2,4-dinitrofenyylifenyylihydratsonijohdannaisten synteesi ja mikrobilääkeresistenssiä moduloiva aktiivisuus eräitä ESKAPE-ihmisen patogeenejä vastaan

Abstract

Syntetisoitiin ja arvioitiin kuuden uuden fenyylihydratsonin kirjastoa niiden in vitro mikrobilääke- ja resistenssiä moduloivan aktiivisuuden suhteen grampositiivisia, gramnegatiivisia ja sienilajeja vastaan. Yhdisteet valmistettiin hyvällä saannolla (60-92 % w/w), ja ne karakterisoitiin käyttämällä sulamispistettä, UV-näköspektroskopiaa, infrapuna- ja ydinmagneettista resonanssia (1H, 13C ja DEPT-Q). Massaspektroskopiaa käytettiin yhden aktiivisimman yhdisteen, 5 , identiteetin varmistamiseen. Fenyylihydratsonit osoittivat aktiivisuutta kaikkia kuutta valittua mikro-organismia vastaan siten, että aktiivisimpien yhdisteiden 1 ja 5 pienin inhiboiva pitoisuus (MIC) oli 138 µM (Klebsiella pneumoniae) ja 165 µM (Streptococcus pneumoniae). Yhdiste 1 osoitti lisäksi suurta resistenssiä moduloivaa aktiivisuutta 1,078 µM:llä Streptococcus pneumoniae:ta ja Klebsiella pneumoniae:ta vastaan.

1. Johdanto

Maailmasta on viime vuosikymmeninä loppumassa tehokkaat antibiootit moniresistenttien organismien lisääntyneen esiintyvyyden vuoksi . Tämä on johtanut resistenttien infektioiden lisääntymiseen, mikä edellyttää, että tutkijat tutkivat hellittämättä mahdollisuutta syntetisoida aktiivisten tai johtavien yhdisteiden analogeja uusina mikrobilääkkeinä näiden infektioiden ja niistä johtuvien sairauksien hillitsemiseksi. Tartuntataudeista on vuosisatojen kuluessa tullut merkittävä uhka ihmiskunnan olemassaololle, sillä ne vaikuttavat edelleen kielteisesti yhteiskuntaan merkittävästi. Patogeeniset aineet, kuten bakteerit, virukset, sienet ja loiset, lisääntyvät edelleen ja ovat kasvussa erityisesti 21. vuosisadalla huolimatta useista yrityksistä niiden hillitsemiseksi. Tartuntatautien vuoksi kuolee vuosittain noin 17 miljoonaa ihmistä, ja uusia tauteja ilmaantuu vähintään kolmekymmentä. Maailmassa taistellaan parhaillaan koronaviruksen aiheuttamaa COVID-19-pandemiaa vastaan, joka on vaatinut jo yli 25 000 ihmishenkeä maailmanlaajuisesti kolmen kuukauden aikana (WHO, 2020). Nämä taudit uhkaavat miljoonien ihmisten terveyttä erityisesti siksi, että parannuskeinoa tai rokotetta ei ole olemassa. Mikrobiperäisten infektioiden kasvava suuntaus johtuu suurelta osin monivuotisesta mikrobilääkeresistenssistä, joka on ollut yleistymässä. Mikrobilääkeresistenssin keskeisiä lukemattomia syitä ovat pitkittynyt kemoterapia ja annosteluohjelman noudattamatta jättäminen .

Kasvava antibioottiresistenssi on johtanut siihen, että patogeenit, kuten metisilliiniresistentti Staphylococcus aureus (MRSA), moniresistentti Mycobacterium tuberculosis (MDR-tuberkuloosi) ja moniresistenssiherkkä Escherichia coli (MDR-Escherichia coli), ovat yleistyneet. Lisäksi eniten huolta sairaalainfektioiden hoidossa aiheuttavat ESKAPE-patogeenit (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa ja Enterobacter species) . Niiden esiintyminen infektioissa on ollut huolestuttava tilanne terveydenhuoltoalalla, koska useimmat niistä ovat resistenttejä monille antibiooteille, ja näiden kantojen resistenssimekanismin ymmärtäminen on hyödyllistä uusien mikrobilääkkeiden kehittämisessä .

Maailman terveysjärjestö WHO on tehnyt selväksi, että tartuntatautien lisääntymisen suuntaus jatkuisi useiden tekijöiden, kuten maaseudulta kaupunkeihin suuntautuvan muuttoliikkeen, maailmanlaajuisen väestönkasvun, mikrobien sopeutumisen ja ilmastonmuutoksen vuoksi . Nämä edistäisivät taudinaiheuttajien syntymistä ja leviämistä, joten sidosryhmiä, mukaan lukien lääkekemistit, kehotetaan jatkuvasti suunnittelemaan strategioita uusien kemoterapeuttisten aineiden löytämiseksi mikrobilääkeresistenssin uhan voittamiseksi. Yhdisteen resistenssiä moduloiva aktiivisuus on yhdisteen kyky kontrolloida jo tunnettuja standardeja erityisesti positiivisella tavalla. Koska mikro-organismien antibioottiresistenssi on lisääntynyt, luonnollisista tai synteettisistä lähteistä peräisin olevat aineet näyttävät moduloivan joidenkin vakiomuotoisten mikrobilääkkeiden, kuten amoksisilliinin (a), siprofloksasiinin (b) ja flukonatsolin (c), aktiivisuutta (kuva 1).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Kuva 1

Joidenkin tavallisten antibioottien kemialliset rakenteet : (a) amoksisilliini; (b) siprofloksasiini; (c) flukonatsoli.

