Tulokset
Raportoimme demografiset tiedot ja kliinisen fenotyypin 36:lta geneettisesti vahvistetulta AME-potilailta, jotka kuuluivat kansainväliseen harvinaisten steroidihäiriöiden konsortioon. Suurin osa potilaista oli omanilaista (22 potilasta 36:sta) ja persialaista (6 potilasta 36:sta) syntyperää, ja 75 prosenttia heistä oli peräisin sukulaisavioliitoista, jotka solmittiin pääasiassa Omanin sisällä (kuva 1B ja taulukko S1). AME-diagnoosin mediaani-ikä oli 4,6 vuotta (vaihteluväli: 0,1-15), ja kohortti jakautui tasaisesti kummallekin sukupuolelle. Suurin osa potilaista (86 %) oli syntynyt keskosena, ja 76 % heistä oli syntynyt raskausikään nähden pienenä. Kuvasta 1A käy ilmi, että kohortissamme oli kuusi missense-, yksi insertio-, kaksi deletio- ja kolme frameshift-mutaatiota sekä kaksi indeliä. AME:n patofysiologian perusteella oli odotettavissa, että valtimoverenpaineen keskiarvo oli koholla yli 90. persentiilin kaikilla koehenkilöillä (kuva 1C). Keskimääräinen seerumin kaliumpitoisuus diagnoosihetkellä oli alhainen, 2,72 mmol/l (vaihteluväli: 1,5-4,1 mmol/l), ja seerumin bikarbonaattipitoisuus oli korkea, 29,5 mmol/l (vaihteluväli: 20-38 mmol/l) (kuvat 1 D ja E). Seerumin aldosteronipitoisuudet olivat odotetusti alhaiset (kuva 1F), ja kahdella potilaalla pitoisuudet olivat koholla epäselvistä syistä johtuen. Lisäksi reniinipitoisuudet olivat alhaiset lukuun ottamatta kahta potilasta (10,4 ja 14 ng/ml/h), jotka olivat hoidossa (taulukko S1). 29 potilaan osajoukossa keskimääräinen (THF + alloTHF)/THE-suhde, joka edustaa kortisolin ja kortisonin tärkeimpiä virtsametaboliitteja, oli merkitsevästi koholla 19:ssä (vaihteluväli: 3-55, normaali: 1,0) (kuva 1G). Huomionarvoista on, että 27 potilaalla 36:sta (75 %) oli myös nefrokalsinoosi. Nefrokalsinoosi voi johtua kroonisesta pitkäaikaisesta hypokalemiasta, kuten on todettu esimerkiksi Bartterin oireyhtymässä tyyppi III (14).
Ymmärtääksemme, voisiko HSD11B2-puutoksen kliinistä fenotyyppiä ennustaa tarkastelemalla tietyn HSD11B2-mutaation indusoimia entsyymirakenteen muutoksia, suoritimme in silico -analytiikkaa käyttäen kolmea estrogeenistä HSD17B1:tä, joilla oli 27 %:n sekvenssiyhtäläisyys HSD11B2:n kanssa 284 aminohapolla (kuva S1A). Ihmisen HSD11B2-mallissa näkyi tyypillinen konservoitu NAD-sitova Rossmann-taittomotiivi (Kuva S1B), jossa on viereinen substraatin sitoutumiskohta (Kuva S1 C ja D). HSD11B2:n monomeeri- ja dimeerimuotojen 500 ns:n MD-simuloinnit osoittivat vakaan mallin, jossa proteiini taittuu vakaasti (Kuva S1 E-H). Käytimme Internal Coordinate Modeling (ICM) -ohjelmistoa (www.molsoft.com) (18) määrittääksemme AME-potilailla todettujen missense-mutaatioiden tai kokeellisesti kehitettyjen mutaatioiden ΔΔG:n. Kaikissa mutaatioissa (kuva 2A) ΔΔG-arvot kasvoivat, mikä viittaa proteiinin stabiilisuuden ja toiminnan menetykseen (kuva 2B).
