4.04.4.2 Kalan tuoksu ja epäpuhtaudet
Haihtuvien aineiden uuttomenetelmien käyttösovellusten joukossa oli kehitettävissä48 nopea ja helppo menetelmä joidenkin epäpuhtauksien, kuten 2-fenoksietanolijäämien pitoisuuksien määrittämiseksi kalojen kudoksissa ja veriplasmassa, ja sen jälkeen menetelmän käyttäminen anestesiakäsitellyissä kaloissa olevien 2-fenoksietanolijäämien dynamiikan seuraamiseen.
2-fenoksietanoli (etyleeniglykolimonofenyylieetteri, C8H10O2) on lupaava anestesia-aine, jota käytetään kalastuksessa ja vesiviljelyssä.
Kehitettiin uusi menetelmä, jossa käytetään kohdeanalyytin kiinteäfaasimikrouuttoa (SPME, solid-phase microextraction) näytteen headspace-ilmanäytteestä ja sen jälkeistä kaasukromatografia-massaspektrometriaa (GC-MS, gas chromatography-mass spectrometry).48. Sekä näytteen käsittely, jonka tavoitteena oli 2-fenoksietanolin maksimaalinen siirtyminen headspaceen, että SPME-GC-MS-olosuhteet optimoitiin huolellisesti.
Optimoinnissa testattiin erilaisia näytteen valmistelu- ja SPME-olosuhteita.48
Kudosnäytteitä, jotka olivat peräisin kaloista, jotka eivät olleet altistuneet 2-fenoksietanolille, käytettiin SPME-menetelmän kehittämiseksi ja kuvaamiseksi. Piikitetyt näytteet ilman matriisimuuntelua valmistettiin seuraavasti: 5 μl työskentelystandardeja lisättiin 2 g:aan jauhettua kalakudosta, jotta lopulliseksi piikitystasoksi saatiin 3-382 mg kg-1.
Sen jälkeen testattiin useita vaihtoehtoisia matriisimuutoksia: (I) 2 g joko piikattua kudosta tai kudosta, jossa oli syntyneitä jäämiä, siirrettiin 10 ml:n headspace (HS) -injektiopulloon, johon lisättiin 2 ml ultrapuhdasta vettä; (II) 2 g kudosta, jossa oli syntyneitä jäämiä, jauhettiin 2 g:lla natriumsulfaattia; ja (III) 2 g kudosta, jossa oli syntyneitä jäämiä, jauhettiin 2 g:lla natriumsulfaattia ja upotettiin sen jälkeen 3 ml:aan ultrapuhdasta vettä 10 ml:n HS-injektiopullossa. Kaikkia muokattuja näytteitä ravisteltiin voimakkaasti 20 minuutin ajan ennen SPME-analyysiä.
Analyyttien uuttamisessa tehokkaimman kuidun tunnistamiseksi arvioitiin kolmea kaupallisesti saatavilla olevaa SPME-kuitua (PA, PDMS/CAR/DVB ja CW/DVB), joilla oli erilainen stationäärifaasin selektiivisyys. Kalakudos (muokkaamaton), johon oli lisätty 33 mg kg-1, toimi kontrollina näissä kuituja testaavissa kokeissa.
Kaikki uutot tehtiin samoissa olosuhteissa (60 minuutin sorptio 30 °C:ssa). PA- ja CWX/DVB-kuiduilla saatiin epätyydyttäviä uuttotehokkuustuloksia (detektorin vasteen eli signaali-kohinasuhteen vertailun perusteella). Sekoitettu PDMS/CAR/DVB-kuitu tuotti parhaat tulokset, ja siksi sitä käytettiin myöhemmissä kokeissamme.
Kokeet, joissa keskityttiin 2-fenoksietanolin uuton dynamiikkaan, tehtiin 5, 15, 30, 40 ja 60 minuutin uuttoajoilla 30 °C:ssa. Kokeet suoritettiin käyttäen kalakudosnäytteitä, joihin oli lisätty 1 mg kg-1. Uutetun analyytin määrä kasvoi jatkuvasti uuttoaikavälien aikana. Jotta laboratorion näytteiden läpimeno pysyisi hyväksyttävällä tasolla, uuttoaikaa ei pidetty enää pidempään mahdollisena. Jatkoanalyysejä varten valittiin 60 minuutin uuttoaika.
