Abstract
Sen jälkeen, kun alun perin havaittiin, että osa potilaista, joilla on ihomelanooma, sisältää BRAF-mutaatioita, merkittävässä määrin on keskitytty BRAF-mutaatioiden patologisten seurausten selvittämiseen, diagnoositekniikoiden optimoimiseen näiden mutaatioiden tunnistamiseksi ja terapeuttisten interventioiden kehittämiseen, jotta voidaan estää tämän kohteen toiminta mutaatioita kantavissa tuumoreissa. Viime aikoina on saavutettu edistystä, joka mullistaa BRAF-mutaatiota sairastavien melanoomapotilaiden hoitostandardin. Tässä asiakirjassa esitetään yleiskatsaus mutanttisen BRAF-signalisaation patogeneettisiin seurauksiin, uusimpiin molekyylitestausmenetelmiin BRAF-mutaatioiden havaitsemiseksi ja uusimpiin kliinisiin tietoihin BRAF-reitin estäjistä potilailla, joilla on melanooma ja BRAF-mutaatioita. Lopuksi käsitellään BRAF:n estäjiin kohdistuvan resistenssin kehittyviä mekanismeja ja keinoja tämän resistenssin voittamiseksi.
1. Johdanto
Melanooma on tällä hetkellä 5. ja 7. yleisin syöpä amerikkalaisilla miehillä ja naisilla . Lisäksi melanooman ilmaantuvuus on noussut dramaattisesti viimeisten 60 vuoden aikana ja lisääntynyt nopeammin kuin kaikki muut kiinteät kasvaimet . Vaikka varhaisvaiheen potilaita voidaan hoitaa onnistuneesti kirurgisella resektiolla suurimmalla osalla potilaista, monille kehittyy levinnyt tauti. Melanooman etäpesäkkeitä sairastavien potilaiden ennuste on synkkä, ja standardihoidosta huolimatta yli 95 prosenttia IV-vaiheen melanoomapotilaista kuolee viiden vuoden kuluessa, ja useimmat potilaat menehtyvät vuoden kuluessa.
Viime aikoina prekliiniset löydökset ovat johtaneet merkittäviin edistysaskeliin melanooman patogeneesin taustalla olevien keskeisten molekulaaristen signalointitapahtumien ymmärtämisessä. Erityisesti on osoitettu, että suuri osa melanosyyttistä alkuperää olevista kasvaimista sisältää BRAF:n aktivoivia mutaatioita, jotka johtavat sen konstitutiiviseen aktiivisuuteen. Noin 70-80 prosentissa hankituista melanosyyttisistä nevoista ja 40-60 prosentissa pahanlaatuisista melanooma-tapauksista on BRAF-mutaatio, joista valtaosa johtaa yhden aminohapon muutokseen kodonissa 600 (BRAFV600E) . Tästä johtuva solunulkoisen signaalin säätelemän kinaasin (ERK) vastustamaton, konstitutiivinen aktivoituminen johtaa solujen kasvun edistämiseen ja apoptoosin vastustamiseen ja lopulta muuttumiseen melanoomaksi . Tämä tehostunut signalointi tekee kuitenkin myös mutatoituneet solut alttiiksi pienimolekyylisille inhibiittoreille, jotka kohdistuvat BRAF-reitin eri välittäjiin .
2. RAF-signalointi ja melanooman patogeneesi
Kasvutekijäreseptorin ja sen ligandin välinen vuorovaikutus indusoi tyypillisesti sarjan tapahtumia, jotka edistävät solukasvua ja selviytymistä. RAS-perheen jäsenet ovat GTPaaseja, jotka toimivat kriittisinä välittäjinä tällaisten signaalien välittämisessä. Vaikka RAS:lla on tärkeä rooli solujen normaalin vaihtuvuuden, kuoleman ja eloonjäämisen homeostaasissa, RAS-perheen jäsenten (HRAS, KRAS ja NRAS) aktivoivia mutaatioita on tunnistettu ja ne on yhdistetty useisiin ihmisen pahanlaatuisiin sairauksiin . Melanoomassa NRAS-mutaatioita on havaittu 10-25 prosentissa kasvainnäytteistä, ja niiden uskotaan olevan tärkeä onkogeneesin aiheuttaja näillä potilailla . Onkogeneesi välittyy useiden alempana sijaitsevien signalointimekanismien, erityisesti mitogeeni-aktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) ja fosfatidi-inositoli-3-kinaasin (PI3K) reittien, säätelyn kautta .