Häiritseviä mutaatioita, jotka vaikuttavat HSD11B2:n dimeeriliittymään. (A) Ihmisen HSD11B2-dimeerimalli, joka on rakennettu käyttäen olemassa olevia HSD17B1-kiderakenteita: 1IOL (yhteiskiteytetty 17β-estradiolin kanssa), joka oli täydellisin rakenne, josta ei puuttunut yhtään jäännöstä; 1JTV (1,5 Å), joka oli yhteiskiteytetty testosteronin kanssa ja jolla oli korkeampi resoluutio kuin 1IOL:lla (2,3 Å); ja 1FDV, joka oli yhteiskiteytetty koentsyymi NAD:n kanssa. Kaikkien tunnettujen mutatoituneiden jäännösten paikat on merkitty. (B) ∆∆G-arvot vakaville (punainen) tai lieville (musta) HSD11B2-mutaatioille. (C) Dimeerin rajapinnassa muodostuu kaksi R186-E190-ioniparia vierekkäisten alayksiköiden kaksinkertaisen käänteisen symmetrian välille. Monomeerin (D) tapauksessa muodostuu intrahelikaalinen ionipari, joka on samanlainen kuin HSD17B1-malleissa muodostunut R112- ja E120-suolasilta. (E) Yhdelle alayksikölle kartoitettujen mutaatioiden (sininen) spatiaaliset sijainnit. Kaksi alayksikköä on väritetty selvästi (ruskea ja sininen). NAD+ (keltainen) ja kortisoli (vihreä) on kuvattu tikkuina. Ioniparin vuorovaikutus dimeerin rajapinnassa on vakaa koko 500 ns:n simulaation ajan (F). Intrahelikaalisessa vuorovaikutuksessa havaitaan kuitenkin jonkin verran vaihtelua, joka johtuu monomeerin konformaatiomuutoksista (G). (H) R186 muodostaa ioniparivuorovaikutuksia viereisen alayksikön E190:n kanssa. R186C-mutaatio johtaa ioniparivuorovaikutuksen häviämiseen. Myös monomeerin R186:n ja E190:n välille muodostunut intrahelikaalinen ionipari menetetään. (I) A237V-mutaatio lisää hydrofobisuutta rajapinnassa. (J) D244 muodostaa alayksikön sisäisen ioniparin vuorovaikutuksen R336:n kanssa sekä vetysidoksia viereisen alayksikön R360:n kanssa. Mutaation asparagiinin polaarinen varaukseton sivuketju ei pysty tarjoamaan rakenteellista vakautta. (K) L251S-mutaation OH-ryhmä muodostaa vetysidoksen viereisen alayksikön R361:n kanssa, mikä tehostaa vuorovaikutusta dimeerin rajapinnassa. (L) D176N:n ja T200:n välille muodostuva vetysidos tehostaa inaktiivista dimeeritilaa.
HSD11B2 esiintyy homodimeerinä inaktiivisessa tilassaan (13). Neljä jäämää – nimittäin R186, E190, A237 ja R336 – sijaitsevat dimerin rajapinnalla ja voivat siksi häiritä dimerin muodostumista (kuva 2C). Jäännökset R186 ja E190 sijaitsevat dimerin rajapinnassa α4-kierteessä. Vierekkäisen alayksikön kaksinkertaisen käänteisen symmetrian seurauksena muodostuu alayksiköiden välinen ionipari-vuorovaikutus (R186-E190) (Kuva 2D), joka on samankaltainen kuin HSD17B1:n R112-E120-ionipari (15⇓-17). Tärkeää on, että tämä vuorovaikutus todettiin vakaaksi, ja se säilyi koko 500 ns:n MD-simulaatioiden ajan (Kuva 2 E-G). Lisäksi vuorovaikutuksen havaittiin stabiloivan α4-kierteen ja ylläpitävän joustavuutta koentsyymin sitoutumiskohdan ympärillä. Näin ollen R186C-mutaatio johtaa alayksiköiden välisen ioniparin häviämiseen ja työntää tasapainoa kohti aktiivisen monomeerisen entsyymin muodostumista (kuva 2H). Se estää myös intrahelikaalisen ioniparin vuorovaikutuksen muodostumisen ja mahdollistaa siten koentsyymin sitoutumiskohdan ympärillä olevien rakenneosien destabiloitumisen.