Tuotteiden (sekä luonnollisten että synteettisten) resistenssiä muokkaavat vaikutukset vakioantibiootteihin ovat herättäneet tieteellistä kiinnostusta viime vuosina. Tällä pyritään maksimoimaan mikrobilääkkeiden teho, jolla on merkittäviä edistysaskeleita mikrobiresistenssin hillitsemisessä ja joka siten johtaa potentiaaliseen lääkekehitykseen. Tärkeä synteettisten aineiden luokka, jolla on lupaava resistenssiä muokkaava vaikutus, on hydratsonit . Hydratsoneilla ja niiden analogeilla on atsometiinifunktio, joka on tärkeä yhdisteryhmä, jolla on laaja valikoima biologisia vaikutuksia. Hydratsonit valittiin, koska niillä on laaja valikoima farmakologisia vaikutuksia, kuten kouristuslääkkeitä, tulehduskipulääkkeitä, mikrobilääkkeitä, eturauhaslääkkeitä ja syöpälääkkeitä. Niillä on ratkaiseva merkitys biologian lisäksi myös fotokemian, analyyttisen kemian ja epäorgaanisen kemian aloilla. Hydratsonit liittyvät ketoneihin ja aldehydeihin korvaamalla happi -NNH2-funktionaalisella osalla. Vaihtelevien synteettisten protokollien ja yksityiskohtaisten rakenne-aktiivisuussuhdetutkimusten (SAR-tutkimusten) ansiosta erilaisia hydratsonijohdannaisia on kehitetty ja havaittu farmakologisesti aktiivisiksi eri kohteissa . Joillakin isonikotinoyylihydratsonijohdannaisilla havaittiin olevan tuberkuloosin vastaista aktiivisuutta. Lisäksi bentsoehappohydratsonijohdannaisen 4-hydroksibentsoehappo-hydratsidin (nifuroksatsidi) havaittiin olevan aktiivinen suolistomatoja vastaan, ja johdannainen 4-fluoribentsoehappo-hydratsidi osoitti antibakteerista aktiivisuutta Staphylococcus aureus ATCC 29213 -bakteeria vastaan, kun se oli 3,13 μg/mL, ja herkkä Mycobacterium tuberculosis -kanta H37RV:tä vastaan, kun se oli 3,13 μg/mL . Hiljattain syntetisoitujen hydratsonien, mukaan lukien nifuroksatsidi, todettiin olevan aktiivisia Mycobacterium tuberculosis -kannan H37RV:tä vastaan pienimmällä inhiboivalla pitoisuusalueella 0,78-6,25 μg/ml. Uuden aineen, 3, 5-dibentsoyylivanilliinihydratsonin, ja siirtymämetallikompleksien havaittiin osoittavan vaikuttavaa antibakteerista aktiivisuutta.

Siten tässä tutkimuksessa kuusi uutta fenyylihydratsonijohdannaista on onnistuneesti syntetisoitu nukleofiilisen kondensaatioreaktion avulla, ja niiden antimikrobisia aktiivisuuksia ja resistenssin modulaatiovaikutuksia on tutkittu.

2. Materiaalit ja menetelmät

2.1. Mikrobiologinen aktiivisuus. Synteesi: Yleiset materiaalit ja menetelmät

Pyöreäpohjaiseen kolviin (100 ml), joka oli varustettu magneettisella sekoitustangolla, lisättiin 2,4-dinitrofenyylihydratsiinia (1 ekv.) metanolissa (10 ml), jota pidettiin jäähauteessa. Tuloksena saatua suspensiota sekoitettiin ja jäähdytettiin 0 °C:seen ennen kuin siihen lisättiin tipoittain väkevää H2SO4:ää (98 % v/v, 2 ml), jolloin saatiin vaaleankeltainen liuos. Jäähdytyksen jälkeen huoneenlämpötilaan lisättiin aldehydi- tai ketonijohdannainen (1,04 ekv.) metanoliin (5 ml) ja seosta sekoitettiin, kunnes vähitellen muodostui sakkaa, jonka annettiin olla 24 tuntia. Kemiallisen reaktion etenemistä seurattiin ohutkerroskromatografialla (TLC) ajoittain käyttäen silikageelillä (60 GF254) päällystettyjä alumiinilevyjä. Levyt visualisoitiin UV-valossa 254 nm:ssä ja 366 nm:ssä, minkä jälkeen ne ruiskutettiin anisaldehydillä pisteiden identiteetin varmistamiseksi. Raakatuote suodatettiin imusuodatuksella ja kiteytettiin uudelleen kuumasta absoluuttisesta etanolista (96 % v/v). Kiinteä tuote saatiin imusuodatuksella, kuivattiin ja varastoitiin huoneenlämmössä.

Syntetisoitujen yhdisteiden rakenteet selvitettiin sulamispistemäärityksillä, massaspektroskopialla, 1D NMR- (protoni- ja hiili-13-) ja 2D NMR- (DEPT-Q-) spektroskopialla infrapuna- (IR-) ja ultravioletti-violettisäteilyspektritekniikoiden (UV-Vis-) tukemana. 1-(2,4-Dinitrofenyyli)-2-(difenyylimetyleeni)hydratsiini

2, 4-Dinitrofenyylihydratsiini (0,50 g, 2,74 mmol, 1 ekv.) bentsofenonin (0,53 g, 1,04 ekv., 2,64 mmol) läsnäollessa tuotti raakatuotteen, joka puhdistettiin uudelleenkiteyttämällä kuumasta etanolista, jolloin saatiin tuote (0,84 g, 85 %) vaalean oranssina kiinteänä aineena. (Pet. eetteri 70%: EtOAc 30%): 0,90. Mpt: 141-143°C; UV-V on (MeOH) : 382 nm. Infrapuna (puhdas) υmax cm-1: 3382 (OH), 3286 (NH), 1586 (C = CH), 848, 614 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09-9,10 (1H, H-C3, s, ArH), 8,41 (1H, H-C5, d, J = 2,4, ArH), 8,37-8,38 (1H, H-C6, m, ArH), 7.66-7,72 (5H, H-C4′, H-C5′, H-C6′, H-C5′, H-C3′, m, ArH), 7,35 (3H, H-C6″, H-C5″, H-C4″, m, ArH), 7,57 (2H, H-C5′, H-C3′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz; CDCl3) 155,7, 145,1, 136,5, 131,9, 130,5, 130,4, 130,1, 129,9, 128,6, 128,2, 127,9, 123,4, 116,6 ppm.

