Tulokset ja pohdinta
Ymmärtää paremmin emästen erkaantumiskorjauksesta ja spontaanista depurinaatiota/depyrimidinaatiota in vivo johtuvien AP-saittien muodostumista ja korjausta, mittasimme endogeenisten AP-kohtien lukumäärää aikuisten rottien eri kudoksista ja siirtokykyisestä ihmismaksasta uutetusta genomisesta DNA:sta ASB-testillä (3). Endogeenisten AP-kohtien määrä vaihteli suuresti kudosten välillä (kuva 1)⇓ mutta ei kudosten sisällä. Eniten AP-paikkoja havaittiin aivoissa, 30 AP-paikkaa 106 nukleotidia kohti, ja seuraavina olivat sydän ja paksusuoli. Sitä vastoin rotan maksassa, munuaisissa ja keuhkoissa oli johdonmukaisesti vähiten AP-paikkoja (8-9 AP-paikkaa 106 nukleotidia kohti). Ihmisen maksassa endogeenisten AP-kohtien määrä oli verrattavissa rotan maksan määrään. Nämä tiedot osoittavat, että AP-kohtien määrä on 50 000-200 000 nisäkässolua kohti normaaleissa fysiologisissa olosuhteissa. AP-kohtien vakiotilamäärän genomisessa DNA:ssa pitäisi heijastaa tasapainoa AP-kohtien muodostumisen ja korjautumisen välillä. Mahdollisia tulkintoja aivojen endogeenisten AP-kohtien suuremmasta määrästä ovat seuraavat: (a) suurempi depurinaation ja/tai endogeenisen DNA-adduktien muodostumisnopeus, mikä johtaa useampiin AP-kohtiin; (b) DNA-glykosylaasin suurempi aktiivisuus, mikä indusoi useampia AP-kohtia; (c) tyypin II AP-endonukleaasin alhaisempi aktiivisuus, mikä aiheuttaa AP-kohtien kasaantumista; ja (d) dRp-aseman tai β-eliiminaation alhaisempi tehokkuus, mikä johtaa 5′-nikkelöityjen AP-kohtien jäämiseen.
Endogeeniset AP-kohdat rotan ja ihmisen kudoksissa. DNA uutettiin 4 °C:ssa ehjistä rottien kudoksista ja ihmisen normaalista maksasta, ja AP-kohtien määrä mitattiin ASB-määrityksellä. A, tyypillinen röntgenfilmi, jossa näkyy rottien kudosten endogeeniset AP-kohdat. DNA (mukaan lukien vakioidut DNA-näytteet) ladattiin NC-kalvolle (1,5 μg aukkoa kohti). B, rotan ja ihmisen kudosten endogeenisten AP-kohtien densitometrinen skannausdata. Pylväät, keskiarvot viidestä kahdeksaan yksittäistä näytettä sisältävistä kaksoiskappaleista; pylväät, SD.
Pääprosessi AP-kohtien korjauksessa on tyypin II AP-endonukleaasi-/β-pol-riippuvainen reitti (7). Tyypin II AP-endonukleaasi pystyy tunnistamaan AP-kohdat ja viiltämään fosfodiesterirunkoa välittömästi 5′ vauriosta, jolloin jäljelle jää 3′-hydroksyyliryhmä ja 5′-AP-kohdan pääte (5). Tämän jälkeen 5′-dRp vapautuu ja yhden nukleotidin aukko täyttyy. On osoitettu, että nisäkässolujen ytimessä on merkittäviä määriä tyypin II AP-endonukleaasia (8). Aiemmin osoitimme, että ASB-testin ja tyypin II AP-endonukleaasin tai NaOH:n yhdistelmä indusoi AP-kohtien 3′- tai 5′-halkaisun (3). Ymmärtääksemme AP-endonukleaasin ja dRp-ase in vivo -aktiivisuutta optimoimme edelleen AP-kohtien pilkkomiskokeen. Tässä kokeessa käytimme Exo III:a tyypin II AP-endonukleaasina AP-kohtien 3′-silpoutumisen tunnistamiseen ja putressiiniä 5′-nikkien havaitsemiseen (kuva 2)⇓. Tämän AP-kohtien pilkkomismäärityksen karakterisoimiseksi inkuboimme lämpö- ja happopuskurissa DNA:ta, jota oli esikäsitelty MX:llä AP-kohtien määrän vähentämiseksi 3,8 ± 0,5 AP-kohtaan 106 nukleotidia kohti (keskiarvo ± SD). Eri lämpö/happo-inkubointijaksot indusoivat 11, 47, 115 ja 320 AP-paikkaa 106 nukleotidia kohti. Yksittäinen Exo III -käsittely vähensi AP-kohtien määrää 4-10 AP-kohdetta 106 nukleotidia kohti kussakin DNA-näytteessä riippumatta niiden alkuperäisestä määrästä (kuva 3)⇓. Tämä väheneminen voi johtua Exo III:n 5′-puolen entsymaattisen viiltämisen ja AP-kohtien epäspesifisen 3′-hajautumisen yhdistelmästä Exo III:n kanssa inkuboinnin aikana. Tämä epäspesifinen 3′-hajautuminen esti DNA:n 3′-nikkelöityjen AP-kohtien lukumäärän tarkan määrityksen tällä määrityksellä. Sitä vastoin putressiinikäsittely ei vähentänyt AP-kohtien määrää. Inkuboinnin jälkeen Exo III:lla ja sen jälkeen putressiinilla AP-kohtien määrä väheni alkuperäiseen AP-kohtien määrään vasikan kateenkorvan DNA:ssa, jota oli esikäsitelty MX:llä. AP-kohtien pilkkoutumistehokkuus Exo III:n ja putressiinin yhdistelmällä oli >99 %.
