PHMB:n solukalvo-aktiivisuus
Jos PHMB:n antibakteerinen aktiivisuus (kuvio 1a) johtuu kalvojen hajoamisesta, kuten laajalti on raportoitu6,7,8,9,10 , sen odotetaan läpäisevän bakteerisolujen soluseinät kasvua estävissä ja alle kasvua estävissä pitoisuuksissa. Tämän mallin testaamiseksi määritettiin ensin PHMB:n minimaaliset inhiboiva pitoisuudet (MIC) ja aika tappavat ominaisuudet Escherichia coli -bakteeria (kannat K-12 ja MG1655) ja Salmonella enterica serovar Typhimuriumia (kanta LT2) vastaan. Kuten aiemmin on raportoitu2,4, PHMB:llä oli voimakkaita kasvua estäviä ja tappavia ominaisuuksia (lisätaulukko 2 ja lisäkuva 1). Käsittelyn jälkeen soluja tutkittiin myös valomikroskopialla. Odottamatta PHMB:n kasvua estävät pitoisuudet eivät lyseoineet soluja, kuten kirkkauskenttämikroskopialla seurattiin. Mikroskoopille näkymättömien soluesteen vaurioiden arvioimiseksi E. coli K-12 -viljelmiä kasvatettiin log-faasin puoliväliin, käsiteltiin PHMB:llä fluoresoivan kalvon eheyttä mittaavan SYTOX®Green-koettimen läsnäollessa ja seurattiin sen jälkeen fluorimetrialla. Tämä koetin on käyttökelpoinen kalvovaurion indikaattorina, koska se ei tavallisesti tule ulos ehjistä bakteereista ja sen fluoresenssin kvanttituotto kasvaa DNA:n sitoutuessa. Näin ollen ehjillä bakteereilla odotetaan olevan alhainen fluoresenssi ja fluoresenssin odotetaan lisääntyvän soluesteen vaurioitumisen jälkeen16. Odotetusti tuoreet E. coli -viljelmät osoittivat fluoresenssin voimakasta kasvua sen jälkeen, kun niitä oli käsitelty tunnetulla soluseinää rikkovalla polymysiini B:llä tai lämpökäsittelyllä (kuva 1b). Odottamatta PHMB-käsittely johti verrattain alhaisempiin fluoresenssitasoihin. Hämmästyttävintä on, että korkeammat PHMB:n pitoisuudet johtivat fluoresenssin taustatasolle. Nämä havainnot eivät sovi yhteen kalvojen rikkoutumisen kanssa pääasiallisena antibakteerisena mekanismina ja herättävät siksi lisää epäilyksiä vakiintunutta mallia kohtaan.
PHMB:n vaikutukset solukalvon läpäisevyyteen ja bakteereihin tunkeutumiseen.
(a) Polyheksametyleenibiguanidin (PHMB; CAS-numero: 27083-27-8) rakenne; vaihtoehtoiset kemialliset nimitykset: polyheksanidi; esimerkkikauppanimet: Vantocil™, Cosmocil™, Baquacil™, Prontosan®. Katso lisätietoja täydentävästä taulukosta 1. PHMB koostuu toistuvista emäksisistä biguanidiiniyksiköistä, jotka on yhdistetty heksametyleenihiilivetyketjuilla ja jotka muodostavat kationisen ja amfipaattisen rakenteen, jolla on suuri kapasiteetti vetysidoksille, sähköstaattisille ja hydrofobisille vuorovaikutuksille. PHMB-valmisteet koostuvat tyypillisesti eripituisista polymeereistä, joissa on amiini-, guanidiini- ja syanoguanidiinipäätteisiä ryhmiä (esim. keskimääräinen n = 13,8, 3 035 g/mol44). b) PHMB:n, kuumuuden, polymysiini B:n (positiivinen kontrolli) ja triklosaanin (negatiivinen kontrolli) vaikutukset solujen läpäisykykyyn SYTOX®Greenille. Testattujen antibakteerien MIC-arvot on merkitty värikoodatuilla pystysuorilla nuolilla yläreunassa. (c) Fluoresenssimikroskopia PHMB-FITC:n pääsystä erilaisiin bakteereihin. PHMB-FITC (2 μg/ml) lisättiin bakteeriviljelmiin ja solut vastavärjättiin DAPI:lla. (d) Konfokaalikuva, jossa näkyy PHMB-FITC:n (vihreä) lokalisaatio B. megateriumissa; bakteerit vastavärjättiin kalvoja lokalisoivalla koettimella vehnänalkioagglutiniinilla (WGA), joka oli konjugoitu Alexa Fluor-555:een (punainen), ja visualisoitiin elävinä (ylhäällä) ja kiinnitettyinä (alhaalla) soluina; palkki = 5 μm. (e) Fluoresenssin intensiteettiprofiilin analyysi PHMB-FITC:n ja WGA:n fluoresenssin solulokalisoinnista (valkoinen viiva osoitti analyysissä käytetyn poikkileikkauksen). Vihreä viiva osoittaa FITC:n tason ja sijainnin (pääasiassa solun sisällä). Punainen viiva osoittaa WGA:n tasot ja sijainnin (pääasiassa kalvon sisällä).