2.1.2. 1-Bentsylideni-2-(2,4-dinitrofenyyli)hydratsiini

2, 4-dinitrofenyylihydratsiini (0,90 g, 4,53 mmol, 1 ekv.) bentsaldehydin (0,50 g, 1,04 ekv., 4,71 mmol) läsnäollessa tuotti raakatuotteen, joka puhdistettiin uudelleenkiteyttämällä kuumasta etanolista, jolloin saatiin tuote (1,01 g, 78 %) keltaisena kiinteänä aineena. (Pet. eetteri 70%: EtOAc 30%): 0,83. Mpt: 178-180°C; UV-V on (MeOH) : 224 nm ja 378 nm. Infrapuna (puhdas) υmax cm-1: 3337 (OH), 3283 (NH), 3100 (C = CH), 1618, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,24 (1H, H-C1, s, NH), 9,09 (1H, H-C3, s, ArH), 8,30-8,31 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8,05 (1H, H-C5, m, ArH), 8.02 (1H, H-C6, m, ArH), 7,41-7,69 (2H, H-C2′, H-C6′, m, ArH), 7,40 (1H, H-C4′, m, ArH), 7,39 (2H, H-C3′, H-C5′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 147,9, 145,8, 144,9, 144,7, 131,0, 130,0, 129,0, 127,6, 123,5, 116,8 ppm.

2.1.3. 3-(2-2-(4-Dinitrofenyyli) hydratsono) metyylifenoli

2, 4-Dinitrofenyylihydratsiini (0,78 g, 3,93 mmol, 1 ekv.) m-hydroksibentsaldehydin (0,50 g, 1,04 ekv.) läsnäollessa, 4,09 mmol) saatiin raakatuote, joka puhdistettiin uudelleenkiteyttämällä kuumasta etanolista, jolloin saatiin tuote (0,76 g, 64 %) tummanpunaisena kiinteänä aineena. (Pet. Eetteri 70%: EtOAc 30%): 0,74. Mpt: 277-280°C. UV-Vis (MeOH): 392 nm. Infrapuna (puhdas) υmax cm-1: 3420 (OH), 3257 (NH), 3116 (C = CH), 1607, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,56 (1H, H-C1, s, NH), 10,04 (1H, H-C2′, s, ArOH), 8,88 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8,35-8,37 (1H H-C5, d, J = 8.0, ArH), 8,08-8,34 (1H, H-C6), d, J = 12,0, ArH), 8,05 (1H, H-C5′, m, ArH), 7,66 (1H, H-C1′, s, ArH), 7,14 (1H, H-C4′, m, ArH), 6,87-6,89 (1H (H-C3′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 160,5, 150,5, 144,9, 137,1, 130,2, 129,8, 129,5, 125,2, 123,6, 117,1, 116,4 ppm.

2.1.4. 4-(2-(2-(2,4-Dinitrofenyyli) hydratsono) metyyli)-2-metoksifenoli

2, 4-Dinitrofenyylihydratsiini (0,78 g, 3,93 mmol, 1 ekv.) 4-hydroksi-3-metoksibentsaldehydin (vanilliinin) (0,50 g, 1,04 ekv.) läsnäollessa, 4,09 mmol) saatiin raakatuote, joka puhdistettiin uudelleenkiteyttämällä kuumasta etanolista, jolloin saatiin tuote (0,91 g, 70 %) kirkkaanpunaisena kiinteänä aineena. (Pet. eetteri 70%: EtOAc 30%): 0,66. Mpt: 270-273°C. UV-Vis (MeOH) : 218 nm ja 394 nm. Infrapuna (puhdas) υmax cm-1: 3363 (OH), 3274 (NH), 3111 (C = CH), 1605 (ArC = C), 699 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,58 (1H, s, NH), 10,11 (1H, H-C4′, s, ArOH), 9,94 (1H, H-C3, s, ArH), 8,87 (1H, H-C5, s, ArH), 8,86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8,35 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7,97 (1H, H-C2′, d, J = 4,0, ArH), 7,66-7,76 (1H, H-C6′, d, J = 8,0, ArH), 6,38-6,35 (1H, H-C5′, d, J = 12,0, ArH), (3H, H-C4′, Ar-OCH3). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 150,7, 150,2, 148,6, 144,9, 137,1, 130,2, 125,6, 123,6, 123,1, 117,2, 116,1, 110,3, 56,2 ppm.

2.1.5. (Z)-2-(2, 4-Dinitrofenyyli) hydratsono) metyylifenoli

2, 4-Dinitrofenyylihydratsiini (0,78 g, 3,93 mmol, 1 ekv.) salisyylialdehydin (0,50 g, 4,09 mmol, 1,04 ekv.) läsnäollessa tuotti raakatuotteen, joka puhdistettiin uudelleenkiteyttämällä kuumasta etanolista, jolloin saatiin tuote (1,09 g, 92 %) kirkkaan oranssina kiinteänä aineena. (Pet. eetteri 70%: EtOAc 30%): 0,84. Mpt: 176-180°C; UV-Vis (MeOH) : 386 nm. Infrapuna (puhdas) υmax (cm-1): 3334 (OH), 3267 (NH), 3059 (C = CH), 1583 (ArC = C), 759 (ArH) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11,25 (1H, H-C3′, s, ArOH), 9,98 (1H (C1), s, NH), 9,11 (1H H-C3, s, ArH), 8,34-8.36 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8,33 (1H, H-C5, d, J = 4,0, ArH), 7,61-7,58 (1H, H-C6, d, J = 4,0, ArH), 7. 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 157,9, 151,3, 132,9, 131,4, 130,6, 123,7, 120,3, 117,2, 116,9, 115,3 ppm. HRMS (ESI): m/z laskettu + C13H10N4O5: 302.2400, löydetty: 301.0000.

