Cd29:n ja CD49f:n kriittinen rooli rintasyövän Brca1-assosioituneesta hiirimallista eristettyjen syöpää aloittavien solujen metastaasin välittämisessä …assosioituneen rintasyövän hiirimallissa

Brca1-mutanttien syöpäsolujen CSC-solut välittävät solumigraatiota in vitro

Olemme aiemmin eristäneet CD24+CD29+-soluja ja CD24+CD49f+-soluja, jotka ovat rikastuneet syövän aloittaviin soluihin tai CSC-soluihin primaarisista maitorauhaskasvaimista, jotka on kehitetty Brca1-mutanttihiirissä, tai viljellystä solulinjasta, (W0069), joka on peräisin Brca1-nisäkasvaimesta.39 Testataksemme näiden solujen roolia metastaasissa lajittelimme CD24+CD29+-solut (kutsutaan CSC-soluiksi) ja CD24-CD29–solut (ei-CSC-solut) W0069-solulinjasta, joka sisältää noin 15 % CD24+CD29+-soluja, kuten aiemmin on osoitettu,39 ja tutkimme migraatiokykyä sekä haavanparanemis- että transwell-testillä. Kaksoispositiiviset CD24/CD29-solut osoittivat 24 tunnin kuluttua parempaa migraatiokykyä verrattuna kaksoisnegatiivisiin soluihin, mikä kävi ilmi haavan koosta (kuva 1a). Transwellin migraatiomääritys paljasti myös merkittävän eron migroituneiden solujen määrässä sekä suodattimen alapinnalla (175,6±19 vs. 54,2±18,1, **P<0,01) että transwellin alemmassa kammiossa (82,3±5,5 vs. 4,3±2,1 pesäkettä, **P<0,01) (kuva 1b). Samanlaisia tuloksia saatiin, kun tutkittiin samasta solulinjasta peräisin olevia eri alaklooneja, jotka olivat joko positiivisia tai negatiivisia CSC:n esiintymisen suhteen (tietoja ei ole esitetty). Vahvistaaksemme, että CSC-solujen liikkuvuus on lisääntynyt, sekoitimme eri määriä W0069-soluja W0069-solulinjasta lajiteltuihin kaksoisnegatiivisiin soluihin. Kuten kuvasta 1c näkyy, migraatiokyky heikkeni, kun kaksoispositiivisten solujen määrää vähennettiin, vaikka käytettyjen solujen kokonaismäärä pysyi vakaana lisäämällä CD24-CD29-solujen määrää. Kun aloitimme 5 × 104 W0069-solulla, havaitsimme, että migroituneet solut muodostivat 52,6 ± 15,5 pesäkettä alakammioon. Kun 4 × 104 W0069-solua sekoitettiin 1 × 104 kaksoisnegatiivisen solun kanssa, pesäkkeiden määrä väheni 16±2,6:een. Pesäkkeiden määrä väheni edelleen, kun W0069-solujen määrää vähennettiin ja CD24-CD29-solujen määrää lisättiin (kuva 1c). Samat tulokset saatiin, kun W0069-soluja sekoitettiin alaklooniin (W0069-202), jossa on vain CD24-CD29-soluja (täydentävät kuvat 1a ja b). Sitä vastoin osoitimme, että pesäkkeiden määrä lisääntyi, kun käytettyjen CD24+CD29+-solujen määrää lisättiin asteittain (täydentävä kuva S1c). CSC-solujen roolin todentamiseksi edelleen migraatiossa käytettiin W0069-vihreällä fluoresoivalla proteiinilla leimattuja soluja, jotka olivat positiivisia CSC-solujen esiintymisen suhteen, ja ne sekoitettiin lajiteltuihin leimaamattomiin CD24-CD29- soluihin. Lisäämällä positiivisten solujen määrää havaitsimme migroituneiden solujen muodostamien pesäkkeiden määrän lisääntyvän, ja kaikki muodostuneet pesäkkeet olivat vihreitä, kun ne tarkastettiin fluoresenssimikroskoopilla, mikä viittaa siihen, että migraatio voidaan havaita vain, kun soluviljelmässä on CD24+CD29+-soluja (kuva 1d ja e). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että CSC-soluilla on lisääntynyt liikkuvuus Brca1-mutanttien syöpäsolulinjoissa.