Tässä dimeerin rajapinnassa on useita muitakin häiritseviä mutaatioita, jotka koskevat jäämiä A237, D244, L251 ja D176. Jäännettä A237 ympäröivät L241 ja V239 molemmista HSD11B2-alayksiköistä. Sen mutaatio Valiksi lisää tämän klusterin hydrofobisuutta ja vahvistaa entsyymin inaktiivista dimeeritilaa (kuva 2I). Jäännös D244 ei ainoastaan luo alayksikön sisäisen suolasillan R336:n kanssa, joka pitää α5-kierteen ja β7-levyt yhdessä, vaan sillä on myös vetysidosvuorovaikutuksia viereisen alayksikön R360:n kanssa (kuva 2J). Sen mutaatio Asn:ksi vähentää R360-vuorovaikutuksen voimakkuutta, mikä johtaa suolasillan katoamiseen R366:n kanssa; tämä puolestaan heikentää proteiinin vakautta. Vastaavasti hydrofobisen L251-sivuketjun mutaatio Serin hydroksyyliryhmäksi lisää polariteettia ja muodostaa vetysidoksen R361:n positiivisesti varautuneiden sivuketjuryhmien kanssa; tämä parantaa dimeerin sitoutumista (kuva 2K). Lopuksi D176:n mutaatio Asn:ksi luo vetysidoksen asparagiinin ja T200:n välille, mikä lisää inaktiivista dimeeritilaa (kuva 2L).
Substraatin tai koentsyymin (NAD+) sitoutumistaskun muodostavien HSD11B2:n jäännösten mutaatioiden on in vitro -tutkimuksissa osoitettu poistavan entsyymin aktiivisuuden (19) ja aiheuttavan vaikeaa AME:ta. Esimerkiksi Y226 sijaitsee substraattia sitovassa taskussa (kuva 3A). Aromaattinen fenoli-sivuketju muodostaa hydrofobisia vuorovaikutuksia substraatin aromaattisen renkaan kanssa. Y226N-mutaatio korvaa tämän jäännöksen ei-aromaattisella jäännöksen, mikä johtaa hydrofobisen pinoutumisen häviämiseen, mikä häiritsee substraatin sitoutumista (kuva 3A). Lisäksi tämä mutaatio muuttaa sivuketjun hydrofobisesta hydrofiiliseksi, mikä on epäedullista hydrofobisen substraatin sitoutumiselle. A221V-mutaatio korvaa lyhyen sivuketjun hieman järeämmällä Val-sivuketjulla, mikä häiritsee substraatin sitoutumista pienentämällä taskun tilavuutta, kun taas A221G-mutaatio vähentää hydrofobisuutta ja tuo joustavuutta jäykän sidontataskun ympärille (kuva 3B) (kuva 3B).