Aktivoitunut RAS laukaisee MAPK-reitin aktivoitumisen vuorovaikutuksen kautta RAF-onkoproteiinien (BRAF ja CRAF) kanssa, mikä johtaa progrowth-signalointikaskadin käynnistymiseen . On epäselvää, välittääkö BRAF vai CRAF signaalin mutatoituneelta NRAS:lta MEK:lle, mutta valtaosa todisteista viittaa siihen, että CRAF on ensisijainen välittäjä . RAF on vuorovaikutuksessa MAPK/ERK-kinaasin (MEK) kanssa ja käynnistää siten MEK:n fosforylaation, joka puolestaan johtaa ERK:n aktivoivaan fosforylaatioon . ERK:n aktivoituminen johtaa progrowth- ja transformointisignaaliin, joka näyttää olevan kriittinen tekijä monien pahanlaatuisten kasvainten patogeneesissä. Tämän reitin voi käynnistää jompikumpi RAF-isomuoto, BRAF tai CRAF, vaikka CRAF:lla on myös eloonjäämistä edistäviä vaikutuksia, osittain antiapoptoottisten proteiinien, ydintekijä kappa B:n (NF-κB) ja B-soluleukemia 2:n (BCL-2) ylössäätelyn kautta. Mielenkiintoista on, että toisin kuin CRAF:lla, aktivoituneella BRAF:lla ei ole muita tunnettuja substraatteja. Näin ollen BRAF-mutaattiset melanoomat antavat signaalin yksinomaan MEK:n ja myöhemmin ERK:n kautta, mikä johtaa onkogeneesiin. Tämä ominaisuus tekee näistä kasvaimista erityisen herkkiä MAPK-reitin voimakkaille estäjille.
3. Diagnostiikka/havaitseminen
Melanooman BRAF:n aktivoivien mutaatioiden tunnistamisen jälkeen havaitsemistekniikka on parantunut dramaattisesti. BRAF:n tavanomaisessa mutaatiotestauksessa kasvainkudoksessa käytetään tyypillisesti tekniikoita, kuten kaksisuuntaista suoraa fluoresoivaa sekvensointia ja alleelispesifistä polymeraasiketjureaktiota, jotka ovat kaupallisesti saatavilla ja tarjoavat korkean spesifisyyden. Näiden määritysten herkkyys on kuitenkin rajallinen, sillä ne pystyvät havaitsemaan mutaation vain, jos kasvainsoluja on >5-10 prosenttia geneettiseen analyysiin toimitetusta näytteestä. Vaikka tämä herkkyysaste riittää yleensä BRAFV600E-mutaation havaitsemiseen homogeenisessa kasvainkyhmyssä, se ei todennäköisesti ole riittävän herkkä havaitsemaan muutamaa kasvainsolua, kun taustalla on suuri osuus strooma- tai lymfaattisia elementtejä, soluttautuvia lymfosyyttejä tai perifeerisen veren soluja.
Yksi huolenaihe, joka liittyy parannetun herkkyyden omaavien mutaatioiden havaitsemistekniikoiden hyödyntämiseen, on se, että positiivinen testi saattaa itse asiassa heijastaa pienen mutanttisolujen osajoukon havaitsemista. Vaikka tällä saattaa olla mielenkiintoisia tieteellisiä seurauksia, pienen määrän mutanttisia BRAF-soluja sisältävän kasvaimen kliininen merkitys on olematon, sillä näiden potilaiden ei odoteta hyötyvän BRAF:n estäjistä. Tämä huoli on aiheellinen, koska primaarimelanoomissa on kuvattu kasvaimen heterogeenisuutta. Lisäksi vaikka BRAF-mutaatioita havaitaan suurimmassa osassa melanosyyttisiä nevoja, vertikaalisen kasvuvaiheen melanoomia ja metastaattista melanoomaa, niitä havaitaan harvoin radiaalisen kasvuvaiheen melanoomissa (10 %), jonka ajatellaan olevan ensimmäinen pahanlaatuinen leesio ennen rehellisesti invasiivista leesiota . Tämä viittaa siihen, että BRAF-mutaatio voi itse asiassa olla varhaisessa melanoomassa hankittu tapahtuma, joka johtaa klonaaliseen laajentumiseen ja kasvaimen etenemiseen. Tällaista moniklonaalisuutta ei ole havaittu yksittäisissä metastaattisissa kasvaimissa eikä silloin, kun yksittäisten potilaiden kasvaimia on otettu näytteeksi useista eri paikoista. Lisääntyneen herkkyyden mutaatioanalyysin soveltaminen ei kuitenkaan välttämättä ole pelkästään kasvainnäytteiden testaamista, vaan pienten edustavien kasvainsolujen havaitsemista ei-malignien solujen taustalta, kuten imusolmukkeista ja perifeerisestä verestä.
Edistyneempiä tekniikoita ja määrityksiä on kehitetty, jotka joko parantavat herkkyyttä tai poistavat lisääntyneen herkkyyden tarpeen. Nämä seuraavan sukupolven testit mahdollistavat tarkemman testauksen näytteistä, jotka sisältävät vain pienen määrän kasvainta, sekä mutaatioiden havaitsemisen erilaisista perifeerisen veren komponenteista (esim. lymfosyytit, mononukleaariset solut, plasma, seerumi). Monien näiden testien käyttökelpoisuutta on tutkittu melanoomapotilaiden näytteissä vaihtelevin tuloksin.
