Biochemical and Pathogenic Properties ofShewanella alga and Shewanella putrefaciens

TULOKSET

Shewanella-isolaattien biotyypitys kahden erillisen järjestelmän mukaisesti tuotti samankaltaisia tuloksia (taulukko 1). Suurin osa kliinisistä isolaateista (74 %) kuului Gilardi biovar 2:een (CDC-biotyyppi 2), ja ne olivat sakkaroosi- ja maltoosinegatiivisia kasvaessaan SS-agarilla ja suuria NaCl-pitoisuuksia sisältävillä alustoilla. Ainoa merkittävä ero Gilardin luokitusjärjestelmän (6) ja Weyantin ym. luokitusjärjestelmän (22) välillä oli se, että CDC:n biotyyppijärjestelmä ei ryhmitellyt biovar 3 -isolaatteja (sakkaroosi-, maltoosi-, SS- ja NaCl-negatiivisia). Toisin kuin ihmisisolaateissa, biovari 1 (CDC:n biotyyppi 1) oli vallitseva (67 %) muiden kuin ihmiskantojen joukossa. Nämä kannat tuottivat tyypillisesti happoa maltoosista ja/tai sakkaroosista, eivätkä ne kasvaneet runsaasti suoloja sisältävällä tai SS-agarilla. Nozuen ja muiden hiljattain tekemien taksonomisten ehdotusten (15) perusteella biovari 2 (CDC:n biotyyppi 2) -kannat tunnistettaisiin S. alga -bakteeriksi, kun taas kaikki biovari 1 (CDC:n biotyyppi 1) -kannat ja kuusi seitsemästä biovari 3 -kannasta nimettäisiin S. putrefaciens -kannaksi. Kliinisesti S. alga todettiin vallitsevaksi (77 %), kun taas suurin osa muista kuin ihmisestä peräisin olevista isolaateista (89 %) vahvistettiin S. putrefaciensiksi (taulukko 1).

Kaikki 10 Shewanella-isolaattia tunnistettiin yhtä poikkeusta lukuun ottamattaS. putrefaciensiksi, kun ne testattiin API 20E-, API NFT-, RapID NF Plus- ja Vitek-järjestelmillä. Neljä viidestäS. putrefaciens -isolaatista tuotti API 20E -järjestelmässä profiilinumerot, joita ei voida hyväksyä (nro 0602026 ja 0602006); viides kanta tuotti harvinaisen S. putrefaciens -biotyypinumeron. Kaikki S. alga -kannat tunnistettiin erinomaisesti S. putrefaciensiksi API 20E -järjestelmässä. API NFT -järjestelmä tunnisti kaikki 10Shewanella-isolaattia S. putrefaciens -kannaksi hyvällä tai erinomaisella tunnistustuloksella, yhtä poikkeusta lukuun ottamatta, joka oli myös S. putrefaciens -kanta (alhainen erotteluarvo, 48 h). RapID NF Plus tunnisti kaikki 10 Shewanella-isolaattia S. putrefaciens -kannaksi 99,9 prosentin tarkkuudella. Samoin Vitek tunnisti kaikki kannat (97-99 prosentin tarkkuudella) S. putrefaciens -kannoiksi, vaikka kolme S. putrefaciens -kantaa vaati 5-9 tunnin inkubaation ennen lopullista tunnistusta, kun taas muiden seitsemän kannan tulokset olivat 4 tuntia. Hiilihydraattireaktiot (arabinoosi ja maltoosi) API 20E-, API NFT- ja Vitek-järjestelmissä mahdollistavat kuitenkin useimpien kantojen oikean luokittelun asianomaisiin taksoneihin (S. putrefaciens jaS. alga), jos ne luetaan manuaalisesti sen jälkeen, kun ne on lopullisesti tunnistettu S. putrefaciensiksi.