Häiriö koentsyymin tai substraatin sitoutumisessa HSD11B2:een. (A) Asemassa 226 oleva tyrosiini muodostaa substraatin sitoutumiskohdan seinämän ja antaa hydrofobisuutta. Mutaatio N226:een johtaa hydrofobisen pinoutumisen häviämiseen, mikä tekee siitä epäedullisen substraatin sitoutumisen kannalta. (B) A221V-mutaatio vähentää substraattia sitovan taskun tilavuutta, kun taas A221G lisää joustavuutta sitoutumiskohdan ympärillä. (C) L179R-mutaatiossa positiivisesti varautunut guanidinium-sivuketju muodostaa vetysidoksia T184:n ja E172:n kokoketjujen kanssa, mikä vähentää joustavuutta NAD+:n sitoutumiskohdan ympärillä. (D) Y232:n hydroksifenyylisivuketju muodostaa vetysidoksia riboosisokerin hydroksyyliryhmän ja N171:n sivuketjun kanssa. Nämä vetysidokset ovat välttämättömiä, sillä mutaatioita fenyylialaniiniin, seriiniin tai kysteiiniin ei siedetä. Mutaatio fenyylialaniiniin poistaa hydroksyyliryhmän ja johtaa vetysidoksen häviämiseen, kun taas mutaatio seriiniin, jonka sivuketju on lyhyempi, johtaa OH-ryhmän etäisyyden kasvamiseen NAD+:sta ja estää jälleen tehokkaan vetysidoksen; molemmat mutaatiot johtavat inaktiiviseen entsyymiin. (E) G89D-mutaatiossa asparagiinihapon karboksyylisivuketju aiheuttaa vakavia steerisiä yhteentörmäyksiä NAD:n adenosiinin riboosisokeriryhmän kanssa ja vaikuttaa koentsyymin sitoutumiseen. (F) K236R-mutaation järeämpi sivuketju pienentää koentsyymiä sitovan taskun kokoa, mikä tekee siitä epäsuotuisan optimaalisen NAD+:n sitoutumisen kannalta.
Mallimme osoittaa, että kortisolin polaarinen 17-OH-ryhmä on sulloutunut Y226:n, P227:n ja L229:n ympäröimälle hydrofobiselle alueelle. Tämä hydroksyyliryhmä puuttuu kortikosteronista, mikä johtaa tehostettuihin hydrofobisiin vuorovaikutuksiin ja ∼10-kertaisesti suurempaan sitoutumisaffiniteettiin HSD11B2:een verrattuna kortisoliin (Kuva S2A). Munuaisten lisäksi HSD11B2 ilmentyy myös istukassa. Vaikka mineralokortikoidireseptori ei ilmentyisikään tässä kudoksessa, HSD11B2 inaktivoi kortisolia eliminoidakseen sen kasvua estävät ja proapoptoottiset vaikutukset alkion kehityksen aikana. Raskauden aikana äidin verenkierrossa oleva korkea progesteronipitoisuus voi sitoutua HSD11B2:n aktiivisuuteen ja moduloida sitä. Tämä voi johtaa siihen, että progesteronin sitoutumista häiritsevillä toimintakyvyn menetysmutaatioilla on vaikutuksia syntymäpainoon. Esimerkiksi A221V-mutaatio vaikuttaa vakavasti progesteronin sitoutumiseen enemmän kuin kortisolin, koska Valin ja progesteronin ulkonevien metyyliryhmien välillä on steerisiä yhteentörmäyksiä (kuva S2B). Erittäin mielenkiintoista on, että kaksi potilasta, joilla oli A221V-mutaatio, olivat raskausaikaan nähden pieniä (taulukko S1). Samoin A221G-mutaatio vaikuttaa progesteronin sitoutumiseen epäsuorasti muuttamalla sitoutumiskohdan rakennetta. Vastaavasti Y226N-mutaatio on haitallisempi progesteronin sitoutumiselle, koska se vähentää hydrofobisia vuorovaikutuksia progesteronirungon ja tyrosiinin hydroksifenyylirenkaan välillä (kuva S2B). Sitä vastoin P227 antaa epäsuoraa rakenteellista tukea sitoutumiskohdalle, ja mutaatio Leu:ksi vaikuttaa samankaltaisesti sekä kortisoliin että progesteroniin (Kuva S2B).