Brca1-mutanttien syövän CSC:t välittävät syövän etäpesäkkeitä in vivo

Jatkossa arvioimme CSC:iden mahdollista roolia etäpesäkkeissä in vivo. Tuoreet lajitellut CD24+CD29+- ja CD24-CD29- solut sekä W0069-solulinjan samojen merkkiaineiden suhteen positiiviset tai negatiiviset alikloonit istutettiin 6-8 viikon ikäisten neitseellisten atyymisten (nude) hiirten rintarauhaseen. Ensinnäkin havaitsimme, että kasvaimen kasvu oli hitaampaa, kun lajiteltuja CD24-CD29- soluja verrattiin CD24+CD29+-soluihin (kuva 2a ja b), mikä vastaa käsitystä siitä, että tämä populaatio rikastuu CSC-soluihin.39 Samanlaisia tuloksia saatiin, kun käytettiin CSC-solujen esiintymisen suhteen joko positiivisia tai negatiivisia aliklooneja (tietoja ei ole esitetty). Vaikka CD24+CD29+-soluja ruiskuttaneet hiiret jouduttiin lopettamaan aikaisemmin (päivä 49-54) kuin CD24-CD29- soluja ruiskuttaneet hiiret (päivä 60-69) suuremman kasvainrasituksen vuoksi, etäpesäkkeiden esiintyminen lisääntyi merkittävästi CD24+CD29+-soluja ruiskuttaneiden hiirien ryhmässä. Erityisesti 3/15 hiirellä, joille oli istutettu negatiivisia solulinjoja, oli yksi pieni kasvainkyhmy keuhkoissa hiirtä kohti (kuva 2c ja d). Sitä vastoin 13/18 hiirellä, joille oli istutettu positiivisia solulinjoja, havaittiin keuhkoissa metastaattisia kyhmyjä, joita oli yhteensä yli 100 (tämä määrä saattaa olla aliarvioitu, koska useimpien kyhmyjen koko oli paljon suurempi eikä kyhmyjä voitu laskea tarkasti, kun niitä oli liian monta yhdessä keuhkossa) (kuva 2c ja d). Koska positiivisten ja negatiivisten kasvainten välillä oli noin seitsenkertainen (5000mm3/700mm3) ero primaarikasvaimen koossa, olimme harkinneet mahdollisuutta, että etäpesäkkeiden erotus voisi johtua kasvaimen kasvun erosta. On kuitenkin tiedetty, että kasvainten etäpesäkkeet alkavat jo alkuvaiheessa, kun kasvaimet ovat pieniä, eivätkä vasta loppuvaiheessa, kun ne ovat suuria40 , mikä puhuu tätä mahdollisuutta vastaan. Lisäksi ero kyhmyjen lukumäärässä on noin 33-kertainen (100/3), ja suurin osa kaksoispositiivisista soluista peräisin olevista kyhmyistä on paljon suurempia kuin kaksinegatiivisista soluista peräisin olevista kyhmyistä, mikä korostaa näiden kahden osapopulaation erilaista metastaattista kykyä. Kolmen metastaattisen kyhmyn alkuperän osalta on mahdollista, että kaksoisnegatiivinen populaatio saattaa edelleen sisältää joitakin soluja, joilla on heikommat syöpää käynnistävät ja metastaattiset kyvyt. Vaihtoehtoisesti jotkin CD24-CD29-solut saattavat saada nämä kyvyt erilaistumalla. Nämä ovat mielenkiintoisia kysymyksiä, jotka ansaitsevat lisätutkimuksia.