Shewanella-lajien biokemiallisten ja entsymaattisten ominaisuuksien vertailu paljasti useita eroavaisuuksia (taulukko 2). Hemolyysi lampaanveriagarilla, kuten Nozue et al. (15) ovat raportoineet, havaittiin kaikissaS. alga -kannoissa mutta vain parissa S. putrefaciens -isolaatissa. Useimmissa S. alga -kannoissa tämä fenotyyppi ilmeni vasta pitkän inkuboinnin jälkeen (48-72 tuntia), ja hemolyysin alue oli usein epäsäännöllinen ja vaikeasti havaittava. Muut aiemmin todetut S. alga- ja S. putrefaciens -bakteerien erottelua helpottavat toiminnot, kuten kasvu 42 °C:ssa, kasvu suuria suolapitoisuuksia (6,5 %) sisältävillä väliaineilla ja hapon tuottaminen l-arabinoosista, sakkaroosista ja maltoosista, vahvistettiin. Löysimme huomattavasti suuremman määrän S. putrefaciens -kantoja, jotka kasvoivat SS-agarilla kuin aiemmin on raportoitu; suurin osa näistä oli peräisin muista kuin ihmisperäisistä lähteistä. Riboosia lukuun ottamatta hiilihydraattien hapettumisesta peräisin olevan hapon tuotanto liittyi ainoastaan S. putrefaciens -bakteeriin. Sokerimallit vaihtelivat kuitenkin huomattavasti näiden isolaattien välillä, sillä jotkin niistä olivat arabinoosi-, maltoosi- ja sakkaroosipositiivisia, kun taas toiset olivat positiivisia vain maltoosille tai olivat asakkarolyyttisiä (biovar 3 -kannat). Valituissa Shewanella-isolaateissa havaittiin useita uusia entsymaattisia aktiivisuuksia, joita ei tietojemme mukaan ole aiemmin raportoitu. Näitä olivat tyrosinaasi-, alkyylisulfaasi-, kitinaasi- ja elastaasiaktiivisuus (taulukko 2); useimmat näistä entsyymeistä löydettiin muista kuin ihmisestä peräisin olevista S. putrefaciens -isolaateista. Useimmat S. alga- jaS. putrefaciens -kannat tuottivat sideroforia, mikä määritettiin Chrome Azurol S -määrityksillä. Tämä aktiivisuus oli heikkoa, ja viisi isolaattia (kolme S. alga- ja kaksi S. putrefaciens -isolaattia) ei kasvanut tällä väliaineella.

Valikoituja Shewanella-isolaatteja, jotka kasvoivat hyvin 35 °C:n lämpötilassa, karakterisoitiin tarkemmin entsymaattisen aktiivisuuden osalta API-ZYM-menetelmällä (taulukko 3) ja solujen rasvahappoprofiileiden osalta MIDI-järjestelmällä. Yhdeksästä substraatista, joiden kimppuun yksi tai molemmat Shewanella-lajit hyökkäsivät API-ZYM:n avulla, seitsemän entsyymin korkeampi kokonaisaktiivisuus liittyi S. levään. Ainoa aktiivisuus, joka havaittiin vahvemmaksi S. putrefaciensissa, oli valiiniaryyliamidaasi, vaikka tämä aktiivisuus oli erittäin heikko jopa näissä kannoissa. Molemmat lajit tuottivat tasaisen vahvaa emäksistä fosfataasiaktiivisuutta. Lisähavainto oli, että kaikki S. alga -kannat tuottivat johdonmukaisesti kahdeksaa näistä yhdeksästä entsyymistä, ainoana poikkeuksena valiiniaryyliamidaasi. Sitä vastoin S. putrefaciens oli heterogeenisempi, sillä neljää yhdeksästä havaitusta entsyymistä ei esiintynyt kaikissa isolaateissa. 14 Shewanella-kannan analyysi osoitti, että vallitsevat rasvahapot olivat i-15:0, 17:1ω8c ja 16:0; jotkin kannat tuottivat suuria määriä 16:1ω7c:tä (9-18 %), kun taas toiset tuottivat vähäisiä määriä. Vaikka useimmat rasvahappopiikit olivat melko yhdenmukaisia testattujen S. alga- ja S. putrefaciens -kantojen välillä, havaittiin useita eroja (taulukko4). Pentadekaanihapon ja cis-9-heptadekeenihapon (17:1ω8c) keskiarvot olivat korkeammat S. alga -bakteerilla, kun taas S. putrefaciens -bakteerilla heksadekaani- ja dodekaanihappojen keskiarvot olivat päinvastaiset. Heksadekaanihapon osalta S. alga- ja S. putrefaciens -isolaattien välillä ei havaittu päällekkäisyyttä rasvahappojen kokonaisvalikoimassa; pentadekaanihapon ja 17:1ω8c:n osalta vain yksi S. putrefaciens- tai S. alga -isolaatti tuotti arvon, joka sijoittui toistensa valikoimaan. Vaikka mikään yksittäinen piikki ei ollut diagnostinen, kaikkien neljän piikin käyttö yhdessä erotti 14Shewanella-kantaa selvästi kahteen ryhmään lajiryhmittäin.