On neljä mutaatiota, jotka sijaitsevat koentsyymin sitoutumiskohdassa ja häiritsevät sitä, heikentäen siten vakavasti HSD11B2:n aktiivisuutta. Jäännöksen L179 sivuketju sijaitsee normaalisti tilallisesti lyhyessä käänteessä β4-arkin ja α4-kierteen välissä (kuva 3C). Koska nämä vuorovaikutukset mahdollistavat vuorovaikutukset V174:n ja L282:n hydrofobisten sivuketjujen kanssa, ne tekevät koentsyymin sitoutumiskohdasta joustavamman. Arg-mutaatio tuo käyttöön guanidinium-sivuketjun, joka mahdollistaa vuorovaikutukset E172:n karboksyyliryhmän sivuketjun ja T184:n hydroksyyliryhmän sivuketjun kanssa (kuva 3C), jolloin käänne jäykistyy ja entsyymin optimaalisen toiminnan edellyttämä joustavuus vähenee (7). Koentsyymin sitoutumistaskussa sijaitseva Y232 on erittäin konservoitunut jäännös Rossmannin taittomotiivissa (20), mikä viittaa siihen, että sen mutaatio vaikuttaa haitallisesti entsyymin aktiivisuuteen (21). Y232:n hydroksyylifenyylisivuketju muodostaa tärkeitä vetysidoksia N171:n ja NAD+:n kanssa pitäen koentsyymin oikeassa asennossa sen katalyyttisen toiminnan kannalta (kuva 3D). Tämä vuorovaikutus on häiriintynyt Y232C-mutaatiossa, joka aiheuttaa vakavan AME:n. Tämän jäännöksen merkitys entsyymin aktiivisuudelle on vahvistettu riippumattomasti useilla muunnetuilla mutaatioilla (21) (kuva 3D). G89D-mutaatiossa Aspin karboksyylisivuketjussa on vakavia steerisiä yhteentörmäyksiä adenosiinin riboosisokerin kanssa, mikä vaikuttaa NAD+:n sitoutumiseen (kuva 3E). Toinen suunniteltu mutaatio K236R johtaa NAD:n sitoutumisen häiriintymiseen (kuva 3F). Vaikka mutaatio säilyttää kyvyn olla vuorovaikutuksessa NAD+:n kanssa vetysidoksen kautta, se poistaa entsyymiaktiivisuuden (21).
Häiriöt HSD11B2:n rakenteellisessa stabiilisuudessa häiritsevät sen tertiäärirakennetta aiheuttaen entsyymiaktiivisuuden merkittävää heikkenemistä ja vakavaa AME:ta. Jäännös L250 sijaitsee α5-kierteessä, ja sen sivuketjut istuvat tiiviissä hydrofobisessa taskussa, jota ympäröivät sivuketjut L204, F246, W253, V255 ja V257 (kuva 4A). Hydrofobisen taskun jäännökset on lukittu R208:n ja E249:n välisellä ioniparin vuorovaikutuksella. Pro-sivuketjun lisääminen rikkoo α5-kierteen jäykistämällä sitä. Tämä tasku on myös liian tiukka, jotta siihen mahtuisi Argin suuri, tilaa vievä guanidinium-sivuketju (kuva 4A). Tämän seurauksena hydrofobisuuden väheneminen tällä alueella vaikuttaa rakenteelliseen vakauteen. Toinen vakaa intrahelikaalinen ionipari-vuorovaikutus muodostuu D144:n ja R147:n välille (kuva 4B). Tämän vuorovaikutuksen ansiosta α3-kierre pakkautuu tiiviisti viereisten β-levyjen kanssa lähellä NAD+:n sitoutumiskohtaa. D144V-mutaatio johtaa tämän vuorovaikutuksen häviämiseen ja horjuttaa pakkautumisjärjestelyä (kuva 4B). Hydrofobinen pakkautuminen häiriintyy myös F185S-mutaatiossa, kun fenyylialaniinin aromaattinen sivuketju, jota ympäröivät hydrofobiset jäännökset V182, C188 ja M189, korvataan seriinin polaarisella sivuketjulla (kuva 4C). Vastaavasti M347:n, I350:n ja F362:n ympäröimä L363:n hydrofobinen sivuketju on sijoitettu helix-turn-helixiin (kuva 4D). L363P-mutaatio häiritsee kierteisyyttä ja paikallista rakenteellista ympäristöä.
