibroblasteja, jotka on saatu potilaista, joilla on mukopolysakkaridien varastosairaus (MPS). Tällaiset fibroblastit osoittivat glykosaminoglykaanien liiallista kertymistä, minkä tulkittiin johtuvan näiden makromolekyylien riittämättömästä hajoamisesta . Sattumalta havaittiin, että MPS I:tä (Hurlerin oireyhtymä) ja MPS II:ta (Hunterin oireyhtymä) sairastavilta potilailta peräisin olevien fibroblastien seoksessa oli normaali glykosaminoglykaanien aineenvaihdunta (kuva 1) . Näiden kahden sairauden tiedettiin olevan geneettisesti erilaisia, sillä MPS I periytyy autosomaalisesti resessiivisesti ja MPS II on X-sidonnainen sairaus, minkä vuoksi Fratantoni ja muut päättelivät, että eri genotyyppien fibroblastit antoivat toisilleen puuttuvan geenituotteen. Jatkotutkimukset osoittivat, että geneettisesti erilaisten solujen ei tarvinnut olla kosketuksissa toisiinsa, jotta tällainen ristiinkorjaus olisi mahdollista, sillä yhden solun ehdollistama väliaine voi olla korjaava toiselle solulle. Ristiinkorjausstrategia voitaisiin ulottaa koskemaan toisiinsa liittyviä sairauksia – soluilla, jotka korjaavat toisiaan, olisi erilainen genotyyppi, kun taas soluilla, jotka eivät tee ristiinkorjausta, olisi sama genotyyppi (ks. kuitenkin tärkeä poikkeus jäljempänä).

Koska Hurlerin oireyhtymää oli pidetty lysosomaalisena varastosairautena sen perusteella, että sairastuneilla potilailla oli havaittu dramaattisesti turvonneet maksan lysosomit , Fratantoni ym. esittivät hypoteesin, että konditionoidussa väliaineessa olevat ”korjaavat tekijät” saattoivat olla lysosomaalisia entsyymejä, joita toinen solulinja eritteli ja jotka toinen solulinja endosytoi. Korjaavat tekijät eivät kuitenkaan vastanneet mitään tuolloin tunnettua lysosomaalista entsyymiä (tilanne muuttui pari vuotta myöhemmin, kun löydettiin β-glukuronidaasin puutos MPS ). Hurlerin ja Hunterin korjaavat tekijät puhdistettiin, mutta ei ehdollistetusta väliaineesta vaan virtsasta, joka on suhteellisen runsaasti lysosomaalisia entsyymejä sisältävä kehon neste. Puhdistetuille tekijöille määritettiin funktio käyttämällä erilaisia biokemiallisia menetelmiä, minkä tuloksena Hurlerin ja Hunterin korjaavat tekijät nimettiin α-l-iduronidaasiksi ja iduronaattisulfataasiksi.

Soluissa, jotka tarvitsivat Hurlerin korjaavaa tekijää normalisoidakseen glykosaminoglykaanimetaboliaansa (Hurlerin oireyhtymää sairastavilta potilailta ja Scheien oireyhtymää sairastavilta potilailta saatujen DNA:n proteiinien perusteella) esiintyi myös α-l-iduronidaasiaktiivisuuden puutetta ). Hurlerin fibroblastien korjaukseen liittyi α-l-iduronidaasin otto. Entsyymikorvaushoidon kannalta hyvänä enteenä voidaan todeta, että imeytyminen oli huomattavan tehokasta ja että vain hyvin pieni määrä α-l-iduronidaasia oli sisäistettävä täydellisen korjauksen aikaansaamiseksi.

Tämä olisi saattanut olla tarinan loppu, ellei entsymaattisen aktiivisuuden ja korjaavan aktiivisuuden eluointikuviossa hydroksiapatiittikolonnista olisi ollut pientä ristiriitaisuutta , mikä viittaisi siihen, että Hurlerin korjaavan tekijän molemmat aktiivisuudet eivät olleet täsmällisesti samanlaisia. Tämän ristiriidan jälkeen Shapiro et al. erottivat α-l-iduronidaasin korjaaviin ja ei-korjaaviin fraktioihin hepariini-Sepharoosipylväässä, mikä osoittaa, että korjaavalla tekijällä oli jokin ominaisuus, jota ei tarvittu katalyyttiseen aktiivisuuteen, mutta jota tarvittiin imeytymiseen. Vastaavasti löydettiin useita β-glukuronidaasin muotoja, jotka erosivat toisistaan imeytymisen ja korjaavan aktiivisuuden suhteen .