PHMB tunkeutuu bakteereihin
Jos PHMB:n ensisijainen kohde ei ole bakteerisolujen soluesteet tai ei ole yksinomaan soluesteet, se todennäköisesti vaikuttaa solun sisäisesti, mikä edellyttäisi solun sisäänmenoa. Testataksemme bakteerien sisäänpääsyä syntetisoimme PHMB-FITC-konjugaatin (täydentävät kuvat 2a,b) ja arvioimme grampositiivisten (Staphylococcus aureus), gramnegatiivisten (Escherichia coli ja Salmonella enterica serovar Typhimurium) ja haponkestävien (Mycobacterium smegmatis) bakteereiden sisäänpääsyä mikroskopoimalla ja läpivirtaussytometriaa käyttäen (kuva 1c, täydentävä kuva 3). Kaikissa testatuissa lajeissa havaittiin voimakasta soluun liittyvää vihreää fluoresenssia (kuva 1c). Solujen lokalisoitumisen tutkimiseksi perusteellisemmin suurikokoista Bacillus megaterium -bakteeria käsiteltiin PHMB-FITC:llä, vastavärjättiin kalvoja lokalisoivalla vehnänalkioagglutiniinilla (WGA-punainen) ja tutkittiin fluoresenssimikroskopialla (kuva 1d). Soluun pääsyä havaittiin sekä elävissä että kiinnitetyissä soluissa, ja fluoresenssin intensiteettiprofiilin analyysi osoittaa, että PHMB-FITC lokalisoitui sytoplasmaan ilman kertymistä soluesteeseen (kuva 1e).
Havainto siitä, että PHMB tunkeutuu soluihin pienillä mikrogramma/ml-pitoisuuksilla, viittaa siihen, että se voi tunkeutua eläviin soluihin. Sen selvittämiseksi, edellyttääkö PHMB:n otto bakteereihin energia-aineenvaihduntaa, E. coli -viljelmiä inkuboitiin keskimmäisessä log-faasissa 37 °C:n lämpötilassa tai 4 °C:n lämpötilassa 2 tunnin ajan solujen ATP-tasojen vähentämiseksi. Tämän jälkeen soluja käsiteltiin PHMB-FITC:llä (0-6 μg/ml) ja inkuboitiin edelleen jäällä 2 tuntia. Soluihin assosioitunut PHMB-FITC:n fluoresenssi kvantifioitiin fluorimetrisesti (täydentävä kuva 3b). Solut, joita pidettiin 4 °C:ssa, ottivat vähemmän PHMB-FITC:tä kuin solut, joita inkuboitiin 37 °C:ssa, mikä on johdonmukaista energiasta riippuvaisen solunottoprosessin kanssa. Vihreästi fluoresoivia ja liikkuvia bakteereja havaittiin myös useina ajankohtina PHMB-käsittelyn aikana (lisäyskuva 3). Koska bakteerien liikkuvuus on energiariippuvainen17 , todisteet osoittavat, että PHMB-FITC kulkeutuu metabolisesti aktiivisiin soluihin. Näin ollen PHMB tunkeutuu monimuotoisiin bakteereihin, ja tunkeutuminen havaittiin liikkuvissa soluissa.