HSD11B2:n vakauteen vaikuttavat mutaatiot. (A) L250 on sijoitettu α5-kierteeseen ja sivuketju on ympäröity ahtaaseen hydrofobiseen taskuun. Mutaatio tilaa vievään arginiiniin tai proliiniin, joka aiheuttaa kierteeseen vääristymiä, ei ole siedettävä. (B) D144V-mutaatio johtaa D144-R147-ioniparin vuorovaikutuksen häviämiseen ja epävakauttaa α3-kierteen pakkautumisjärjestelyä lähellä NAD:n sitoutumiskohtaa. (C) F185S-mutaation polaarinen sivuketju häiritsee V182:n, C188:n ja M189:n muodostamaa hydrofobista pakkausta. (D) Hydrofobinen L363-jäännös on sijoitettu kierteeseen, jota ympäröivät M347, I350 ja F362. Mutaatio proliiniksi häiritsee kierteitä ja paikallista rakenteellista ympäristöä. (E) A328V-mutantissa valiinin sivuketjussa esiintyy steriinejä yhteentörmäyksiä hydrofobisessa taskussa. (F) S180:n hydroksyyliryhmän sivuketju on vuorovaikutuksessa selkärangan atomien ja T184:n sivuketjun kanssa. Fenyylialaniinin sivuketju poistaa nämä vuorovaikutukset ja antaa silmukalle joustavuutta. (G) R208-E249-ioniparin vuorovaikutukset pitävät α4- ja α5-kierteet yhdessä. R208H/C-mutantit eivät pysty muodostamaan tätä vuorovaikutusta. (H) D223:n karboksyylisivuketju muodostaa vetysidoksia Q261:n ja R337:n sivuketjujen kanssa. Mutaatio Asniin katkaisee vetysidoksen R337:n kanssa. (I) R213C-mutaatio johtaa arginiinin sivuketjun ja A331:n ja L329:n selkärangan atomien välille muodostuvien vetysidosvuorovaikutusten häviämiseen. (J) R337 muodostaa ionipari vuorovaikutuksen D223:n kanssa ja myös vetysidoksen Y339:n kanssa. Vaikka lysiinin sivuketju säilyttää heikentyneen kyvyn muodostaa vetysidoksia Y339:n kanssa, mutaatio histidiiniksi, kysteiiniksi tai alaniiniksi poistaa kokonaan R337-D223-ioniparin vuorovaikutuksen. (K) Y338:n hydroksifenyylisivuketju muodostaa vetysidoksen D327:n ja A328:n selkäranka-atomien kanssa. Nämä vuorovaikutukset säilyttävät α7:n ja β7:n avaruudelliset asemat. Mutaatio histidiiniin tai fenyylialaniiniin johtaa näiden vuorovaikutusten häviämiseen ja tuo joustavuutta.
Lisäksi useat mutaatiot voivat häiritä HSD11B2-proteiinin pakkautumista heikentääkseen stabiilisuutta ottamalla käyttöön järeämmän jäännöksen. Jäännös A328 muodostaa hydrofobisen vuorovaikutuksen V215:n, I260:n, I325:n ja Y338:n kanssa (kuva 4E). Korvaamalla alaniini tilaa vievämmällä Val-jäännöksellä mutaatio A328V aiheuttaa steroottisia yhteentörmäyksiä ympäröivien β-levyjen sivuketjujen I260 ja Y338 kanssa (kuva 4E). Jäännös S180 sijaitsee silmukassa, ja sen hydroksyyliryhmän sivuketju on vuorovaikutuksessa T184:n sivuketjun ja selkärangan typen kanssa (kuva 4F). Tämä sivuketju sijaitsee hyvin ahtaassa tilassa ja rajoittaa minkä tahansa järeämmän jäännöksen mahtumista, mikä aiheuttaa steerisiä yhteentörmäyksiä itse asiassa muuttamatta proteiinirakennetta. Siten Phe-sivuketjua, jossa on tilaa vievä aromaattinen rengas, kuten S180F-mutaatiossa, ei suvaita tässä asennossa (kuva 4F).