AP-kohtien pilkkomismäärityksen kaava. Ymmärtääksemme paremmin tyypin II AP-endonukleaasin sekä dRp-ase in vivo -aktiivisuutta määritimme AP-kohtien 5′- tai 3′-puolella olevien pilkkoutumien olemassaolon genomisessa DNA:ssa. Putressiini ja Exo III (tyypin II AP-endonukleaasi) jättävät 3′- ja 5′-leikattuja AP-kohtia. Kun kyseessä ovat ehjät AP-kohdat, joissa AP-kohtien 3′- ja 5′-puolella ei ole viiltoja, ASB-määrityksellä voidaan teoriassa havaita AP-kohtien alkuperäinen määrä sen jälkeen, kun niitä on käsitelty joko Exo III:lla tai putressiinilla, koska AP-kohdat jäävät DNA:n selkärankaan sen jälkeen, kun ne on viilletty jommallakummalla puolella AP-kohdan viereistä fosfodiesterisidosta. Exo III:n ja putressiinin yhdistelmä kuitenkin pilkkoo AP-kohdan sekä 3′- että 5′-puolta, jolloin AP-kohta irtoaa DNA-rungosta. Tällaisia vapautuneita AP-kohtia ei havaita tällä määrityksellä. Tämän pilkkoutumisreaktion jälkeen DNA-runkoon jääneiden AP-kohtien lukumäärän perusteella voidaan arvioida 5′- ja 3′-leikattujen AP-kohtien lukumäärä. Jos DNA:ssa on 5′-leikattuja AP-kohtia, putressiinin kertakäsittely voi vapauttaa 5′-leikattuja AP-kohtia 3′-leikkaamalla AP-kohdat . Samoin DNA:ssa olevat 3′-nikkelöityneet AP-kohdat voidaan vapauttaa 5′-leikkauksella Exo III:n avulla .
AP-kohtien pilkkoutumisen määritys vasikan kateenkorvan DNA:sta, jota on käsitelty lämpö/happopuskurilla. AP-kohtien pilkkoutumistestin validoimiseksi tutkittiin Exo III:n ja putressiinin vaikutuksia vasikan kateenkorvan DNA:han indusoituihin ehjiin AP-kohtiin. Vasikan kateenkorvan DNA:ssa olevien AP-kohtien alkuperäinen määrä väheni MX:llä (CTD/MX). Tämän jälkeen DNA:ta inkuboitiin lämpö/happopuskurissa eri pituisia aikoja, jotta saatiin aikaan eri määrä ehjiä AP-kohtia (-/-; viite 9). DNA:ta inkuboitiin Exo III:n ja/tai putressiinin kanssa, ja vasikan kateenkorvan DNA:ssa jäljellä olevien AP-kohtien määrä mitattiin ASB-määrityksellä. Pylväät, keskiarvot kolmen yksittäisen näytteen kaksoiskappaleista; pylväät, SD. A, AP-kohtien pilkkomismääritys DNA:lle, joka sisälsi 115 AP-kohtaa 106 nukleotidia kohti. B, yhteenveto AP-kohtien pilkkomismäärityksestä DNA:lle, joka sisältää eri määrän AP-kohtia.