PHMB pysäyttää solunjakautumisen ja tiivistää bakteerien kromosomit
Tarkastellessamme E. coli -bakteeria mikroskoopilla huomasimme, että PHMB:llä käsitellyillä soluilla oli usein pitkänomainen morfologia, joka voi olla tyypillistä solunjakautumisen estämiselle (kuva 2a). Mitataksemme PHMB:n vaikutuksia solujen pidentymiseen titrasimme PHMB:tä E. coli -kannan SS996 kasvaviin viljelmiin (ks. jäljempänä) ja mittasimme solujen pituudet. Kasvua estävillä pitoisuuksilla yli 80 % soluista pidentyi (kuva 2b; lisätaulukko 2). Havaitsimme myös, että E. coli, jota oli käsitelty kasvua estävillä PHMB- tai PHMB-FITC-pitoisuuksilla ja sen jälkeen DAPI-värjäyksellä, näytti sinisesti fluoresoivia fokaaleja lähellä solukeskusta (kuva 2c). Nämä rakenteet muistuttivat nukleoideja18. Helpottaaksemme DNA-pesäkkeiden visualisointia tuotimme E. coli -bakteereista filamenttisia/multinukleaattisia populaatioita estämällä solunjakautumista välttämättömän solunjakautumisgeenin ftsZ19 RNA:n vaimentamisella. RNA-vaimennus valittiin tähän kokeeseen, koska se mahdollistaa spesifisen ja hallittavissa olevan välttämättömien geenien transkriptien translaation tukahduttamisen20. Kasvun kannalta välttämättömiä geenejä ei voida tyrmätä genomihäiriömenetelmillä, koska tämä johtaisi elinkyvyttömiin kantoihin. Ilman PHMB:tä filamenttiset solut osoittivat yhtenäistä DAPI-värjäytymistä, kun taas PHMB:llä käsitellyt solut osoittivat sinisiä ”helminauhoja” (kuva 2d). Vastaavasti suurikokoisissa grampositiivisissa B. megaterium -bakteereissa havaittiin DAPI-värjättyjä fokaaleja PHMB-käsittelyn jälkeen (kuva 2e). Nämä tulokset sekä gramnegatiivisissa että grampositiivisissa lajeissa osoittavat, että PHMB-altistus johtaa kromosomien tiivistymiseen bakteereissa.
PHMB:n välittämä solujen pidentyminen ja kromosomien tiivistyminen bakteereissa.
(a) E. coli -bakteeria käsiteltiin PHMB:llä 90 minuutin ajan ja sitä tutkittiin kirkas kenttämikroskopialla. (b) Solujen keskimääräinen pituus PHMB-konsentraation funktiona. MIC (nuoli) on merkitty. (c) Kromosomijakauman malli soluissa PHMB-FITC-käsittelyn jälkeen. E. coli -kannan K-12 viljelmiä käsiteltiin PHMB-FITC:llä, vastavärjättiin DAPI:llä ja tutkittiin fluoresenssimikroskopialla. Kromosomit näkyvät tiivistettyinä DAPI-värjättyinä pesäkkeinä, jotka näkyvät selvemmin suurennetussa kuvassa. (d) Kromosomijakauman malli filamenttisessa/multinukleoituneessa E. coli -bakteerissa PHMB-altistuksen jälkeen. Solujen jakautuminen pysäytettiin ftsZ:n ilmentymisen RNA-vaimennuksella, minkä jälkeen solut jätettiin käsittelemättä tai käsiteltiin PHMB:llä, värjättiin DAPI:llä ja tutkittiin fluoresenssimikroskopialla. (e) Kromosomijakauman kuvio B. megaterium -soluissa, jotka olivat käsittelemättömiä tai PHMB:llä käsiteltyjä, värjätty DAPI:llä ja WGA-punaisella ja tutkittu fluoresenssimikroskopialla.