Amplifikaatiorefraktääriset mutaatiojärjestelmät (ARMS) ovat hiljattain kuvattu alleelispesifinen tekniikka, jonka herkkyys on parantunut (se pystyy havaitsemaan 1 % mutanttisoluja sisältävän näytteen mutaatioita verrattuna tavanomaiseen DNA:n sekvensointiin formaliiniin kiinnitetyistä parafiiniin sitoutuneista (FFPE-parafiiniin kiinnitetyistä) kudoksista. Toinen lähestymistapa, joka parantaa huomattavasti mutaatioiden havaitsemisen herkkyyttä, on sellaisten määritysten käyttö, jotka monistavat näytteessä olevaa mutanttista DNA:ta/RNA:ta selektiivisesti. Allelispesifisten alukkeiden ja lukittujen nukleiinihappoalukkeiden yhdistelmää käyttäen on kuvattu 10 melanoomasolun havaitseminen 1 ml:ssa verta . Kolmannen lähestymistavan mutaatioiden havaitsemisherkkyyden lisäämiseksi on raportoitu pystyvän havaitsemaan yhden mutanttisolun tuhannesta ei-mutaattisesta solusta hyödyntämällä villityyppisissä alleeleissa olevaa ainutlaatuista restriktioentsyymikohdetta, joka mahdollistaa villityyppisten alleelien pilkkomisen ja siten mutanttisten alleelien rikastamisen . Lopuksi COLD-PCR:n käyttöönotto johtaa lähes kaksinkertaiseen herkkyyteen BRAF-mutaation havaitsemisessa FFPE-kudoksesta, kun käytetään tavanomaista sekvensointia ja pyrosekvensointia .
Uusien tekniikoiden (ARMS) ja rutiinitekniikoiden muutosten, jotka johtavat mutaatioiden havaitsemisen herkkyyden lisääntymiseen, lisäksi vakiomääritysten soveltaminen aiemmin testaamattomiin näytteisiin muuttaa myös tapaa, jolla lähestymme BRAF-testausta. Seerumin ja plasman vapaan DNA:n BRAF-analyyseistä on raportoitu, samoin kuin BRAF-mutaatioiden havaitsemisesta eristetyistä, kiertävistä kasvainsoluista (CTC). Vaikka CTC:n, seerumin ja plasman BRAF-analyysit näyttävät olevan mahdollisia, on vielä määrittelemättä, tuleeko yhdelle tai useammalle näistä määrityksistä rutiininomaista kliinistä käyttöä vai jääkö se vain kokeelliseksi lähestymistavaksi.
Vakiomuotoisen ja kokeellisen molekyylidiagnostiikan roolia hyödynnetään tiettyjen kiinnostavien mutaatioiden (esim. BRAFV600E) tunnistamiseksi sekä kudoksesta että verestä, mutta voi olla syytä testata myös muita mutaatioita ja poikkeavuuksia, koska ne voivat osoittaa herkkyyttä tietylle hoidolle. Esimerkiksi Sequenomin MassARRAY-teknologiaa käytetään laajempien onkogeenisten mutaatioiden paneelien kyselyyn käyttämällä alukkeen pidennysreaktiota, jota seuraa massaspektrometria tuotteiden havaitsemiseksi ja sellaisten mutaatioiden tunnistamiseksi, joilla voi olla kliinisiä seurauksia. Vertaileva genomihybridisaatio (array comparative genome hybridization, aCGH) tarjoaa mahdollisuuden tutkia koko genomia kopiolukumuutosten varalta, mukaan lukien sekä amplifikaatiot että deleetiot, jotka voivat lisätä herkkyyttä kohdennetulle hoidolle . Kaikki nämä tekniikat ovat kuitenkin sikäli rajoitettuja, että niillä voidaan tunnistaa vain tunnettuja, ennalta valittuja poikkeavuuksia. Koko genomin analyysillä (Whole genome analysis, WGA) on mahdollista yhdistää kaikki tai suurin osa näistä menetelmistä ja testeistä yhdeksi teknologia-alustaksi, mutta myös tunnistaa muita geneettisiä muutoksia, jotka eivät kuulu näiden muiden testien suunnitteluparametrien piiriin. WGA tarjoaa myös mahdollisuuden paljastaa aiemmin tuntemattomia (ehkä potilaskohtaisia) mutaatioita melanooman genomissa ja tutkia, voivatko tietyt mutaatioiden tai polymorfismien profiilit ennustaa hyötyä tietystä hoidosta (esim. BRAF:n estäjät, HD IL-2) . Silti näiden ”seuraavan sukupolven” testien kliininen hyöty melanoomapotilaiden hoidossa on täysin tuntematon.