Käyttämällä divinyylibentseeni/karboksi/polydimetyylisiloksaani-kuitua (PDMS/CAR/DVB) 60 minuutin näytteenvalmistukseen 30 °C:ssa ja MS/MS-tilassa toimivaa ioniloukkuilmaisinta Klimancova et al.48 saivat havaitsemisrajan (LOD) 0,03 ja määritysrajan (LOQ) 0,1 mg kg-1 näytettä. Menetelmä oli lineaarinen välillä 0,1-250 mg kg-1, ja näytematriisista ja lisäystasosta riippuen toistettavuus (ilmaistuna suhteellisena standardipoikkeamana, R.S.D.) oli 3-11 %.48
Organiset elohopeayhdisteet, joista metyylielohopea on yleisin, ovat erityisen huolestuttavia niiden lisääntyneen myrkyllisyyden vuoksi. Vastauksena kasvavaan kysyntään on viime vuosikymmenen aikana kehitetty useita analyysitekniikoita orgaanisten elohopeayhdisteiden spesifioimiseksi biologisista näytteistä.
Viime aikoina kiinteän faasin mikroextraktiosta (SPME, solid-phase microextraction) on tullut laajalle levinnyt liuotinvapaa tekniikka orgaanisten metalliyhdisteiden GC-määrityksessä. SPME ei ainoastaan tarjoa mahdollisuutta nopeaan, liuotinvapaaseen, integroituun näyteuutto-näytteenotto-näytteenottojärjestelmään, vaan se voi myös tarjota paremman analyytin esikonsentroinnin kuin neste-nesteuutotekniikat (LLE). Sovellettaessa headspace (HS) -näytteen esikäsittelytekniikkaa voidaan lisäksi suorittaa matriisin erottelu, joka perustuu analyytin ja muiden näyteliuoksessa olevien yhdisteiden haihtuvuuseroihin. On kuitenkin huomattava, että myös muut integroidut liuotinvapaat uutto-esikonsentrointimenetelmät, kuten purge-and-trap-tekniikkaa tai stir bar sorptive extraction (SBSE) -tekniikkaa soveltavat menetelmät, ovat houkuttelevia vaihtoehtoja SPME:lle erilaisissa metalliorgaanisissa määrityksissä.
Kustannustehokkaan analyyttisen menetelmän (SPME-GC-pyrolyysi-AFS-järjestelmä) soveltamista MeHg:n määritykseen tyypillisistä ravinnosta saatavista äyriäisruokaa sisältävistä äyriäisnaytteistä ehdotettiin.49 Tutkimuksessa keskityttiin tutkimaan muutoksia, joita tarvitaan vakiintuneisiin menetelmiin, joihin kuuluu emäksinen pilkkominen, jotta voidaan käyttää vesifaasifenylointia ja SPME-näytteenvalmistusta analysoitaessa elintarvikenäytteitä, joissa on monimutkaisia matriiseja, jotka sisältävät MeHg:tä välillä 100 ng g-1.
Näytteenvalmistusmenetelmä: 250 mg lyofilisoitua ja jauhettua näytettä tai sertifikaatin vertailumateriaalia (CRM) punnittiin tarkasti 30 ml:n puhtaaseen lasipulloon ja lisättiin 5-6 ml 25 % (w/v) KOH:ta metanoliin tai 18 % (w/v) NaOH:ta metanoliin (molemmat olivat 4,5 M). Tämän jälkeen injektiopullo suljettiin PTFE-vuoratulla kierrekorkilla ja asetettiin ultraäänihauteeseen 3 tunniksi 75 °C:n lämpötilaan. Kun injektiopullon annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, menettely vaihteli näytteen MeHg-pitoisuuden mukaan. Jos näytteet sisälsivät paljon MeHg:tä (muutama μg-1 MeHg:tä kuivapainosta), koko mädäte huuhdeltiin huolellisesti 50 ml:n mittapulloon. Tästä liuoksesta pipetoitiin 1 ml 10 ml:n mittapulloon.