PHMB:n välittämät antibakteeriset vaikutukset ovat riippumattomia stressivasteen reiteistä
Solujen pidentyminen ja kromosomien tiivistyminen ovat tyypillisiä morfologioita, jotka liittyvät usein bakteerien SOS-vasteeseen21,22. Siksi katsoimme, että nämä vaikutukset voisivat liittyä tähän vasteeseen. PHMB:n välittämien vaikutusten tapauksessa SOS-vaste vaikutti kuitenkin epätodennäköiseltä. Ensinnäkin SOS-vaste liittyy tyypillisesti DNA-vaurioon, eikä PHMB:n välittämistä genotoksisista tai epigeneettisistä vaikutuksista ole näyttöä23. Toiseksi ftsZ:n hiljentämisen ja PHMB-käsittelyn jälkeen havaittu tiivistyminen tapahtui recA-kannassa (TOP10), joka on SOS-vasteen mutantti. Antimikrobisia mekanismeja on kuitenkin tunnetusti vaikea tulkita, ja niihin voi liittyä useita mekanismeja. Siksi päätimme arvioida SOS-vasteen ja muiden stressivasteiden mahdollisen osallisuuden käyttämällä SOS-reporttikantaa ja paneelia E. coli -stressivasteiden mutantteja.
Testaamaan, muuttuvatko PHMB:n välittämät vaikutukset solun pidentymiseen ja kromosomien tiivistymiseen SOS-vasteiden mutaatioilla, arvioimme morfologisia vasteita kolmessa mutantti-E. coli -kannassa. Kanta SS996 pystyy käynnistämään SOS-vasteen, mutta sulB-mutaation vuoksi vaste ei johda solunjakautumisen estoon. Tämä johtuu siitä, että SS996:ssa on ftsZ:n mutanttialleeli (sulB103), jonka tuote ei ole herkkä SOS:n aiheuttaman solunjakautumisen estäjän SulA24:n vaikutukselle. Kanta JW2669 ei tuota toimivaa RecA:ta ja on siten SOS-puutteellinen. Kannassa AB2474 on mutaatio LexA-repressorissa, jonka vuoksi RecA ei voi purkaa sitä, joten se ei kykene indusoimaan SOS-vastetta (kannan lisätiedot on esitetty kuvassa 3 ja lisätietojen taulukossa 3). Log-vaiheen puolivälissä olevat viljelmät käsiteltiin PHMB:llä, värjättiin DAPI:llä ja tarkkailtiin fluoresenssimikroskoopilla. Kuten E. coli K-12:lla havaittiin, mutanttikannoilla oli PHMB-käsittelyn jälkeen pitkänomainen morfologia ja tiivistyneitä kromosomeja (kuva 3a). Näin ollen PHMB:n välittämät solunjakautumis- ja kromosomirakennevaikutukset tapahtuvat SOS-ohjelmoidusta vasteesta riippumatta.
PHMB:n vaikutukset bakteerien SOS-vasteisiin.
(a) Kromosomien tiivistyminen E. coli -kannoissa SS996 (sulB103; SulA:lle epäherkkä FtsZ-mutantti), JW2669 (recA-; recA:n knock-out) ja AB2474 (lexA1, mutaatio, joka estää SOS-vasteen indusoitumisen) sen jälkeen, kun niitä on käsitelty PHMB:llä 2 tuntia. Solut värjättiin DAPI:llä DNA:n paljastamiseksi. (b) SOS-vasteen reportteri-ekspressio, kvantifioitu fluorimetrialla. SOS-reportteri E. coli -kanta SS996, jossa on kromosomaalinen sulAp-gfp-fuusio, jätettiin käsittelemättä tai sitä käsiteltiin PHMB:llä, mitomysiini C:llä, joka on tunnettu SOS-induktori, tai triklosaanilla, joka ei indusoi SOS-vastetta. MIC-arvot SS996:ta vastaan olivat PHMB, 0,75 μg/ml; triklosaani, 2 μg/ml; mitomysiini C, 0,06 μg/ml, ja näitä arvoja käytettiin %MIC:n laskemiseen.