4. RAF-signaalin estäjät (vähemmän spesifiset tai spesifisemmät mutanttisen BRAF:n, CRAF:n, MEK:n ja ehkä myös ERK:n estäjät)
On kehitetty joukko pienimolekyylisiä estäjiä, jotka kohdistuvat vaihtelevalla selektiivisyydellä villiintyneeseen BRAF:ään (wildtyypin BRAF:iin)
6000> ja muuhun mutanttiseen BRAF:iin (600:sta 601:ään)
. Lisäksi kehitteillä on myös RAF:n aktivaation myöhempien välittäjien eli MEK:n ja ERK:n estäjiä. Tässä osiossa tarkastellaan vain kliinisesti testattuja ja julkisesti raportoituja aineita.
5. BRAF:n estäjät
5.1. Sorafenibi
Sorafenibi, BRAF:n, CRAF:n, verihiutaleista peräisin olevan kasvutekijäreseptorin (PDGFR), verisuonten endoteelikasvutekijäreseptorin (VEGFR) 2, p38:n ja CKIT:n monikohdistettu tyrosiinikinaasi-inhibiittori, jota tutkittiin ensimmäisenä aktiivisesti melanoomapotilailla tutkittavana RAF:n inhibiittorina, koska se oli saatavissa vaiheen II testausta varten samana vuonna, jolloin raportoitiin ensimmäisen kerran BRAF-mutaatiot. Valitettavasti sorafenibin kliininen hyöty on ollut pettymys, vaikka sitä on arvioitu lukuisissa vaiheen I, II ja III tutkimuksissa yksittäisenä aineena ja yhdessä kemoterapian kanssa. Esimerkiksi yksittäistä sorafenibia koskeneessa tutkimuksessa melanoomapotilaiden etenemisvapaa elossaoloajan mediaani oli 11 viikkoa. Kuudella potilaalla (16 %) tauti pysyi vakaana 6 kuukauden kuluttua ja jatkui joissakin tapauksissa yli 12 kuukautta. Kuitenkin vain yhdellä 37:stä tutkimukseen osallistuneesta potilaasta oli RECIST-kriteerien (response evaluation criteria in solid tumor) mukaan määritelty varsinainen tuumorivaste.
Tätä tutkimusta seurasi useita tutkimuksia sorafenibin käytöstä yhdessä erilaisten sytotoksisten aineiden kanssa, vaikka parhaiten tutkittu yhdistelmä oli sorafenibi, karboplatiini ja paklitakseli . Ensimmäiset lupaukset tästä hoidosta kuvattiin faasin I tutkimuksessa, jossa sorafenibia yhdistettiin karboplatiinin ja paklitakselin kanssa kiinteitä kasvaimia sairastavilla potilailla ja johon osallistui 24 potilasta, joilla oli pitkälle edennyt melanooma . Kymmenellä melanoomapotilaalla (42 %) saavutettiin objektiivinen vaste, ja lisäksi 11 potilaalla (46 %) tauti pysyi vakaana RECIST-menetelmän perusteella. Etenemisvapaan elossaoloajan mediaani oli 43,7 viikkoa. Nämä lupaavat tulokset johtivat vaiheen III tutkimukseen, jossa verrattiin karboplatiinia/paklitakselia ± sorafenibia melanoomapotilailla, joilla melanooma oli edennyt temotsolomidi- tai DTIC-hoidon jälkeen. Tähän tutkimukseen (PRISM-tutkimus) osallistui 270 potilasta, eikä sorafenibin lisäämisestä karboplatiiniin/paklitakseliin ollut hyötyä tässä toisen linjan potilasryhmässä. Karboplatiinin/paklitakselin ja sorafenibin yhdistelmää verrattiin myös karboplatiiniin/paklitakseliin pitkälle edennyttä melanoomaa sairastavien potilaiden hoitoa aloittelevassa potilasryhmässä plasebokontrolloidussa satunnaistetussa vaiheen III tutkimuksessa, joka suoritettiin Yhdysvaltojen intergroupissa (E2603). Tähän tutkimukseen osallistui 800 potilasta, eikä sorafenibin lisäämisestä todettu olevan hyötyä sen enempää PFS:n kuin OS:nkaan mediaanissa .
5.2. Tehokkaammat BRAF:n estäjät (PLX4032, GSK2118436)
Yksi tärkeimmistä selityksistä, joita on ehdotettu sorafenibin tehottomuudelle yksittäisenä aineena melanoomapotilailla, on sen kyvyttömyys estää kokonaan BRAF:ia ja erityisesti BRAF:ia, joka sisältää V600E-mutaation. Muita BRAF:n estäjiä, kuten PLX-4032 ja GSK2118436, on kehitetty, ja ne ovat voimakkaampia ja selektiivisempiä mutanttisen BRAF:n estäjiä kuin sorafenibi . Tämä BRAFV600E:n tehostunut esto on ennustettavasti johtanut näiden aineiden parempaan kliiniseen tehoon sorafenibiin verrattuna.