2.1.6. 4-(2-(2-(2, 4-Dinitrofenyylihydrazono) metyyli) bentseeni-1, 3-dioli

2, 4-Dinitrofenyylihydratsiini (0,69 g, 3,48 mmol, 1 ekv.) 2, 4-dihydroksibentsaldehydin (0,50 g, 1,04 ekv.) läsnäollessa, 3,62 mmol) saatiin raakatuote, joka puhdistettiin uudelleenkiteyttämällä kuumasta etanolista, jolloin saatiin tuote (0,66 g, 2,07 mmol, 60 %) tummanpunaisena kiinteänä aineena. (Pet. eetteri 70 %: EtOAc 30 %): 0,51. Mpt: 270-274°C; UV-Vis (MeOH) : 403 nm. Infrapuna (puhdas) υmax (cm-1): 3364 (OH), 3094 (C = CH), 1612, 1584 (ArC = C) 592 (ArH). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 11,58 (1H, H-C3′, s, ArOH), 10,11 (1H, H-C1, s, NH), 9,94 (1H, H-C5′, s, ArOH), 8,87 (1H, H-C3, s, ArH), 8,86 (1H, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C4′, s, ArH), 8,36 (1H, H-C5, d, J = 12,0, ArH), 7,95-7,97 (1H, H-C6, d, J = 8,0, ArH), 7,54 (1H, H-C7, m, ArH), 7,54 (1H, H-C7, m, ArH), 7,54 (1H, H-C7, m, ArH), 7,54 (1H, H-C7, m, ArH)), 6,38 (6,38 (1H, H-C4′, s, ArH), 7,95-7,97 (1H, H-C6′, m, ArH), 7,54 (1H, H-C7, m, ArH), 6,38 (1H, H-C4′, s, ArH). 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) 161,8, 159,1, 148,2, 144,6, 136,7, 130,1, 129,3, 128,8, 123,6, 116,9, 112,0, 108,7, 102,1 ppm.

2.2. Yhdisteiden antimikrobinen arviointi

2.2.1. Koe-organismien lähde

Puhdasviljelmät Staphylococcus aureuksesta (SA) (ATCC 25923), Escherichia colista (EC) (ATCC 25922) ja Pseudomonas aeruginosasta (PA) (ATCC 27853) saatiin Kumasissa sijaitsevan Kwame Nkrumahin tiede- ja teknologiayliopiston (Kwame Nkrumah University of Science and Technology, KNUST), farmaseuttisen osaston farmasian laitoksen mikrobiologian osastolta. Klebsiella pneumoniae (KP), Candida albicans (CA) ja Streptococcus pneumoniae (SP) olivat kuitenkin kliinisiä kantoja, jotka saatiin Komfo Anokye Teaching Hospitalista, Kumasi, ja niitä viljeltiin KNUST:n farmasian laitoksella.

2.2.2. Tutkimusmenetelmät Klebsiella pneumoniae (KP), Candida albicans (CA) ja Streptococcus pneumoniae (SP) olivat kliinisiä kantoja. Pienimmän estävän pitoisuuden (MIC) määrittäminen

Hydratsonijohdannaisten ja vertailulääkkeiden siprofloksasiinin ja flukonatsolin pienimpien estävien pitoisuuksien (MIC) määrittämiseen käytettiin mikroliuoslaimennusmenetelmää. 96-kuoppaiset mikrotiterilevyt täytettiin 125 µl:lla kaksivahvuista ravinnelientä ja lisättiin eri pitoisuuksia hydratsonijohdannaisia. Vertailulääkkeet välillä 12.5 µl/ml-40 µl/ml käsiteltiin samalla tavalla. Kumpaankin kuoppaan lisättiin 1 × 105 cfu/ml testiorganismia. Kontrollilevy täytettiin ainoastaan ravintoaineliemellä ja testiorganismeilla. Testi- ja kontrollilevyjä inkuboitiin 37 °C:ssa (24 tuntia bakteerien osalta ja 48 tuntia sienten osalta), minkä jälkeen kuhunkin kuoppaan lisättiin 20 µl 1,25 mg/ml 3-(4,5-dimetyylitatsoli-2-yyli)-2,5-difenyylitetratsoliumbromidia (MTT). Havaittiin 20 minuutin kuluttua violetti värjäytyminen, joka osoittaa kasvua. Hydrazojohdannaisten ja vertailulääkkeiden vähimmäispitoisuuksia, joissa kuopissa ei tapahtunut värimuutosta, pidettiin MIC-arvoina. Määritykset tehtiin toistuvasti.

2.2.3. Määritykset tehtiin toistuvasti. Resistenssimodulaatiotutkimukset

Modulaatiotutkimuksia varten 96-kuoppalevyt täytettiin 125 µl:lla kaksivahvuista ravinnelientä ja lisättiin sama määrä 40 µl fenyylihydratsoneita. Lisättiin eri pitoisuuksia välillä 50 µL/ml – 7,812 µL/ml ja 15,625 µL/ml – 7,812 µL/ml siprofloksasiinia ja flukonatsolia. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 25 µl, joka sisälsi 1 × 105 cfu:ta testattavia organismeja, ja levyjä inkuboitiin 37 °C:ssa (bakteerien osalta 24 tuntia ja sienten osalta 48 tuntia), minkä jälkeen kuoppiin lisättiin 20 µl MTT:tä. Värin muuttuminen sameasta kuopasta violetiksi kirjattiin ylös ja sitä verrattiin vain vertailulääkkeiden MIC-arvoihin . Määritykset tehtiin toistoissa.