Jotta voisimme suoremmin mitata, indusoiko PHMB SOS-vasteen, käytimme E. coli -kantaa SS996, joka on reportterikanta, joka sisältää sulAp-gfp-kromosomaalisen kromosomaalisen SOS-vaste/reporter-järjestelmän24,25. Jos PHMB aiheuttaa SOS-vasteen, PHMB-altistuksen pitäisi indusoida GFP-ekspressio tässä kannassa. SS996:n viljelmiä käsiteltiin PHMB:llä 18 tunnin ajan, minkä jälkeen mitattiin vihreä fluoresenssi. Positiivisena kontrollina käytettiin DNA:ta vaurioittavaa mitomysiini C:tä ja negatiivisena kontrollina rasvahappojen biosynteesiä estävää triklosaania. Odotetusti mitomysiini C indusoi GFP-ekspression suuren kasvun ja triklosaani ei indusoinut GFP-ekspressiota. Toisin kuin mitomysiini C, PHMB ei indusoinut GFP-ekspressiota, mikä osoittaa, että PHMB ei indusoi SOS-vastetta (kuva 3b).
Seuraavaksi testasimme, erosivatko kannat, joilla on viallinen tai dereguloitunut SOS-vaste, toisistaan herkkyydessä PHMB:lle. Testataksemme recA:n välittämiä vaikutuksia herkkyyteen käytimme E. coli -kantoja, joista puuttuu recA (JW2669), ja kantoja, jotka yliekspressoivat recA:ta induktorin IPTG:n lisäämisen yhteydessä (ASKA JW2669), ja määritimme MIC-arvot. Kumpikaan recA:n deletointi tai indusoitu yliekspressio ei muuttanut herkkyyttä PHMB:lle (lisätietotaulukko 3, tummanharmaalla tummennetut rivit). Sitä vastoin recA-kanta oli 2-kertaisesti herkempi SOS-vastetta indusoivalle lääkkeelle nalidiksiinihapolle, ja recA:n yliekspressio vähensi herkkyyttä nalidiksiinihapolle 8-kertaisesti. Testataksemme lexA:n välittämiä vaikutuksia PHMB-herkkyyteen käytimme lexA1(Ind-) kantaa AB2474, joka ei kykene indusoimaan SOS-vastetta. Vanhempaan kantaan verrattuna AB2474 oli 1-kertaisesti alttiimpi PHMB:lle ja 1-kertaisesti vähemmän altis nalidiksiinihapolle (lisätaulukko 3, vaaleanharmaalla tummennetut rivit). Näin ollen yksikään testatuista SOS-vastemutaatioista ei osoittanut sellaisia muutoksia PHMB-herkkyydessä, jotka viittaisivat SOS-vasteen osallisuuteen.
Viimeiseksi tarkasteltiin, vaikuttavatko muut (muut kuin SOS-) stressivasteiden reitit herkkyyteen PHMB:lle. Testasimme useita tunnettuja E. coli -stressivasteen mutaatioita rinnakkain niiden vanhemman kanssa alttiuden suhteen PHMB:lle. Yksikään mutantti ei osoittanut MIC-arvojen muutoksia, jotka viittaisivat minkään stressivasteen reitin toiminnalliseen osallistumiseen (lisätaulukko 3). Näin ollen PHMB:n antibakteeriset vaikutukset ilmenevät riippumatta testattujen stressivastusmekanismien paneelista.