5.3. Vemurafenibi
Vemurafenibi oli ensimmäinen tehokkaampi BRAF:n estäjä, joka läpäisi vaiheen I testit ja osoitti merkittävää kliinistä hyötyä . PLX4032:n vaiheen I tutkimuksessa 11 potilasta 16:sta potilaasta, joiden kasvaimessa oli BRAFV600E-mutaatio ja jotka saivat annosta ≥240 mg kahdesti vuorokaudessa annoksen suurentamisvaiheessa, sai kasvainvasteen, kun taas viidellä potilaalla, joilla oli villityyppinen BRAF:n sisältävä kasvain, ei havaittu kliinistä vastetta. Lisäksi 26 potilasta 32:sta (81 %), joilla oli BRAFV600E-mutaatiota sisältävä melanooma ja joita hoidettiin laajennuskohortissa suositellulla vaiheen II annoksella 960 mg kahdesti vuorokaudessa, sai kliinisen vasteen, mukaan lukien kaksi potilasta, jotka saavuttivat täydellisen vasteen (CR). Arvioitu PFS:n mediaani oli seitsemän kuukautta, mikä on suotuisa verrattuna aiemmin saatavilla olleisiin metastaattisen melanooman hoitomuotoihin. Lisäksi vemurafenibihoito johtaa fosforyloidun ERK:n (pERK) määrän vähenemiseen BRAFV600E-mutaatiota sisältävissä kasvaimissa, mikä liittyy kliiniseen vasteeseen. Todennäköisesti tämä pERK:n esto tehostaa proapoptoottisen BCL-2-perheen jäsenen BIM:n pilkkoutumista ja edistää siten BRAFV600E-solujen apoptoosia .
Nämä havainnot johtivat nopeasti sekä yhden lääkkeen vaiheen II tutkimukseen (BRIM2) että satunnaistettuun, kontrolloituun vaiheen III tutkimukseen (BRIM3). Vaiheen II tutkimukseen osallistui 132 potilasta, joilla oli pitkälle edennyt melanooma ja jotka olivat saaneet yhtä aiempaa hoitoa. Tavoitteellinen vasteosuus (ORR) oli 53 % ja CR-osuus 5 %, ja etenemisvapaa elossaoloaika oli 6,7 kuukautta. Vaiheen III tutkimuksessa 675 pitkälle edennyttä melanoomaa sairastavaa potilasta satunnaistettiin joko vemurafenibille tai dakarbatsiinille etulinjan hoitona . Ensimmäisessä välianalyysissä vemurafenibihoito vähensi merkittävästi kuoleman riskiä ja kuoleman riskiä (63 %:n vähennys) tai taudin etenemisen riskiä (74 %:n vähennys) sekä huomattavasti korkeampaa ORR-arvoa (48 % verrattuna 5 %:iin). Näiden tulosten perusteella FDA hyväksyi vemurafenibin elokuussa 2011.
5.4. GSK2118436
GSK2118436 on toinen tehokkaampi BRAF-estäjä, joka on osoittanut huomattavaa kliinistä aktiivisuutta. Vaiheen I/II tutkimuksessa PLX4032:n tavoin BRAFV600E-mutaatiota sairastavilla potilailla, joita hoidettiin kahdella suurimmalla annostasolla (150 mg kahdesti vuorokaudessa ja 200 mg kahdesti vuorokaudessa), oli korkea vasteosuus (10/16 potilasta, 63 %) . Niistä kahdeksasta potilaasta, joilla oli muita kuin BRAFV600E-mutaatioita (V600K, V600G ja K601E) ja joita hoidettiin annoksella ≥100 mg kahdesti vuorokaudessa, kolme sai osittaisen vasteen. Molemmat potilaat, joilla oli BRAFK601E, etenivät ensimmäisen uudelleenmäärityksen jälkeen, mikä viittaa siihen, että vain potilaat, joilla on BRAF-mutaatioita 600-asemassa, reagoivat hoitoon.
6. MEK:n estäjät
MEK:n, RAF:n aktivaation myöhemmän vaiheen välittäjän ja BRAF:n ainoan tunnetun substraatin, estäjät ovat osoittautuneet lupaaviksi prekliinisissä tutkimuksissa melanoomassa, ja niitä on ryhdytty tutkimaan kliinisesti joillakin rohkaisevin tuloksin. MEK:n estäjät saattavat olla hyödyllisimpiä myös potilailla, joilla on BRAFV600E-mutaatio, sillä mutaatiotilanne korreloi vahvasti MEK:n estovasteen kanssa hiirten melanooman ksenotransplantaattimalleissa .
6.1. AZD6244
Kaksi AZD6244:n vaiheen I tutkimusta, joihin osallistui potilaita, joilla oli pitkälle edenneitä kiinteitä kasvaimia, osoittivat, että tämä aine on hyvin siedetty ja että sillä on jonkin verran kasvainvastaista aktiivisuutta melanoomapotilailla . Ensimmäisessä tutkimuksessa AZD6244:llä hoidetuista kahdeksasta pitkälle edennyttä melanoomaa sairastavasta potilaasta kolme saavutti osittaisen vasteen; BRAF- ja NRAS-mutaatiotilaa ei ollut saatavilla . Toisessa vaiheen I tutkimuksessa neljällätoista melanoomapotilaalla havaittiin vain yksi vaste, vaikka kyseisellä potilaalla oli dokumentoitu BRAF-mutaatio ja täydellinen vaste, joka oli jatkunut julkaisuhetkellä yli kaksi vuotta.