3. Tulokset ja keskustelu

3.1. Tulokset ja keskustelu

3.1. Tulokset ja keskustelu. Fenyylihydratsonien rakenneanalyysi

Yhdisteiden synteesiin käytettyä synteettistä reittiä seurattiin aldehydien tai ketonien ja hydratsiinien välisellä tavanomaisella kondensaatioreaktiolla ottaen huomioon rakennusaineiden kaupallinen saatavuus (kaavio 1). Retrosynteettisen irtikytkentämenetelmän avulla pystyttiin tunnistamaan erilaisia aldehydejä ja yksi ketoni haluttujen yhdisteiden synteesin keskeisiksi välituotteiksi. Prosessissa 2,4-dinitrofenyylihydratsiinin nopeuden määräävä aromaattinen nukleofiilinen hyökkäys karbonyyliin happamassa liuoksessa. Tätä seurasi reaktiivisen välituotteen dehydraatio, jolloin saatiin lopputuote 2, 4-dinitrofenyylifenyylihydratsonijohdannainen.

Kaavio 1

Yhdisteiden 1-6 synteettiset menetelmät ja reagenssit. Reagenssit ja olosuhteet: metanoli/tiivistetty H2SO4 (98 % v/v, 2 ml), 0-25 °C, 24 h.

Synteettisten menetelmien tiedot sisältyvät kokeelliseen osaan ja ne tulkitaan järjestyksen mukaisesti: sulamispistealue (Mpt.) celsiusasteina (°C), absorptiomaksimin aallonpituus ultravioletti-violettisäteilyspektristä, infrapunaspektri, 1H NMR , 13C NMR ja HRMS SA5:n (yhdiste 5) (yksi aktiivisimmista yhdisteistä) vahvistavana työkaluna.

3.1.1. UV-Vis-spektroskopia

Kaikkien kuuden yhdisteen spektrit määritettiin sekä ultravioletti- että näkyvällä aallonpituudella (200-800 nm) BP1:n vahvistustyökaluna lisätiedoissa käyttäen metanolia nollapisteenä. Absorptiokaistat 203 nm:ssä ja 403 nm:ssä, jotka saatiin syntetisoitujen fenyylihydratsonien elektronisissa spektreissä, voidaan lukea siirtymiksi, jotka johtuvat fenyylihydratsonien eri substituenttien auxokromista. Fenyylihydratsonien tiedetään absorboituvan eri aallonpituuksilla UV-säteilyalueella .

Yhdiste BP1 esimerkiksi osoitti metanoliin liuotettuna ja UV-säteilyalueella skannattuna absorptiota 203 nm:ssä, 314 nm:ssä ja 382 nm:ssä, mikä voisi johtua fenyylihydratsonien laajasta konjugaatiosta sen jälkeen, kun fenyylihydratsonit oli kytketty toisiinsa bentsofenonin ja 2,4-dinitrofenyylihydratsiinin kytkennällä. Yhdiste BP1:n absorptiomaksimi oli kuitenkin 382 nm:ssä, mikä voisi johtua konjugaation lisääntymisestä. Myös yhdisteiden BA2, MHB3, VL4, SA5 ja DHB6 absorptiomaksimi oli 378 nm:ssä, 392 nm:ssä, 394 nm:ssä, 386 nm:ssä ja 403 nm:ssä, kuten tukitiedoissa todetaan.

Laaja konjugaatio voi johtua fenyylihydratsonien kromoforien läsnäolosta, joihin kuuluvat BP1 (kaksi aromaattisen renkaan kromoforia), MHB3 (metahydroksi-apukromi), VL4 (hydroksi- ja metoksi-apukromi), SA5 (ortohydroksi-apukromi) ja DHB6 (kaksi hydroksi-apukromia). Tämä viittaa siihen, että hydratsonit, joissa oli auxokromeja ja ylimääräinen kromofori, olivat konjugoituneet pidemmälle, mikä johti siirtymään oikealle (batokromaattinen siirtymä). Infrapunaspektroskopia

Infrapunaspektri antaa kuvan yhdisteen funktionaalisista ryhmistä. Näytteenä olevan yhdisteen 5 infrapunaspektrin perusteella leveä kaista, joka ulottuu noin 3300 cm-1:stä ja viettää alifaattiselle CH-alueelle noin 3000 cm-1:een, osoittaa hydroksifunktionaalisen ryhmän, tässä tapauksessa fenolin funktionaalisen ryhmän, läsnäoloa, kuten tukitiedoissa on havaittu.

IR-spektristä (täydentävät tiedot) havaittiin myös, että yhdisteiden, kuten MHB3, VL4, SA5 ja DHB6, C = C -venytyskaistan terävä ja voimakas piikki oli alueella 1138-1620 cm-1 verrattuna BP1:een ja BA2:een, joissa ei ole hydroksifunktiota, kuten taulukossa 1 on esitetty. Hydratsiinin ja karbonyylien välisestä kondensaatioreaktiosta muodostuvan C = N:n läsnäolo peittyi bentseenin aromaattisiin sp2-hybridisoituneisiin hiileihin (C = C), jotka värähtelevät 1138-1640 cm-1:ssä riippuen substituenttikiinnityksistä. Koska C = N -värähtelytaajuudet sijoittuvat 1580-1600 cm-1 -alueelle, niiden kaistoja ei voida selvästi erottaa niiden aromaattisten C = C -vastineiden läsnä ollessa, kuten kokeellisista tiedoista käy ilmi.

Yhdisteet Koodi Väri Mol. For. Mol. Wt. (g/mol) Tuotos (%) BP1 Kirkkaan oranssi C19H14N4O4 362.34 85 BA2 Tummankeltainen C13H10N4O4 286.24 78 MHB3 Tummanpunainen C13H10N4O5 302.24 92 VL4 Kirkas punainen C14H12N4O6 332.27 70 SA5 Kirkkaan oranssi C13H10N4O5 302.24 64 DHB6 Tummanpunainen C13H10N4O6 318.24 60

Taulukko 1

Syntetisoitujen fenyylihydratsonien kemialliset rakenteet ja fysikaaliset tiedot.