PHMB kondensoi bakteerien kromosomeja in vitro
Jos PHMB kondensoi bakteerien kromosomeja solujen sisällä, tämä voi tapahtua suorien tai epäsuorien DNA:han kohdistuvien vaikutusten kautta. Epäilimme suoria vaikutuksia, koska PHMB:n on osoitettu sitoutuvan DNA-fragmentteihin in vitro15. Päätimme tutkia PHMB:n DNA:ta sitovia ominaisuuksia käyttämällä eristettyä E. coli -kromosomaalista DNA:ta. PHMB:n ja DNA:n välisiä vuorovaikutuksia tutkittiin ensin elektroforeettisella liikkuvuussiirtymämäärityksellä (EMSA) ja väriaineen poissulkemismäärityksellä. PHMB sekoitettiin E. coli K-12:sta eristettyyn kromosomaaliseen DNA:han, ja seokset fraktioitiin agaroosi-/TBE-geeleillä, minkä jälkeen DNA värjättiin etidiumbromidilla. PHMB:n ja DNA:n seokset, joiden wt:wt-suhteet olivat ≥0.5:n elektroforeettinen liikkuvuus oli selvästi hidastunut, minkä osoitti DNA:n jääminen kuoppaan (kuva 4a). Samanlaisia tuloksia saatiin PHMB-FITC:n osalta. Liikkuvuuden hidastuminen ja jääminen kuoppiin on yhdenmukainen PHMB:n ja DNA:n välisten vakaiden vuorovaikutusten kanssa. EMSA-määritykset osoittivat myös vähentynyttä etidiumbromidin fluoresenssia PHMB:n tai PHMB-FITC:n läsnä ollessa, mikä viittaa siihen, että etidiumbromidin sitoutuminen DNA:han estyi PHMB:DNA-kompleksien muodostumisen vuoksi. Tätä havaintoa tutkittiin edelleen käyttämällä DNA:ta sitovaa SYTOX®Green-väriainetta väriaineen poissulkemismäärityksessä. PHMB:n puuttuessa SYTOX®Green sitoi eristettyä E. coli -DNA:ta, mikä näkyi fluoresenssin suurena lisääntymisenä verrattuna pelkän väriaineen lisäämiseen. PHMB:n edeltävä lisäys vähensi kuitenkin fluoresenssia >80 % (kuva 4b). PHMB muodostaa siis komplekseja bakteeri-DNA:n kanssa tavalla, joka hidastaa elektroforeettista liikkuvuutta ja peittää DNA:n pääsyn DNA-ligandeille. Kaikkien näiden kokeiden tulokset osoittavat, että PHMB sitoutuu suoraan DNA:han.
PHMB sitoutuu bakteerien kromosomaaliseen DNA:han in vitro.
a) PHMB tai PHMB-FITC sekoitettiin E. coli -kannasta K-12 eristettyyn kromosomaaliseen DNA:han ja näytteet analysoitiin EMSA:lla. Viivästynyt liikkuvuus geelissä osoittaa PHMB:n sitoutuneen DNA:han. (b) PHMB:n välittämä SYTOX®Greenin sitoutumisen estäminen eristettyyn E. coli -kromosomaaliseen DNA:han, jossa vähentynyt fluoresenssi osoittaa PHMB:n sitoutuneen DNA:han. (c) PHMB:n ja eristetyn E. coli -kromosomaalisen DNA:n seosten sirkulaaridikroismispektroskopia. (d) Elliptisyyden kuvaaja PHMB:DNA-suhteen funktiona.
Tutustuaksemme tarkemmin siihen, miten PHMB:n sitoutuminen DNA:han vaikuttaa kromosomaalisen DNA:n rakenteeseen, käytimme biofysikaalisia menetelmiä ja mikroskopiaa. PHMB:n ja eristetyn E. coli -kromosomaalisen DNA:n yhdistelmiä tutkittiin sirkulaarisen dikroismin (CD-spektroskopian) avulla. Pelkällä PHMB:llä ei ollut tyypillistä CD-spektriä, kun taas eristetyllä kromosomaalisella DNA:lla oli tyypillinen DNA-spektri, jossa positiivinen elliptisyysmaksimi oli noin 260 nm:n kohdalla, negatiivinen läpilyönti 252 nm:n kohdalla ja negatiivinen syvänne noin 245 nm:n kohdalla. Näin voitiin arvioida muutoksia DNA:n CD-spektrissä PHMB:n lisäämisen jälkeen. PHMB:n ja DNA:n sekoituksissa elliptisyys 260 nm:n kohdalla pieneni, mikä viittaa DNA:n rakenteellisiin muutoksiin PHMB:n sitoutuessa (kuva 4c,d). Myös dynaaminen valonsironta (DLS) osoitti, että PHMB:n sitoutuminen DNA:han johtaa noin 50-60 nm:n nanohiukkasten muodostumiseen, joiden polydispersiteetti-indeksi on alhainen (täydentävä kuva 4a). Transmissioelektronimikroskopia (TEM) ja fluoresenssimikroskopia osoittivat myös, että PHMB:n sitoutuminen DNA:han johtaa nanohiukkasten muodostumiseen (täydentävät kuvat 4b,c). Näin ollen nämä tulokset vahvistavat aiemmat raportit, joiden mukaan PHMB sitoo DNA:ta26 , ja paljastavat, että PHMB sitoo eristettyä bakteerien kromosomaalista DNA:ta ja voi tiivistää kromosomeja nanohiukkasten populaatioksi, jonka polydispersiteetti on alhainen.