Lisäksi AZD6244 on osoittanut lupaavia tuloksia hiirimalleissa, erityisesti yhdistelmänä kemoterapian kanssa, mikä luo pohjan yhdistelmäkokeille . Tämän pohjalta tehtiin pilottitutkimus AZD6244:stä yhdessä dakarbatsiinin, doketakselin tai temsirolimuusin kanssa pitkälle edennyttä melanoomaa sairastavilla potilailla . Tutkimuksessa hoidettiin 18 potilasta, joiden BRAF- ja NRAS-mutaatiotilanne oli tiedossa. Viidellä yhdeksästä potilaasta (55 %), joilla oli BRAF-mutaatio, todettiin kliininen vaste, kun taas yhdelläkään niistä yhdeksästä potilaasta, joilla ei ollut BRAF-mutaatiota ja joihin kuului neljä potilasta, joilla oli NRAS-mutaatio, ei todettu vastetta. Lisäksi BRAF-mutaatiota sairastavilla potilailla aika taudin etenemiseen parani merkittävästi verrattuna potilaisiin, joilla ei ollut BRAF-mutaatiota (mediaani 31 viikkoa verrattuna 8 viikkoon).
6.2. GSK1120212
GSK1120212 on reversiibeli, selektiivinen MEK1/MEK2:n estäjä, jolla on faasin I tutkimuksessa osoitettu olevan yhden lääkkeen teho potilailla, joilla on pitkälle edennyt BRAFV600E-mutaatioinen melanooma . Kahdeksan potilasta 20:stä BRAF-mutaattista melanoomaa sairastavasta potilaasta, joita hoidettiin GSK2110212:lla, sai vahvistetun hoitovasteen, ja kahdella potilaalla saavutettiin CR. Mielenkiintoista on, että kahdella potilaalla 22:sta, joilla oli villityyppinen BRAF, saatiin PR hoidolla, mikä viittaa siihen, että jotkin melanoomakasvaimet ovat riippuvaisia ERK/MAP-kinaasi-signaloinnista, vaikka BRAF-mutaatiota ei ole.
6.3. PD-0325901
Vaiheen I tutkimukseen PD-0325901:llä osallistui 48 pitkälle edennyttä melanoomaa sairastavaa potilasta, joista 3:lla (6 %) oli varmistettu PR, 10:llä (21 %) tauti oli pysynyt vakaana ≥ 4 kuukautta ja yhteensä 15:llä (31 %) potilaalla havaittiin kasvaimen Ki-67-värjäytymisen vähenemistä . Näiden potilaiden mutaatioanalyysitietoja ei toimitettu.
6.4. AS703026
Samankaltaisia tuloksia on äskettäin raportoitu AS703026:lla, joka on voimakas MEK1/2-estäjä. Vaiheen I tutkimuksessa kolme potilasta kahdeksasta sai osittaisen vasteen hoidolla jommallakummalla kahdesta hoitoaikataulusta . Melanoomapotilaiden mutaatiotilaa ei raportoitu.
MEK:n estäjistä saadut kliiniset tiedot ovat rohkaisevia, mutta ne ovat melko alustavia. Näiden aineiden todellista arvoa on odotettava vaiheen II ja III tutkimuksia potilailla, joilla on BRAF-mutaatiomelanooma. Yksi tällainen parhaillaan käynnissä oleva tutkimus on satunnaistettu, vaiheen III tutkimus, jossa GSK1220212:ta verrataan kemoterapiaan (joko dakarbatsiiniin tai paklitakseliin) potilailla, joilla on BRAF-mutaatioita sisältävä melanooma (NCIT01245062).
7. BRAF:n eston resistenssin kehittyvät mekanismit
Vaikuttaa siltä, että suurimmalla osalla potilaista, joita hoidetaan PLX-4032:lla yhdellä aineella, tauti lopulta etenee, vaikka BRAFV600E:n esto on onnistunut ja objektiivisen vasteen osuus on suuri hoidon alkuvaiheessa. Alustavat tutkimukset viittaavat siihen, että PLX-4032-resistenssi ei liity sellaisen toisen mutaation kehittymiseen, joka heikentää hoitolääkkeen sitoutumista BRAF:iin, mikä on resistenssimekanismi, joka on havaittu kohdennetussa hoidossa muissa pahanlaatuisissa kasvaimissa, kuten ei-pienisoluisessa keuhkosyövässä, kroonisessa myelogeenisessa leukemiassa ja maha-suolikanavan stroomakasvaimessa. Sen sijaan resistenssi välittyy useimmissa kasvaimissa MAPK-reitin uudelleenaktivoitumisen kautta vaihtoehtoisilla keinoilla.