Sovelsimme tätä määritystä rotan ja ihmisen kudoksista uutetulle genomiselle DNA:lle endogeenisten AP-kohtien luonnehtimiseksi. Ehjien ja pilkottujen AP-kohtien fraktiot sekä jäljellä olevat aldehydivauriot on esitetty yhteenvetona kuvassa 4⇓. Rotan ja ihmisen kudos-DNA:ta inkuboitiin Exo III:lla ja sen jälkeen putressiinilla sen tutkimiseksi, olivatko havaitut leesiot todellisia AP-kohtia. AP-kohtien 5′- ja 3′-hajautuksen jälkeen havaittiin 1,5-2,2 jäljellä olevaa aldehydileesiota 106 nukleotidia kohti. Nämä tiedot osoittavat, että ASB-määritys mittaa oikein endogeeniset AP-kohdat. Jäännösleesiot voivat johtua AP-kohtien pilkkomisessa tapahtuvien entsyymireaktioiden rajoituksista sekä endogeenisten aldehydisten emäsleesioiden, kuten formyyliurasiilin, läsnäolosta (10). Lisäksi eri kudoksissa havaittiin 3′-leikattujen ja ehjien AP-kohtien yhteenlaskettu osuus ∼2-3 leesiota 106 nukleotidia kohti, mikä on ∼1/3-1/10 endogeenisten AP-kohtien kokonaismäärästä. Tutkiaksemme 5′-leikattujen AP-kohtien määrää inkuboimme DNA:ta putressiinilla. AP-kohtien väheneminen putressiinin vaikutuksesta (AP-kohtien alkuperäinen määrä vähennettynä putressiinin inkuboinnin jälkeen jäljellä olevien AP-kohtien määrällä) edusti 5′-leikattujen AP-kohtien määrää. Toisin kuin lämpö/happopuskurilla esikäsitellyssä vasikan kateenkorvan DNA:ssa, putressiinilla käsitellyssä genomisessa DNA:ssa AP-kohtien määrä väheni selvästi. Nämä tiedot osoittavat, että noin kaksi kolmasosaa tai enemmän endogeenisistä AP-kohdista on jo pilkkoutunut AP-kohtien 5′-puolelta in vivo.
Yhteenveto rotan ja ihmisen kudos-DNA:n AP-kohtien pilkkoutumistestistä. Kuvan 1B legendassa kuvattu alkuperäinen AP-kohtien määrä⇓ koostui 5′-silpoutuneista, 3′-silpoutuneista, ehjistä AP-kohdista ja jäljellä olevista aldehydileesioista. 5′-leikattujen AP-kohtien määrä laskettiin AP-kohtien alkuperäisellä määrällä vähennettynä pelkän putressiinikäsittelyn jälkeen jäljellä olevien AP-kohtien määrällä. 3′-leikattujen ja ehjien AP-kohtien yhteenlaskettu osuus oli putressiinikäsittelyn ja Exo III:n ja putressiinin yhdistelmäkäsittelyn välinen erotus. Jäljelle jääneet AP-kohdat osoittivat puhdistamattomien aldehydileesioiden lukumäärän.
Tyypin II AP-endonukleaasin suorittaman AP-kohtien 5′-hajautuksen jälkeen viilletyt AP-kohdat on sen jälkeen irrotettava DNA:n selkärangasta 5′-dRp-jäännösten erkaantumisen kautta. Tämän vapautumisprosessin suorittaa mahdollisesti dRp-ase hydrolyyttisen reaktion (11) tai β-eliminaation (12) kautta tai endonukleolyyttisen entsyymin kautta, joka viiltää 5′-dRp-rakenteiden alapuolella (13). On osoitettu, että Xenopus- ja ihmisen β-pol vapauttaa 5′-dRp:tä β-eliminaation avulla (14). Käyttämällä korjauslaikkujen kokoa joko β-pol-null- tai -vajavissa soluissa on osoitettu, että yksi aukkokorjausreitti oli vallitseva β-pol-vajavissa soluissa, mutta ei β-pol-null-soluissa (15). Lisäksi ihmisen AP-endonukleaasin ja β-polin vuorovaikutus kiihdyttää 5′-dRp-jäämien vapautumista in vitro (16). 5′-dRp-jäänteiden korjaustehokkuutta ei kuitenkaan ole hyvin karakterisoitu soluissa tai in vivo. Käyttämällä hiivasoluista vapaita uutteita on todettu, että 5′-dRp-osien prosessointi on nopeutta rajoittava vaihe urasiilia sisältävän DNA:n emäksen eksisiokorjauksessa (17). Lisäksi tutkittiin β-polin katalyyttistä tehokkuutta 5′-dRp:n poistamisessa (18). Mielenkiintoista oli, että β-polin 5′- dRp-aseaktiivisuuden Kcat oli ∼100-kertaisesti pienempi kuin AP-endonukleaasin Kcat. Tämä tutkimus osoittaa, että 5′-incisoituneet AP-kohdat säilyvät selvästi rotan ja ihmisen kudoksissa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että AP-endonukleaasin suorittama viilto ja sitä seuraava 5′-dRp-jäämien vapautuminen eivät ehkä ole tehokkaasti yhteydessä toisiinsa perustasolla in vivo ja että 5′-dRp:n korjausprosessi voi olla yksi emäksen eksisiokorjauksen nopeutta rajoittavista vaiheista.