Havaittiin, että S. putrefaciensin 23 kantaa voitiin jakaa kolmeen erilliseen ryhmään useiden fenotyyppisten ominaisuuksien perusteella (taulukko 5). Ryhmä 1, johon kuului kahdeksan kantaa, mukaan lukien ATCC 8073, tuotti happoa maltoosista, sakkaroosista ja arabinoosista ja käytti urokaanihappoa. Ryhmän 1 kannat jakautuivat tasan kliinisten ja ei-inhimillisten isolaattien kesken. Ryhmän 2 kannat (n = 6), joihin kuului ATCC 8071, erottuivat ryhmän 1 kannoista lähinnä kyvyttömyyden perusteella hapettaa sakkaroosia ja maltoosia. Myös näistä kannoista puolet oli peräisin kliinisestä materiaalista. Ryhmän 3 kannat (n = 9), jotka kaikki olivat peräisin ympäristöstä (Michigan-järven alueelta), erosivat huomattavasti ryhmistä 1 ja 2. Nämä kannat olivat kaikki peräisin ympäristöstä (Michigan-järven alueelta). Ne kasvoivat huonosti tai eivät kasvaneet 35 °C:n lämpötilassa, tuottivat kitinaasia ja olivat pigmentittömiä l-tryptofaaniagarilla. Kaikki ryhmän 3 yhdeksän kantaa tuottivat aluksi α-glukosidaasia, mutta uusintatestauksessa vain kolme kantaa oli jatkuvasti positiivisia. Maltoosi hapettui, mutta ei sakkaroosia tai arabinoosia. Toisin kuin ryhmät 1 ja 2, urokaanihappoa ei hyödynnetty energianlähteenä.

Viime aikoina Vogel ja työtoverit (21) ovat havainneet eroja S. alga ja S. putrefaciensin välillä niiden herkkyydessä tietyille mikrobilääkkeille, mukaan lukien penisilliinille, ampisilliinille ja tetrasykliinille. Tämä yhdistettynä raporttiin, joka yhdistää hemolyyttisen aktiivisuuden S. alga -bakteeriin ja sen ilmeisen yhteyden ihmisten sairauksiin, viittaa mahdollisiin eroihin näiden kahden lajin patogeenisuudessa (taulukko 6). Tämän vuoksi valitsimme 10 kantaa (5 kummastakin lajista) lisäanalyysejä varten. Vaikka emme havainneet merkittäviä eroja penisilliini-, ampisilliini- ja tetrasykliinialttiudessa näiden kahden ryhmän välillä herkkyysluokan (herkkä, keskivaikea tai resistentti) perusteella, huomasimme kuitenkin, että S. alga -bakteerin keskimääräiset MIC-arvot penisilliinille, ampisilliinille ja tetrasykliinille (∼200, 56 ja 5.2 μg/ml) olivat suurempia kuin S. putrefaciensin vastaavat MIC-arvot(3, 1,3 ja 1,1 μg/ml).

Viidestä S. putrefaciens -kannasta neljä kiinnittyi heikosti (+) tai vahvasti (+++) (taulukko 6) (taulukko 6) HEp-2-soluihin tarttuvuusmäärityksissä; sen sijaan yhdelläkään S.-levälajin kannalla ei ollut samankaltaisia tarttuvuusominaisuuksia, vaikkakin neljä kantaa kiinnittyi vahvoilla lasiliuska-taustaan. Invasiivista toimintaa ei havaittu yhdessäkään Shewanella-kannassa. Vaikka viivästynyttä hemolyyttistä reaktiota havaittiin lampaanveriagarilla kaikilla viidellä S. alga -kannalla (taulukko 2), beetahemolyysiä ei havaittu agar overlay -tekniikalla eikä liemimäärityksillä (taulukko 6); kontrolli E. tarda -kannat olivat positiivisia 1 h:ssa molemmissa testeissä. Kaikilla viidellä S. alga -kannalla (ja yhdellä S. putrefaciens -isolaatilla) havaittiin joskus heikko sytotoksinen reaktio adheesio- ja invaasiotutkimuksissa. Tämä sytotoksinen reaktio ilmeni HEp-2-solujen poikkeavalla solumorfologialla, mukaan lukien solujätteet (haamut). Näiden kahden lajin välillä havaittiin kuitenkin eroja hiiripatogeenisuudessa, sillä S. alga:n keskimääräinen LD50-arvo sveitsiläisillä Webster-hiirillä oli 1,9 × 108 CFU, kun taas S. putrefaciensin LD50-arvo oli 8,4 × 108 CFU (P < 0,02).