Juuri in vitro -tutkimukset BRAFV600E-mutaation omaavilla soluilla, jotka on luotu osoittamaan hankittua resistenssiä BRAF:n estäjiä vastaan, ovat johtaneet ensimmäisiin johtolankoihin siitä, miten BRAF-mutaation omaavat solut pystyvät selviytymään BRAF:n estosta. Vaikuttaa selvältä, että MAPK-signalointi on keskeinen muuttuja hankitun BRAF-inhibitioresistenssin kannalta. Tämä voidaan saavuttaa reseptorityrosiinikinaasien (esim. PDGFRB, ERBB2), RAS:n aktivoitumisen, CRAF:n säätelyn, Ser/Thr-MAPK-kinaasien (COT) aktivoitumisen ja MEK:n sekundaarisen aktivoivan mutaation kehittymisen kautta. Lisäksi insuliinin kasvutekijäreseptorin 1 (IGF-1R) käynnistämä PI3K-reitin kautta tapahtuva signalointi on vaihtoehtoinen hankitun resistenssin mekanismi, jota on myös kuvattu . Huomattakoon, että kutakin näistä mekanismeista on tutkittu ja vahvistettu pienissä määrissä kasvainnäytteitä potilailta, joista oli otettu koepaloja resistenssin ilmenemisen aikaan, eikä riippuvuutta kyseisistä ylössäätyneistä tai mutatoituneista viestinvälittäjistä ole osoitettu.
Primääristä resistenssiä BRAF:n estolle esiintyy alle 10 %:lla potilaista, joilla on BRAF-mutaatiomelanooma ja joita hoidetaan vemurafenibilla . Vaikka kliinisistä näytteistä ei ole tietoja, joiden avulla voitaisiin tunnistaa, mitkä potilaat eivät todennäköisesti hyödy BRAF:n estäjistä, prekliiniset tutkimukset viittaavat siihen, että CRAF:n kohonneet hoitoa edeltävät tasot sekä CCND1:n amplifikaatio lähtötilanteessa kasvaimissa, mikä johtaa sykliini D1:n yliekspressioon ja CDK4:n lisääntyneeseen ilmentymiseen, ovat lupaavia hoitoa edeltäviä biomarkkereita, joita on syytä tutkia lisää .
BRAF-villiintyneen tyypin (BRAFWT) melanoomasoluissa MAPK-kinaasireitti aktivoituu vemurafenibin (ja analogisen PLX4720:n) vaikutuksesta, mikä johtaa MEK:n ja ERK:n regulaatioon ja lisääntyneeseen proliferaatioon . Tämä näyttää olevan toissijaista CRAF:n aktivoitumisen ja sitä seuraavan MEK:n ja ERK:n kautta tapahtuvan myöhemmän signaalinvälityksen vuoksi, millä on odotettavissa onkogeenisiä seurauksia BRAFWT-soluissa . Lisäksi CRAF:n aktivoituminen näyttää tapahtuvan muodostamalla heterodimeeri BRAFWT-proteiinin ja/tai CRAF-homodimeerin kanssa, mikä on ilmeisintä RAS-mutaation saaneissa soluissa . Lisäksi PLX4720 lisää antiapoptoottisen BCL-2-perheen jäsenproteiinin MCL-1:n tasoja NRAS-mutaattisissa melanoomasoluissa MAPK-reitin kautta tapahtuvan tehostuneen signaloinnin kautta . Vaikka on selvää, että CRAF-aktivaatio ja tehostunut MAPK-reitin signalointi tapahtuvat BRAFWT-melanoomasoluissa (erityisesti niissä, joissa on NRAS-mutaatio), joita hoidetaan BRAF-inhibiittoreilla, kuten vemurafenibilla ja PLX4720:lla, tämän kliininen merkitys on epävarma. Erityisesti ei uskota, että kliinisesti hankittu resistenssi esimerkiksi vemurafenibille johtuisi pelkästään BRAFWT-melanoomasolujen osajoukon kasvusta, koska BRAFV600E-mutaation pysyvyys on todettu kaikissa tähän mennessä analysoiduissa ja raportoiduissa kasvaimissa. Itse asiassa näyttää siltä, että spesifiset muutokset BRAFV600E-mutaatiolla varustetuissa soluissa mahdollistavat sopeutumiset, jotka johtavat uuteen kasvuun jatkuvasta BRAF:n estosta huolimatta.