3.1.3. Kemiallinen rakenne ja fysikaaliset tiedot. Ydinmagneettiresonanssi (NMR)-spektroskopia

NMR-määritykset tehtiin kaikille kuudelle syntetisoidulle fenyylihydratsonille käyttäen yksiulotteista (1D) NMR-tekniikkaa (1H ja 13C) ja kaksiulotteista NMR-tekniikkaa, distortionless enhancement by polarization transfer for quaternary carbons (DEPT-Q). Nämä tiedot on osoitettu kullekin yhdisteelle kokeellisessa osassa. Rakenteet vahvistettiin 1H-NMR-, 13C-NMR- ja DEPT-Q-spektritiedoilla, jotka on esitetty lisätiedoissa yhdisteiden BP1, BA2, MHB3, VL4, SA5 ja DHB6 osalta. DHB6:n (yhdiste 6) osalta (kuva 2, taulukko 1) ja protoni-NMR:n (lisätiedot) perusteella kemiallinen siirtymä, joka osoittaa resonanssia kaukana alhaalla, merkitsi hydroksiprotonin läsnäoloa singlettisignaalilla. Se resonoi kauempana alhaalla kuin sekundaarisen amiinin protoni, koska elektronegatiivisen hapen suojaava vaikutus on lisääntynyt. Tämä kemiallinen siirtymä oli hieman suurempi kuin hydroksyyliryhmän ( 9,94 ppm), koska ensin mainittu on lähempänä imiinisidoksen elektronegatiivisen typpiatomin kemiallista ympäristöä. Näin ollen ensimmäistä hydroksin singlettisignaalia 11,54 ppm:ssä seurasi typpiryhmän elektronegatiivisuudesta johtuva singlettisignaali sekundaarinen aminoprotoni 10,11 ppm:ssä ennen toista hydroksisignaalia. Kahden elektronegatiivisen nitro-ryhmän välissä oleva aromaattinen protoni oli seuraava signaali, joka resonoi alempana 8,86 ppm:ssä. Tätä seurasi protoni lähellä tertiääristä aminoryhmää. Iminiprotoniin kiinnittynyt tertiäärinen aminoryhmä aiheutti suojauksen poistumisen ja imiiniprotonien resonoimisen alaspäin 8,86 ppm:ssä singlettisignaalilla. Para-asemassa olevaa nitro-ryhmää lähimpänä oleva yksinäinen protoni oli seuraava signaali, jonka dublettipiikki oli 7,95-7,97 ppm:ssä. Toinen yksinäinen protoni, joka oli lähimpänä vähemmän elektronegatiivista sekundaarista aminoryhmää, antoi myös dublettisignaalin 7,64-7,66 ppm:ssä. Kaksi muuta yksinäistä protonia (toinen diolin välissä ja toinen orto-suunnassa imiinisidokseen nähden) antoivat multiplettisignaalin 7,52-7,54 ppm:ssä, kun taas lähimpänä para-hydroksiryhmää ja kahden hiilisidoksen päässä imiiniryhmästä oleva protoni antoi dublettisignaalin 6:ssa.38 ppm.

Kuva 2

DBH6:n (yhdiste 6) kemiallinen rakenne .

Primaaristen, sekundaaristen, sekundaaristen, tertiaaristen ja kvaternaaristen hiilivetyjen erottelemiseen käytettiinDEPT-Q:tä. DEPT-Q:ssa metyyli- (CH3) ja metiinisignaalit (CH) näkyvät positiivisessa vaiheessa ylöspäin, kun taas metyleeni- (CH2) ja kvaternääriset signaalit näkyvät negatiivisessa vaiheessa alaspäin. DHB6:n DEPT-Q-spektrissä (lisätiedot) näkyy ylöspäin suuntautuvia hiilisignaaleja, jotka edustavat tässä tapauksessa vain kuutta metaanihiiltä, jotka esiintyvät pisteissä 161,8, 159,1, 148,2, 136,7, 130,1 ja 112,0, mikä vahvistaa aromaattiset metaanihiilet, ja seitsemää kvaternääristä hiiltä, jotka esiintyvät pisteissä 148,2, 130,1, 129,2, 123,6, 116,9, 108,7 ja 102,9. Nämä signaalit edustavat vain kuutta metaanihiiltä. Muiden yhdisteiden DEPT-Q-arvot löytyvät lisätiedoista.

3.1.4. Massaspektroskopia

Massaspektroskopiaa käytetään tarkkojen molekyylipainojen määrittämiseen ja yhdisteiden fragmentointiin ionisointitekniikoiden avulla . Yhdiste SA5 fenyylihydratsoni oli yksi aktiivisimmista yhdisteistä antimikrobisen arvioinnin jälkeen. Sähkösuihkuionisaation (ESI) massaspektrissä molekyyli-ionipiikki negatiivisessa moodissa oli 301,0000 (M-H+), joka on todellinen massa, jonka toleranssialue on 0,24 (0,41 %) teoreettisesta massasta 302,2400. Tämä vahvisti yhdiste SA5:n molekyylipainon.

Massaspektroskopiaa käytettiin yhden aktiivisimman yhdisteen molekyylipainon vahvistamiseen, joten sitä ei sovellettu muihin yhdisteisiin.