CD29:llä ja CD49f:llä on kriittinen rooli syövän etäpesäkkeiden välittämisessä

Mielenkiintoista on, että näiden metastaattisten kasvainten profilointi fluoresenssiaktivoidulla solulajitteluanalyysillä CD24- ja CD29-merkkiaineita käyttäen osoitti, että kaksoispositiivisista solulinjoista peräisin olevilla kasvaimilla oli samankaltaiset profiilit kuin primaarisilla kasvaimilla tai alkuperäisellä syövän solulinjalla (kuvio 3a, vasemmalla). Koska vain kasvaimen sisällä olevat CSC:t voivat toistaa alkuperäisen kasvaimen heterogeenisuuden, tämä osoittaa, että CSC:t metastasoivat ja ohjaavat metastaattisten kasvainten muodostumista. Sitä vastoin negatiivisista solulinjoista peräisin olevissa kasvaimissa ei havaittu CD24- ja CD29-kaksoispositiivisia soluja edes sen jälkeen, kun ne olivat metastasoituneet (kuva 3a, oikealla), kuten fluoresenssiaktivoidulla solulajitteluanalyysillä osoitettiin. Lisäksi pystyimme havaitsemaan CD24+CD29+-soluja immunofluoresenssivärjäyksellä keuhkojen metastaattisissa kyhmyissä, jotka olivat peräisin kasvaimista, jotka oli aloitettu istuttamalla CD24+CD29+-soluja (kuva 3b), mutta eivät kasvaimista, jotka oli aloitettu istuttamalla CD24-CD29- soluja (tietoja ei ole esitetty). Sen havainnon kanssa, että CD24+CD29+-soluilla on suurempi liikkuvuus kuin CD24-CD29- soluilla, on johdonmukaista, että CD24- ja CD29-vasta-aineilla tehdyllä värjäyksellä havaittiin myös CD24+CD29+-soluja siirtyvissä soluissa haavan paranemismäärityksen aikana (kuva 3c). Nämä tulokset tukevat ajatusta siitä, että CSC-soluilla on lisääntynyt liikkuvuus sekä in vitro että in vivo ja että niillä on ratkaiseva rooli Brca1-mutaatiolla varustettujen maitorauhaskasvainten metastaattisen kyvyn edistäjinä.

Kumpikin CD29 (β1-integriini) ja CD49f (α6-integriini) ovat integriini-alayksiköitä, jotka toimivat solunulkoisen matriisin reseptoreina.41 Koska solunulkoinen matriisi osallistuu solujen liikkuvuuteen ja syövän etäpesäkkeisiin,41 olimme kiinnostuneita määrittämään, toimivatko CD29 ja CD49f vain CSC:iden merkkiaineina vai onko niillä itse asiassa kriittinen rooli syövän etäpesäkkeiden välittämisessä. Ensin tyrmäsimme CD29:n W0069- ja CD24+CD29+-soluissa käyttämällä yksittäistä pientä häiritsevää RNA:ta (siRNA), joka kohdistui CD29:n avoimeen lukukehykseen, ja tietomme osoittivat, että siCD29-solujen solujen solumigraatio oli huomattavan vähäistä, mutta ei kuitenkaan tilastollisesti vähentynyttä verrattuna kontrollisolujen soluihin (kuva 4a ja b). Koska CD29 ja CD49f muodostavat heterodimeerejä, epäilimme, että CD49f saattaa kompensoida joitakin toimintoja, kun CD29:n ilmentyminen on heikentynyt. Tämän tutkimiseksi pudotimme seuraavaksi CD49f:n siRNA:lla näissä soluissa (kuva 4a). Tietomme osoittivat, että pelkkä CD49f:n knockdown vähensi myös hieman solujen migraatiokykyä samalle tasolle kuin siCD29-käsitellyissä soluissa (kuva 4b). Solujen migraation, mutta ei solujen elinkelpoisuuden, huomattavaa vähenemistä havaittiin kuitenkin, kun molemmat tyrmättiin samanaikaisesti (kuva 4a-d). Samat tulokset saatiin käyttämällä siRNA-poolia, joka kohdistui neljään eri alueeseen näiden geenien avoimessa lukukehyksessä (täydentävä kuva 2a-c). Tarkistimme myös neljän sukulaisintegriinin (integriinit α5 ja 7 sekä integriinit β2 ja 3) ilmentymisen CD29:n ja CD49f:n tyrmäyksen jälkeen, ja tiedot osoittavat, että nämä siRNA:t eivät muuttaneet muiden integriinien ilmentymistä, mikä sulkee pois näiden siRNA:iden ristikkäis-inhibitorisen aktiivisuuden muihin integriineihin nähden (täydentävä kuva 2d). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että integriineillä α6 ja β1 voi olla päällekkäinen, mutta kriittinen toiminnallinen rooli CSC:iden migraatiossa. Näin ollen lajittelemalla solut käyttämällä integriinejä α6 ja β1 merkkiaineina rikastamme itse asiassa soluja, joissa näillä proteiineilla voi olla toiminnallinen rooli solujen migraation välittämisessä in vitro ja syövän etäpesäkkeiden muodostumisessa in vivo.