8. Tulevaisuuden suuntaviivat
Selektiivisten BRAF:n estäjien ja vähäisemmässä määrin myös MEK:n estäjien tehon toteaminen yhden aineen tehona on merkittävä läpimurto BRAF-mutaatiopositiivista melanoomaa sairastavien potilaiden hoidossa. Vaikka useimpien näillä aineilla hoidettujen potilaiden ennustetaan etenevän hoidon aikana, edellä kuvattujen resistenssimekanismien selvittäminen auttaa ohjaamaan tulevaa peräkkäis- ja yhdistelmähoitoa. Koska on havaittu, että MAPK-reitin aktiivisuus aktivoituu uudelleen melanoomassa selektiivisen BRAF:n eston jälkeen, on meneillään ensimmäinen selektiivisen BRAF:n estäjän (GSK2118436) ja MEK:n estäjän (GSK1120212) yhdistelmähoitotutkimus, ja se vaikuttaa siedettävältä, kun molempia aineita annetaan tavanomaisilla kerta-annoksilla. Tämän yhdistelmän lisäksi prekliinisten resistenssimallien tulosten perusteella voidaan odottaa tutkimuksia, joissa selektiivisiä BRAF:n estäjiä käytetään joko yhdessä IGF-R1-antagonistien ja muiden reseptorityrosiinikinaasin estäjien kanssa tai niiden jälkeen.
Toinen lähestymistapa selektiivisten BRAF-inhibiittoreiden ja MEK-inhibiittoreiden tehon lisäämiseksi on sellaisten aineiden lisääminen, jotka saattavat lisätä apoptoosia. Yksi tällainen aine on ABT-263, joka on parhaillaan kliinisessä kehityksessä oleva BH3-mimeettinen aine. Prekliinisissä tutkimuksissa vähemmän biologisesti saatavilla oleva homologinen BH3-mimeettinen ABT-737 yhdessä MEK:n estäjän kanssa johti parempaan tappavuuteen kuin kumpikaan aine yksinään. Sitä, parantaako ABT-263 yhdessä MEK:n tai selektiivisten BRAF:n estäjien kanssa kliinisiä tuloksia, ei tiedetä, mutta sitä kannattaa ehkä tutkia varhaisen vaiheen kliinisessä tutkimuksessa.
Sen lisäksi, että yhdistelmähoito toteutetaan molekyylisesti kohdennetuilla aineilla, jotka estävät selektiivisen BRAF:n eston indusoimaa signalointia tai edistävät apoptoosin syntymistä, toinen lupaava lähestymistapa BRAF:n tai MEK:n estäjistä saatavan hyödyn maksimoimiseksi on näiden aineiden yhdistäminen immunoterapiaan. Viime aikoina immuunijärjestelmän tarkistuspisteiden estäjät, mukaan lukien CTLA-4:n vastainen monoklonaalinen vasta-aine ipilimumabi ja PD:n vastainen monoklonaalinen vasta-aine MDX-1106, ovat osoittaneet tehoa metastaattista melanoomaa sairastavilla potilailla. Tärkeää on, että PLX4032 ei vaikuta haitallisesti ihmisen T-lymfosyyttien (T-solujen) toimintaan, kun taas MEK-estäjät vaikuttavat. Lisäksi vemurafenibin on osoitettu parantavan antigeenispesifisten T-solujen immuunitunnistusta melanoomassa . Nämä havainnot antavat perusteet tutkimukselle, jossa arvioidaan selektiivisen BRAF:n eston turvallisuutta ja tehoa yhdessä immunoterapian kanssa, mukaan lukien ipilimumabi, MDX1106 ja mahdollisesti suuriannoksinen IL2.
9. Johtopäätökset
Monien vuosien ajan oli toivottu, että melanooman kehittymiseen osallistuvien molekyylireittien lisääntyvä ymmärtäminen ja näiden reittien spesifisten estäjien lisääntyvä saatavuus mahdollistaisivat tulevien hoitojen järkevän kehittämisen. Vemurafenibin ja GSK2118436:n, ensimmäisten molekyylisesti kohdennettujen aineiden, jotka ovat johtaneet kasvainvasteeseen suurella osalla potilaista, myötä on alkanut uusi lähestymistapa melanooman hoitoon. Tämän seurauksena kaikille pitkälle edennyttä melanoomaa sairastaville potilaille olisi tehtävä BRAF-mutaatioanalyysi ennen systeemisen hoidon aloittamista. Niitä potilaita, joiden kasvaimessa on BRAF-mutaatio, on pyrittävä kaikin tavoin hoitamaan jommallakummalla kahdesta erittäin tehokkaasta BRAF:n estäjästä. Kun BRAF:n estäjien resistenssimekanismeista saadaan lisää tietoa, on odotettavissa uusien molekyylisesti kohdennettujen hoitojen yhdistelmäkokeiden kehittämistä. Kliiniset parannukset voidaan selvittää vain huolellisesti tehdyillä prekliinisillä ja kliinisillä tutkimuksilla, joihin sisältyy hoitoa edeltäviä ja hoidon aikaisia koepaloja. Koska BRAF on todettu melanooman ensimmäiseksi haavoittuvuuspisteeksi, on toivottavaa, että molekulaarinen ymmärrys BRAF:n eston rajoista johtaa kliinisen hyödyn lisääntymiseen.