4. Antimikrobisen vaikutuksen arviointi

4.1. Antimikrobinen vaikutus

. Pienimmät estävät pitoisuudet (MIC)

Pienin estävä pitoisuus (MIC) on mikrobilääkkeen pienin pitoisuus, joka estää patogeenin näkyvän kasvun 24 tunnin (bakteerit) ja 48 tunnin (sienet) inkuboinnin jälkeen . Fenyylihydratsonien ja kahden standardiantibiootin (siprofloksasiini ja flukonatsoli) MIC-arvoja arvioitiin mikroliuoslaimennustestillä kuuden patogeenisen mikro-organismin paneelia vastaan:

Kaikki yhdisteet osoittivat heikkoa antimikrobista aktiivisuutta koeorganismeja vastaan testipitoisuuksilla, kuten taulukossa 2 havaitaan. BP1 osoitti kuuden yhdisteen joukossa suurinta antimikrobista aktiivisuutta valittuja testieliöitä vastaan. BA2:lla oli kuitenkin vähiten antimikrobista aktiivisuutta, sillä sen MIC-arvo oli 699 µM kaikkia koeorganismeja vastaan. MHB3:n MIC-arvo oli 562 µM C. albicansia vastaan ja 662 µM tai enemmän muita testin organismeja vastaan. VL4:n MIC-arvo oli 602 µM kaikkia testin organismeja vastaan paitsi S. pneumoniae (MIC = 300 µM). SA5:n MIC-arvot S. pneumoniae- ja K. pneumoniae -bakteeria vastaan olivat 165 µM ja 331 µM, kun taas S. aureus-, E. coli-, P. aeruginosa- ja C. albicans -bakteereille sen MIC-arvo oli korkeampi, 662 µM. DHB6 osoitti aktiivisuutta S. pneumoniae-, K. pneumoniae- ja C. albicans -bakteereja vastaan MIC-arvon ollessa 314 µM, kun taas S. aureus-, E. coli- ja P. aeruginosa -bakteereille sen MIC-arvo oli 628 µM ja sitä suurempi. Antibakteerisena vertailulääkkeenä käytettiin siprofloksasiinia, ja MIC-arvot olivat 2,36 µM P. aeruginosa-, S. pneumoniae- ja K. pneumoniae -bakteereita vastaan, kun taas S. aureus- ja E. coli -bakteereita vastaan MIC-arvot olivat 4,72 µM. Sienilääkkeenä käytettiin flukonatsolia, ja MIC-arvo oli 327 µM C. albicansia vastaan. Fenyylihydratsonien MIC-arvo kahta gramnegatiivista organismia vastaan vaihteli 552 µM:stä 699 µM:iin, kun taas siprofloksasiinistandardin MIC-arvo oli 4,72 µM ja 2,36 µM (taulukko 2).

4.2. Mikrobilääkkeet. Resistenssin modulaatioaktiivisuus

Kestävyyden modulaatiokokeella tutkittiin fenyylihydratsonien taipumusta sub-MIC-arvoilla parantaa joidenkin kaupallisten antibioottien aktiivisuutta tunnettuja resistenttejä kantoja vastaan. Taulukoista 2 ja 3 käy ilmi, että BP1 (yhdiste 1), jonka sub-MIC-arvo oli 50 µM S. pneumoniae -bakteeria vastaan, alensi siprofloksasiinin MIC-arvoa 2,36:sta 1:een.078 µM, mikä vastaa 54,32 prosentin vähennystä siprofloksasiinin MIC-arvossa. BP1 paransi myös siprofloksasiinin tehoa K. pneumoniae -bakteeria vastaan 50 µM:n sub-MIC-arvon alapuolella 2,36 µM:stä 1,078 µM:iin, mikä merkitsee 54,32 %:n vähennystä antibioottien MIC-arvossa. BP1 muokkasi flukonatsolin aktiivisuutta C. albicansia vastaan 327 µM:stä 2,156 µM:iin, mikä merkitsee 99,34 prosentin vähennystä flukonatsolin MIC-arvossa. Vastaavasti BA2 paransi siprofloksasiinin aktiivisuutta S. pneumoniae -bakteeria vastaan ja alensi siprofloksasiinin MIC-arvoa 2,36 µM:stä 1,36 µM:iin, mikä merkitsee 42,37 prosentin vähennystä. Lisäksi BA2 muokkasi myös flukonatsolin aktiivisuutta 50 µM:n sub-MIC-arvolla C. albicansia vastaan ja aiheutti sen MIC-arvon alenemisen 327 µM:stä 1,23 µM:iin, mikä merkitsee 99,6 prosentin alenemista MIC-arvossa.

MHB3 moduloi siprofloksasiinin aktiivisuutta S. pneumoniae- ja Klebsiella pneumoniae -bakteereja vastaan aiheuttaen antibioottien MIC-arvon alenemisen 2,36 µM:sta 1,29 µM:iin. Tämä MIC-arvon lasku osoitti 45,33 prosentin vähenemistä. MHB3 osoitti myös flukonatsolin aktiivisuuden modulointia 50 µM:n sub-MIC-arvolla Candida albicansia vastaan ja alensi MIC-arvon 5,109:ään 327 µM:stä, mikä osoitti 98,43 %:n enimmäisvähennystä. VL4 paransi siprofloksasiinin tehoa 50 µM:n sub-MIC-arvolla S. pneumoniae:ta ja K. pneumoniae:ta vastaan. Antibiootin MIC-arvo laski 2,36 µM:stä 1,176 µM:iin molemmissa tapauksissa. Tämä MIC-arvon lasku kuvastaa 50,17 prosentin vähenemistä. VL4 moduloi jälleen flukonatsolin tehoa 50 µM:n sub-MIC-arvolla C. albicansia vastaan ja alensi MIC-arvon 327 µM:stä 1,176 µM:iin, mikä osoitti 99,64 %:n enimmäisreduktiota.