CSC-soluilla oli epiteelistä mesenkymaaliseen siirtymään viittaava geeniekspressio

Ymmärtääksemme mekanismia, joka on CSC-solujen lisääntyneen metastaattisen kyvyn taustalla, teimme morfologisia ja molekyylianalyysejä sekä CD24+CD29+- että CD24-CD29- soluilla. Analyysimme osoitti, että CD24-CD29- soluissa oli näkyvämmin kalvoon sitoutunutta E-kadheriinia, joka on epiteelisolujen merkkiaine, kuin CD24+CD29+-soluissa (kuva 4e). qRT-PCR-analyysissä havaittiin myös korkeammat E-kadheriinin ilmentymistasot CD24-CD29- soluissa kuin CD24+CD29+-soluissa (kuva 4f). E-kadheriinin pienentyneen ilmentymistason kanssa johdonmukaisesti CD24+CD29+-soluissa oli myös useiden mesenkyymisolujen merkkigeenien korkeammat ilmentymistasot, kuten qRT-PCR (kuva 4f) ja western blot -analyysi osoittivat (lisäkuva 2e). Koska molemmat solutyypit olivat peräisin maitorauhaskarsinoomasta, CD24+CD29+-solujen korostunut mesenkymaalinen ominaisuus viittaa siihen, että ne ovat läpikäyneet epiteelin ja mesenkyymin välisen siirtymän, mikä tarjoaa molekulaarisen perustan niiden lisääntyneelle liikkuvuudelle in vitro ja syövän metastaasille in vivo.

Yhteenvetona olemme tutkineet rintasyövän Brca1-mutanttihiirimallista eristetystä CD24+CD29+-solupopulaatiosta rikastettujen CSC-solujen metastaattista potentiaalia, ja tietomme osoittivat, että CSC-solut osoittivat kudosviljelyssä paljon suurempaa migraatiokapasiteettia kuin muut kuin CSC-solut ja että ne osoittivat lisääntynyttä metastaattista potentiaalia allograftti-luovutetuilla alastomilla hiirillä. Osoitimme, että CD24+CD29+-solut säilyttivät kyvyn erilaistua ja muodostaa uudelleen heterogeenisuutta metastaattisissa kasvaimissa, kun taas CD24-CD29- solut eivät pystyneet siihen. Kiehtovin havainto on kuitenkin se, että CD29:llä ja CD49f:llä, joita on käytetty merkkiaineina CSC-solujen eristämisessä hiiren nisäkasvaimista39, 42, 43 , on päällekkäinen mutta kriittinen rooli CSC-solujen migraation välittämisessä. Hiirillä β1-integriini edustaa vallitsevasti ilmentyvää integriiniä maitorauhasen epiteelisoluissa, ja sillä on kriittinen rooli syövän etenemisessä.44 Ihmisen rintasyövissä α6-integriini ilmentyy korkealla tasolla, ja se toimii itsenäisenä ennustetekijänä, kuten kävi ilmi eräässä tutkimuksessa, jossa aikariippuvainen vaikutus rajoittui ensimmäisiin kahteen seurantavuoteen.45 Molempien geenien mahdollinen rooli rintasyövän CSC-tauditekijöissä on kuitenkin edelleen hämärän peitossa. Tietomme osoittivat, että β1-integriinin tai α6-integriinin heikentynyt toiminta yksinään johtaa paljon lievempiin vaikutuksiin kuin molempien geenien tuhoaminen samanaikaisesti. Tämä havainto on johdonmukainen sen tosiasian kanssa, että molemmat integriinit voivat muodostaa parin toistensa kanssa heterodimeerejä solunulkoisen matriksin komponenteille, kuten fibronektiinille ja laminiinille. 41, 46, 47, 48, 49 On ehdotettu, että pahanlaatuinen sosiaalinen verkosto välittää solujen ja solujen välistä adheesiota ja kommunikaatiota CSC:iden ja niiden mikroympäristön välillä. 20, 21 Tutkimuksemme viittaa β1/α6-integriinien tärkeään rooliin tämän verkoston välittämisessä. Erityisesti β1/α6-integriinit voivat välittää CSC:n ja solunsalpaajien vuorovaikutusta, välittää solunulkoisen matriksin signalointia solukoneistolle ja johtaa CSC:iden lisääntyneeseen aktiivisuuteen elinkelpoisuuden, erilaistumisen ja etäpesäkkeiden muodostumisen suhteen.