Moninkertaiset vetysidokset ja polaaristen jäännösten väliset suolasillat stabiloivat HSD11B2-entsyymin tertiäärirakennetta. Tietyt mutaatiot aiheuttavat näiden vuorovaikutusten häviämisen, mikä johtaa inaktiiviseen entsyymiin ja vakavaan AME:hen. Esimerkiksi R208:n ja E249:n välinen suolasilta on kriittinen (kuva 4G). Sen menetys, kuten R208C- ja R208H-mutaatioiden tapauksessa, horjuttaa proteiinia ja johtaa vakavaan sairauteen (kuva 4G). Vastaavasti D223 muodostaa suolasillan R337:n kanssa (kuva 4H). Korvaamalla tämä suolasilta vähemmän vahvalla sidoksella, vetysidoksella, D223N-mutaatio muuttaa negatiivisesti varautuneen jäännöksen varauksettomaksi polaariseksi jäännöksi, mikä johtaa in vitro -aktiivisuuden merkittävään heikkenemiseen (22). Tämä viittaa myös siihen, että suolasillalla on ratkaiseva merkitys HSD11B2:n vakauden ja aktiivisuuden ylläpitämisessä. R213:n sivuketjut muodostavat vetysidoksia jäännösten A331 ja L329 selkäranka-atomien kanssa (kuva 4I). Vähentämällä näitä vetysidoksia, jotka auttavat ylläpitämään proteiinin tertiäärirakennetta, R213C-mutaatio heikentää entsyymin stabiilisuutta (kuva 4I).
Jäännösten 335-339 Arg/Tyr-klusterin on aiemmin arveltu osallistuvan proteiinin stabiilisuuden ylläpitämiseen, vaikka tarkka mekanismi on jäänyt epäselväksi (23). AME-potilailla on raportoitu mutaatioita, joissa nämä jäännökset ovat mukana, mukaan lukien R337C ja Y338H. Monomeeristen ja dimeeristen HSD11B2-mallien simuloinnit viittaavat siihen, että jäännös R337 muodostaa suolasiltavuorovaikutuksen D223:n kanssa ja vetysidoksia Y339:n OH-ryhmän kanssa (kuva 4J). Niiden vuorovaikutukset näyttävät olevan tärkeitä proteiinin oikean taittumisen ja vakauden ylläpitämisessä. Näin ollen sen mutaatio Cys:ksi poistaa sekä suolasillan että vetysidoksen, mikä horjuttaa entsyymin vakautta ja aiheuttaa vakavan AME:n. Tämän jäännöksen geneettisesti muunnetut mutaatiot osoittavat lisäksi, että R337K, joka säilyttää napaisuuden ja positiivisen varauksen, vähentää entsyymin aktiivisuutta 70 prosenttia, kun taas R337A, joka on samanlainen kuin R337C, koska sillä on varauksettomat ja lyhyet sivuketjut, inaktivoi HSD11B2:n kokonaan (23) (kuva 4J). Samassa Arg/Tyr-klusterissa Y338:n mutaatio Hisiksi inaktivoi entsyymin aiheuttaen vakavan AME:n. Mallimme mukaan tämä Tyr-jäännös muodostaa hydrofobisia vuorovaikutuksia A328:n kanssa ja vetysidoksia D327:n kanssa (kuva 4K). Molemmat vuorovaikutukset auttavat ylläpitämään proteiinin vakautta, joten esimerkiksi Tyrin korvaaminen Hisillä inaktivoi HSD11B2:n. Tämä johtuu siitä, että vaikka Y338H säilyttää vetysidoskyvyn, sillä on lyhyempiä sivuketjuja, jotka destabiloivat entsyymiä. Vastaavasti Tyrin korvaamista Phe:llä muunnetussa Y338F-konstruktiossa ei siedetä. Tällöin hydrofobiset vuorovaikutukset säilyvät, mutta vetysidokset häviävät (23). Arg/Tyr-klusterin R337 ja Y338 ovat myös hyvin konservoituneita monissa lajeissa, joten näiden jäännösten muutoksia ei todennäköisesti siedetä (23).