Edellisessä tutkimuksessamme (3) osoitimme, että spontaania depurinaatiota esiintyi fysiologisissa olosuhteissa 1,5 AP-paikkaa 106:aa nukleotidia kohti päivässä. Sen testaamiseksi, olivatko kuumalabiilit DNA-adduktiot, kuten N3- ja N7-alkyylipuriinit, aivojen suuremman endogeenisten AP-kohtien määrän lähde, tehtiin depurinaatiomääritys aivojen ja maksan DNA:lle. Aivoissa ja maksassa ei kuitenkaan havaittu eroa (tietoja ei ole esitetty). Näin ollen endogeenisten AP-kohtien tasainen määrä ei välttämättä johdu labiilista emäsvauriosta. Yksi tärkeimmistä ja runsaimmista endogeenisistä DNA-vaurioista on oksidatiivinen DNA:n emäsvaurio. On raportoitu, että 5-hydroksisytosiinin vakiotila rotan aivoissa on ∼2-kertainen rotan maksaan verrattuna (19). Tällaiset hapettuneet pyrimidiiniemäkset korjataan End III:n toimesta, jolloin DNA:n selkärankaan jää AP-kohtia. Sen tutkimiseksi, voisiko oksidatiivinen stressi olla yhteydessä AP-kohtien tasaiseen lukumäärään DNA:ssa, End III -herkkiä kohtia kvantifioitiin käyttämällä ASB-määrityksen ja E. coli End III:n yhdistelmää. End III -herkkien kohtien määrä oli kolminkertainen aivoissa (14 vaurioita 106 nukleotidia kohti) verrattuna muihin kudoksiin (4-5 vaurioita 106 nukleotidia kohti). Äskettäin on kloonattu ja karakterisoitu ihmisen End III -geenin homologi (hNTH1) (20). Tämän geenin mRNA-ekspressio vaihtelee elinten välillä kaavalla, joka vastaa endogeenisten AP-kohtien määrää (20). Useimmilla hapettuneiden emästen korjaamiseen osallistuvilla DNA-glykosylaaseilla on AP-lyaasiaktiivisuus, joka pilkkoo AP-kohtien 3′-puolta. Siksi endogeeniset 5′ AP-kohdat eivät olisi peräisin tällaisten DNA-glykosylaasien hapettuneiden emästen pilkkomisesta. Alustava koe osoitti, että vetyperoksidi FeSO4:n kanssa indusoi suoraan vasikan kateenkorvan DNA:ssa 5′-sahattuja AP-kohtia ilman entsyymejä (tietoja ei ole esitetty). Nämä tutkimukset viittaavat siihen, että oksidatiivinen stressi saattaa olla yksi tekijä, joka on vastuussa 5′-silpoutuneiden AP-kohtien vakiintuneesta tilasta.
Alun perin odotimme, että endogeenisten AP-kohtien määrä genomipohjaisessa DNA:ssa olisi vähäinen niiden myrkyllisyyden ja mutageenisuuden vuoksi. Tämä tutkimus kuitenkin osoittaa, että AP-kohtien vakiintunut tila on ∼1 vaurio 105 nukleotidia kohti genomisessa DNA:ssa. Vaikka AP-kohtia korjataan jatkuvasti, AP-kohtien osuus, joka välttyy korjaukselta, vaikuttaa todennäköisesti mutaatioihin, kromosomipoikkeavuuksiin ja transkriptiovirheisiin, jotka voivat liittyä spontaaneihin ikään liittyviin sairauksiin, kuten syöpään ja degeneratiivisiin häiriöihin.