PHMB:n antibakteeriset vaikutukset tukahdutetaan dsDNA-ligandilla
Tuloksemme PHMB:n vaikutuksista bakteereihin eivät ole yhteensopivia PHMB:n primaarista bakteereita ehkäisevää toimintamekanismia kuvaavan kalvojen hajoamismallin kanssa. Pikemminkin ehdotamme uutta mallia, jossa PHMB tunkeutuu bakteereihin ja kondensoi sitten kromosomeja, kuten kuvassa 5a on esitetty. Jos uusi malli pitää paikkansa, se ennustaisi myös toiminnallisia vuorovaikutuksia PHMB:n ja muiden DNA-ligandien välillä, ja tämä ajatus tarjosi meille keinon testata mallia. Lyhyesti sanottuna, jos malli pitäisi paikkansa, pienimolekyylipainoisten DNA-ligandien odotettaisiin tukahduttavan PHMB:n antibakteerista tehoa kilpailemalla DNA:n sitoutumiskohdista kromosomeissa. Tämän mahdollisuuden testaamiseksi PHMB:n ja Hoechst 33258:n parittaisia yhdistelmiä käytettiin kasvun herkkyysmäärityksissä. Hoechst 33258 on DNA-ligandi, joka sitoutuu ensisijaisesti AT-rikkaiden sekvenssien pieneen uraan27 , ja se on solun läpäisevä, joten se oli sopiva valinta tähän kilpailukokeeseen.
Malli PHMB:n antibakteeriseksi vaikutusmekanismiksi ja kasvun eston tukahduttamiseksi.
(a) PHMB:n ehdotettu antibakteerinen vaikutusmekanismi. (b) PHMB:n ja Hoechst 33258:n sekä negatiivisen kontrollin ei-DNA:ta sitovien ligandien (triklosaani ja trimetopriimi) pareittaiset kasvunestovuorovaikutukset eri bakteerilajeilla. (c) Bakteerigenomin AT-pitoisuuden ja antibakteeristen vuorovaikutusten suhde PHMB:n kanssa. Kasvua estävien vuorovaikutusten ja DNA:n AT-pitoisuuden kuvaaja eri lajeilla. Vuorovaikutusarvot ovat PHMB:n ja Hoechst 33258:n tai negatiivisen kontrollin ei-DNA:ta sitovien ligandien (trimetopriimi ja triklosaani) välisiä fraktionaalisia inhiboivia pitoisuusindikaatioita (FICI). (d) Bacillus megateriumin kasvun estyminen PHMB:llä ja estyminen yhdistelmillä DNA-ligandin Hoechst 33258 kanssa (siniset viivat). Katso lajiluettelo ja inhibitioarvot lisätaulukosta 4.
Lääkevuorovaikutukset laskettiin fraktionaalisina inhiboivan konsentraatioindeksin arvoina (FICI, fractional inhibitory concentration index) käyttäen erilaisten bakteerilajien paneelia. PHMB:Hoechstin FICI-arvot olivat merkittävästi korkeammat kuin PHMB:n yhdistettynä jompaankumpaan kahdesta muusta kuin DNA-ligandiantibakteerista (kuva 5b). PHMB:Hoechst -yhdistelmien FICI-arvot korreloivat myös positiivisesti kromosomin AT-pitoisuuden kanssa (kuva 5c). Toisin sanoen PHMB:n antimikrobiset vaikutukset riippuvat pääsystä DNA:han solujen sisällä. B. megateriumissa PHMB:Hoechst -yhdistelmien vaikutukset olivat silmiinpistäviä, sillä PHMB:n aiheuttama kasvun esto tukahdutettiin, kun käytettiin subinhibitorisia Hoeschst 33258 -pitoisuuksia (kuva 5d). Näin ollen pienimolekyylinen DNA-ligandi Hoechst 33258 pelasti bakteerit PHMB:n inhiboivilta pitoisuuksilta.