Lysosomaalisen entsyymin imeytymiselle spesifisen signaalin olemassaoloon viittasivat tulokset, jotka saatiin tutkimuksessa, jossa tutkittiin äskettäin löydettyä MPS:ää muistuttavaa sairautta, joka oli nimetty inkluusiosolusairaudeksi (I-solusairaudeksi) viljelemissäsi fibroblasteissa olevien huomattavien faasitiheiden sulkeutumien vuoksi . Vaikka näillä fibroblasteilla oli useita lysosomaalisten entsyymien puutoksia, niitä ympäröivässä väliaineessa oli runsaasti lysosomaalisia entsyymejä . I-solutaudin fibroblastien erittämät entsyymit eivät kuitenkaan endosytoituneet muihin soluihin eivätkä olleet korjaavia; oletettavasti niiltä puuttui signaali, joka mahdollistaisi niiden ottamisen lysosomeihin . Koska tämä yksittäinen geenivirhe vaikutti useisiin lysosomaalisiin entsyymeihin (I-solutauti periytyy autosomaalisesti resessiivisesti), signaalin oletettiin olevan entsyymiproteiinien translaation jälkeinen modifikaatio. Lisäksi sen oletettiin olevan luonteeltaan hiilihydraatti, koska se voitiin tuhota lievällä periodaattikäsittelyllä. Käsitykseen hiilihydraatteihin perustuvasta tunnistusjärjestelmästä vaikuttivat voimakkaasti Ashwellin ja kollegoiden havainnot hiilihydraattien merkityksestä kiertävien glykoproteiinien imeytymisessä maksaan .

Spesifisen tunnistettavan signaalin olemassaolo merkitsi kyllästettävää, reseptorivälitteistä prosessia, ja se viittasi siihen, että lysosomaalisten entsyymien imeytyminen noudattaisi Michaelis-Mentenin kinetiikkaa. Odotettiin, että tunnistussignaalien analogit käyttäytyisivät kilpailevina imeytymisen estäjinä. Tätä odotusta tutkittiin vastaavien puutteellisten fibroblastien α-l-iduronidaasin ja β-glukuronidaasin ottamisen avulla. Kaplan et al. havaitsivat, että paras β-glukuronidaasin oton estäjä oli mannoosi-6-fosfaatti (M6P), ja he ehdottivat, että M6P oli (tai oli osa) kauan etsittyä tunnistussignaalia, mikä oli hätkähdyttävää, koska nisäkkäiden glykoproteiineissa ei ollut aiemmin todettu olevan fosforyloituja hiilihydraatteja. Se vahvistettiin välittömästi α-l-iduronidaasin ja muiden lysosomaalisten entsyymien ottamisen osalta käyttämällä erilaisia biokemiallisia menetelmiä ; lopullinen todiste saatiin fosforyloitujen hiilihydraattiryhmien rakenneanalyysistä . Endosytoosin kautta löydetty signaali osoittautui myös signaaliksi, jonka avulla syntymässä olevat hydrolaasit voidaan kohdistaa lysosomeihin .

I-solusairauden vika, joka estää soluja syntetisoimasta M6P-tunnistussignaalia, osoitettiin olevan M6P-signaalin synteesiin osallistuvasta kahdesta entsyymistä ensimmäisen puutos . Kaksi M6P-reseptoria löydettiin; M6P-reseptorien kemiasta ja biologiasta sekä niiden roolista solujen liikkeessä tuli laaja ja hyvin aktiivinen solubiologian ala . Näistä aiheista on laadittu useita katsauksia, kuten tämän teoksen luvut 3 ja 5. M6P-järjestelmän merkitystä entsyymikorvaushoidolle käsitellään jäljempänä.

Samanaikaisesti näiden viljellyillä fibroblasteilla tehtyjen tutkimusten kanssa löydettiin in vivo -järjestelmässä toinenkin signaali lysosomaalisten entsyymien ottoa varten. Useiden rotille suonensisäisesti ruiskutettujen lysosomaalisten entsyymien havaittiin poistuvan nopeasti verenkierrosta; ne säilyivät kuitenkin paljon pidempään, jos niitä esikäsiteltiin periodaatilla tai jos niitä ruiskutettiin yhdessä agalaktoglykoproteiinin kanssa . Jälleen kerran hiilihydraattien oletettiin tarjoavan signaaleja spesifistä tunnistamista varten. Tässä tapauksessa tunnistamisen kannalta keskeinen sokeri oli mannoosi, ja imeytyminen tapahtui maksan retikuloendoteelisoluihin. Mannoosireseptorin, joka tunnistaa N-asetyyliglukosamiinin ja l-fukoosin sekä mannoosin, osoitettiin esiintyvän makrofagien pinnalla. On historiallisesti mielenkiintoista, että invertaasin imeytymiskokeet, jotka olivat näkyvästi esillä alkuperäisessä entsyymikorvaushoitoehdotuksessa (ks. edellä ), onnistuivat, koska invertaasi on glykoproteiini, jonka mannaaniketjut tunnistaa mannoosireseptori.