Useiden mutaatioiden on raportoitu aiheuttavan AME:n lievemmän muodon, jonka kliiniset ja biokemialliset ilmenemismuodot ovat lievempiä. Kyseisten mutaatiokonstruktioiden osoitettiin säilyttävän HSD11B2:n aktiivisuuden in vitro (4, 19, 24), mikä vastaa lievempää kliinistä fenotyyppiä. Rakenteellisesti nämä mutaatiot voivat joko epäsuorasti häiritä substraatin sitoutumista (kuten P227L-mutaatio yhdellä potilaistamme) tai muuttaa proteiinirakennetta (kuten R279C- ja R359W-mutaatiot) entsyymiaktiivisuuden heikentämiseksi mutta ei poistamiseksi (kuva 5). Huomattavaa on, että vaikka P227-jäännös ei olekaan sellaisessa asennossa, joka on suoraan vuorovaikutuksessa substraatin kanssa, sen sijainti jäännöksen Y226 vieressä viittaa siihen, että sillä voi olla merkitystä substraatin sitoutumisessa (kuva 5A). Itse asiassa tämä jäännös muodostaa silmukka-alueen ”solmun”, joka ylläpitää aktiivisen keskuksen konformaatiota ja pitää myös Y226:n oikeassa asennossa, jotta se voi olla optimaalisesti vuorovaikutuksessa substraatin kanssa. Tämän jäännöksen mutaatio Leu:ksi (P227L) häiritsee kinkkiä ja muuttaa Y226:n asentoa (Kuva 5A).
HSD11B2-mutaatiot, jotka aiheuttavat lievää AME-tyyppiä 2. (A) P227 muodostaa silmukkaan solmun ja auttaa sijoittamaan Y226:n oikein, jotta se olisi optimaalisesti vuorovaikutuksessa substraatin kanssa. Silmukan joustavuuden lisääntyminen P227L-mutaatiossa johtaa Y226:n väärään asentoon. (B) R279:n ja N171:n välinen vetysidos on yksi monista, jotka pitävät β4- ja β6-arkit yhdessä. Se myös suuntaa N171:n sivuketjun vuorovaikutukseen NAD+:n kanssa. Mutaatio kysteiiniksi johtaa näiden vuorovaikutusten häviämiseen. (C) R359-I350-vuorovaikutukset ylläpitävät helix-turn-helixiä. R359W-mutaatio tuo alueelle joustavuutta.
Kaksi ei-konservatiivista mutaatiota, joiden ajatellaan häiritsevän HSD11B2:n tertiäärirakennetta, on tunnistettu potilailla, joilla on tyypin 2 AME. R279 muodostaa vetysidoksen N171:n selkärangan kanssa, mikä auttaa ylläpitämään ja vakauttamaan paikallista proteiiniympäristöä (kuva 5B). R279:n korvaaminen jäännöksellä, joka ei muodosta vetysidosta, kuten R279C-mutaatiossa, johtaa HSD11B2:n aktiivisuuden lievään heikkenemiseen, mutta ei täydelliseen häviämiseen (24), mikä vastaa lievää kliinistä fenotyyppiä (kuva 5B). Toinen ei-konservatiivinen mutaatio, R359W, muuttaa sivuketjun ominaisuuksia varautuneesta hydrofobiseksi. Tämä muuttaa paikallista vuorovaikutusta proteiinirakenteessa, jossa R359:n positiivisesti varautunut sivuketju muodostaa vetysidoksen I350:n selkärangan karbonyylihapen kanssa (kuva 5C). Tämän vuorovaikutuksen häviäminen vaikuttaa osaltaan rakenteen joustavuuden lisääntymiseen, mikä aiheuttaa entsyymiaktiivisuuden heikkenemistä. Huomionarvoista on, että sekä R279C että R359W aiheuttavat minimaalisen häiriön intramolekulaarisiin vuorovaikutuksiin ja esiintyvät lähellä proteiinin pintaa.