Jos haluttiin käyttää standardilisäysmenetelmää, liuokseen lisättiin myös 1 ml vesipitoista MeHgCl-standardia ennen sen laimentamista nimellistilavuuteen. Standardin lisäystasot vastasivat tulosta 1×, 2× tai 4× näyteliuoksen odotettua analyyttipitoisuutta.
Matalapitoisissa näytteissä (jotka sisälsivät vain noin 100 ng g-1 MeHg:tä tai vähemmän) sen jälkeen, kun injektiopullon annettiin jäähtyä huoneenlämpötilaan, mädätettä ravisteltiin muutaman sekunnin ajan, minkä jälkeen 5 ml pipetoitiin 6 ml:n lasiseen sentrifugipulloon. Liuosta sentrifugoitiin 15 minuutin ajan 4100 g:ssa ja 20 °C:ssa. Supernatantista siirrettiin 1 ml 10 ml:n mittapulloon ja suoritettiin vakiolisäysmenetelmä edellä kuvatulla tavalla.
Kummassakin tapauksessa 1 ml 10 ml:n laimennetuista (ja piikitetyistä) liuoksista pipetoitiin 30 ml:n lasipulloihin, joista kumpikin sisälsi 10 ml:aa 1 M:n, pH = 5:n asetaattipuskuria. Tällöin pulloon asetettiin puhdas PTFE-pinnoitettu sekoitustanko. Lopuksi lisättiin 1 ml tuoretta 1-prosenttista NaBPh4:ää, ja injektiopullo suljettiin välittömästi ruuvikorkilla, joka oli varustettu PTFE-pinnoitetulla kumiseinällä. Injektiopullo asetettiin magneettiselle sekoituslevylle, ja voimakkaan sekoituksen aikana (700 rpm) suoritettiin SPME-uutto. Kuitu päällystettiin 100 μm:n kalvolla poly(dimetyylisiloksaania) (PDMS). Uuttamisen jälkeen kuitu tuotiin GC:n lämmitettyyn sisääntuloaukkoon termistä desorptiota ja pyrolyysi-AFS-määritystä varten.
Näytteiden kokonais-Hg-pitoisuus määritettiin suoralla elohopeamäärityksellä käyttäen 100 mg:aa kiinteää näytettä ja ulkoista kalibrointia.49
Toinen tekniikka metyylielohopean määritykseen kalakudoksessa, joka koostui GC-ICP-MS-järjestelmästä, jossa oli analyytin uuttamiseen tarkoitettu SPME- (PDMS-) tekniikka, ehdotettiin.41
Näytteen valmistelu: 0,25 g näytettä, jossa oli sopiva määrä rikastettua MM198 Hg-piikkiä ja 20 ml 25 % (m/v) metanolista KOH-liuosta, ravistettiin 5 tuntia ja säilytettiin 4 °C:ssa analyysiin asti. Rikastetun MM198 Hg-piikin pitoisuuden kvantifioimiseksi valmistettiin kuusi käänteistä piikki-isotooppilaimennuskalibrointinäytettä. 0,200 ml rikastettua MM198 Hg-piikkiliuosta ja 0,240 ml 2,042 μg ml-1 (tai 1,993 mg ml-1) luonnollisen runsauden mmHg-liuosta pipetoitiin tarkasti injektiopulloon ja laimennettiin metanolilla 10 ml:ksi. SPME headspace -näytteen valmistusta varten vain 100 ml digest- tai käänteispiikki-isotooppilaimennoksen kalibrointinäytettä (SPME GC-ICP-MS:n suuren herkkyyden vuoksi) siirrettiin 50 ml:n lasiseen injektiopulloon kvantisointia varten.
Kun 20 ml 1 mol l-1 NaAc-puskuriliuosta (NaAc-puskuriliuosta) ja 1 ml 1-prosenttista NaBPr4:aa (NaBPr4-prosenttia) lisättiin, injektiopullo korkitettiin PTFE:llä päällystetyllä piikumisella väliseinällä. SPME-neula työnnettiin septumin läpi ja headspace-näytteen valmistus suoritettiin 10 minuutin ajan. Uuttamisen aikana liuosta sekoitettiin voimakkaasti teflonpäällysteisellä magneettisella sekoitustangolla. Kerätty analyytti desorboitiin sitten SPME-kuidusta GC-kolonniin.41