Lisäksi yhdiste 5 (SA5) moduloi siprofloksasiinin tehoa 50 µM:n sub-MIC-arvolla S. pneumoniae:ta ja K. pneumoniae:ta vastaan. MIC-arvo aleni 2,36 µM:stä 1,29 µM:iin molemmissa tapauksissa, mikä johti 45,34 prosentin vähenemiseen. SA5 muokkasi jälleen flukonatsolin tehoa 50 µM:n sub-MIC-arvolla C. albicansia vastaan ja alensi sen MIC-arvon 327 µM:stä 1,29 µM:iin, mikä merkitsi hyvää 99,61 %:n vähenemistä. DHB6 (yhdiste 6) muokkasi myös siprofloksasiinin aktiivisuutta S. pneumoniae- ja K. pneumoniae -bakteereita vastaan 50 µM:n sub-MIC-arvolla ja alensi sen MIC-arvoa 2,36 µM:stä 1,23 µM:iin molemmissa tapauksissa, mikä merkitsee 47,88 %:n MIC-arvon alenemista. DHB6 muokkasi myös flukonatsolin aktiivisuutta 50 µM:n sub-MIC-arvolla C. albicansia vastaan ja alensi sen MIC-arvoa 327 µM:stä 1,23 µM:iin, mikä vastaa 99,62 prosentin MIC-arvon alenemista. SA5 ja BP1 olivat muita neljää fenyylihydratsonia parempia resistenssiä moduloivassa aktiivisuudessa yhdessä siprofloksasiinin kanssa, jonka MIC-arvo oli 2,58 µM P.aeruginosaa vastaan, ja seuraavana oli BP1 (17,2 µM). Näin ollen orto-hydroksiryhmän läsnäolo SA5:ssä ja aromaattinen ketoniryhmä saattavat olla olennaisia resistenssiä moduloivan vaikutuksen kannalta yhdessä siprofloksasiinin kanssa gramnegatiivista P.aeruginosa- ja E. coli -bakteeria vastaan. Lisäksi metahydroksiryhmän (MHB3), hydroksi- ja metoksiryhmän (VL4) läsnäolo ja substituentin puuttuminen BA2:n bentsaldehydiosasta paransivat myös aktiivisuutta, ja niitä voitaisiin harkita tulevaa lääkekehitystä varten. K. pneumoniae, toinen vakavia infektioita aiheuttava gramnegatiivinen vastapuoli, oli herkempi fenyylihydratsoneille, joiden teho oli 138-699 µM. Yhdistämällä fenyylihydratsonien subinhibitorisia pitoisuuksia siprofloksasiinin kanssa K. pneumoniaen resistenssiraja pieneni, mikä mahdollisti huomattavasti alhaisemman MIC-arvon, joka oli 1,078 5,46 µM:stä 5,46 µM:iin, mikä on vaikuttavampi suuntaus kuin P. aeruginosa ja E.coli.

Fenyylihydratsoneilla oli samankaltainen aktiivisuus grampositiivisia organismeja vastaan 87,3-699 µM:n välillä, mikä osoittaa myös Staphylococcus aureuksen ja Streptococcus pneumoniaen resistenssiominaisuudet.

5. Johtopäätös

Kuuden uuden fenyylihydratsonin kirjasto syntetisoitiin ja karakterisoitiin onnistuneesti: 1-(2, 4-dinitrofenyyli)-2-(difenyylimetyleeni)hydratsiini , 1-bentsylideeni-2-(2, 4-dinitrofenyyli)hydratsiini , 3-(2-2-(4-dinitrofenyyli)hydratsono)metyylifenoli, 4-(2-(2-(2, 4-dinitrofenyyli) hydrazono) metyyli)-2-metoksifenoli , (Z)-2-(2, 4-dinitrofenyyli) hydrazono) metyylifenoli ja 4-(2-(2-(2, 4-dinitrofenyyli)hydrazono) metyyli)bentseeni-1, 3-dioli.

Tulevaisuuden lääkkeiden suunnittelussa ja optimoinnissa fenyylihydratsoneja voidaan pitää rakenteellisina selkärankoina niiden synteettisen toteutettavuuden ja hyvän saannon vuoksi. Yhdisteet osoittivat heikkoa antimikrobista ominaisuutta, mutta osoittivat vahvaa vastustuskykyä moduloivaa vaikutusta yhdistettynä vakiolääkkeisiin. Standardilääkkeiden aktiivisuus parani merkittävästi ja MIC-arvot pienenivät huomattavasti.

Lyhenteet

Tietojen saatavuus

Tutkimuksen tiedot ovat saatavilla Kwame Nkrumah University of Science and Technology farmaseuttisen tiedekunnan farmaseuttisen kemian laitoksen arkistossa.

Interintäristiriidat

Tekijät ilmoittavat, että heillä ei ole mitään eturistiriitoja, jotka liittyisivät tämän artikkelin julkaisemiseen.

Tekijöiden kontribuutiot

A.A., A.B., I.A., Y.D.B., C.D.K.A. ja B.K.H. ideoivat tutkimustyön ja laativat käsikirjoituksen. C.D. K.A., A.B. ja A.A. suunnittelivat ja toteuttivat yhdisteiden synteesin. C.D.K.A., A.A. ja I.A. kehittivät käsitteellisen kehyksen ja laativat käsikirjoituksen. C.D.K.A. ja B.K.H. tulkitsivat spektritulokset ja suorittivat rakenteen selvittämisen. Y.D.B. ja A.A. suorittivat in vitro -mikrobilääkemäärityksen ja toimittivat sen kokeelliset tiedot ja tulosten tulkinnan.

Kiitokset

Tekijät ovat hyvin kiitollisia kaikelle farmaseuttisen kemian laitoksen henkilökunnalle ja teknikoille, farmaseuttinen tiedekunta, KNUST, Kumasi, Ghana, heidän tuestaan. Kirjoittajat kiittävät suuresti Francis Amankwahia KNUSTin farmasian laitokselta (mikrobiologian osasto) teknisestä tuesta.

Täydentävät aineistot

Täydentävä tiedosto sisältää kaikki spektrit. (Täydentävät aineistot)