Nämä pareittaiset lääkeaineinteraktiot paljastavat, että PHMB:n antibakteeriset vaikutukset tapahtuvat pääasiassa bakteerien DNA:han kohdistumisen kautta. Yhdenmukaisesti PHMB:lle havaitun solun läpäisevyyden muutosprofiilin kanssa (kuva 1b); tulokset viittaavat myös PHMB:n ja DNA-ligandin väliseen kilpailuun DNA:n sitoutumiskohdista solujen sisällä. Näin ollen kahdella tunnetulla DNA-ligandilla tehdyistä erillisistä kokeista saadut tulokset ovat sopusoinnussa PHMB:n aktiivisuuden uuden mallin kanssa.
PHMB tunkeutuu nisäkässoluihin, mutta ei pääse solujen ytimiin
Vallitsevan PHMB:n aktiivisuutta koskevan mallin mukaan PHMB tappaa bakteereja bakteerikalvojen vaurioittamisen kautta eikä polymeeri ole vuorovaikutuksessa nisäkässolujen solukalvojen kanssa (ks. edellä). Ottaen kuitenkin huomioon PHMB:n odottamattomat bakteerisolujen sisäänpääsyominaisuudet ja hiljattain tekemämme havainnot siitä, että PHMB tunkeutuu viljeltyihin makrofageihin28 ja keratinosyytteihin29 , päätimme arvioida suoraan sen kykyä tunkeutua nisäkässoluihin. PHMB-FITC:tä lisättiin useisiin nisäkässolulinjoihin ja primaarisiin fibroblasteihin, ja imeytymistä arvioitiin fluoresenssimikroskopialla ja virtaussytometrialla. Havaittiin selvää imeytymistä kaikkiin testattuihin solutyyppeihin (kuva 6a,b). Nämä olosuhteet eivät myöskään johtaneet nisäkässolujen solukalvojen eheyden häiriintymiseen (täydentävä kuva 5a). Mikroskooppikuvien lähempi tarkastelu paljastaa, että PHMB-FITC oli vesikkelien sisällä ja poissuljettu tumista (kuva 6a). Jos on totta, että endosomit kätkevät PHMB:n sisäänsä, vapautumisen sytoplasmaan pitäisi purkaa PHMB-FITC:n sammutus ja johtaa fluoresenssin lisääntymiseen. Tämä johtuu siitä, että FITC:n fluoresenssi sammuu alhaisessa pH:ssa, ja myöhäisten endosomien pH on <630, kun taas sytoplasman pH on 7,4. Havaitsimme, että klorokiinin, osmolyyttisen/puskuriaineen31 , lisääminen lisäsi PHMB-FITC:llä käsiteltyjen solujen fluoresenssia (kuva 6c), mikä on johdonmukaista polymeerin sulkemisen kanssa endosomeihin. Näin ollen PHMB kulkeutuu tehokkaasti nisäkässoluihin, mutta se pakkautuu endosomeihin, mikä näyttää rajoittavan kulkeutumista tumaan.
PHMB:n kulkeutuminen nisäkässoluihin.
(a) Primaariset fibroblastit käsiteltiin PHMB-FITC:llä (3,5 μg/ml), vastavärjättiin Hoechst 33258:lla ja havainnoitiin fluoresenssimikroskopialla. (b) PHMB-FITC:llä käsiteltyjen nisäkässolujen paneelin virtaussytometria-analyysi. Sisäkuvassa: edustava esimerkki virtaussytometrian histogrammista HeLa-solupopulaatioista, joita ei ole käsitelty (violetti populaatio) tai joita on käsitelty PHMB-FITC:llä (0,4 μg/ml) (vihreä populaatio). (c) HeLa-soluja käsiteltiin PHMB-FITC:llä (3,5 μg/ml) ja klorokiinilla (0-20 μM) 2 tunnin ajan. Klorokiinin vaikutukset fluoresenssiin mitattiin virtaussytometrialla käyttäen fluoresenssin intensiteetin geometrista keskiarvoa (mielivaltaiset yksiköt (A.U.), log-asteikko).