Abstract
El ácido poli(láctico-co-glicólico) o PLGA es un polímero biodegradable utilizado en una amplia gama de aplicaciones médicas. Específicamente los materiales de PLGA también se desarrollan para el campo dental en forma de andamios, películas, membranas, micropartículas o nanopartículas. Las membranas de PLGA se han estudiado con resultados prometedores, solas o combinadas con otros materiales en procedimientos de curación ósea. Los andamios de PLGA se han utilizado para regenerar tejidos dañados junto con una terapia basada en células madre. Existen pruebas sólidas de que el desarrollo de micropartículas y nanopartículas de PLGA puede ser beneficioso para una amplia gama de campos odontológicos como la terapia endodóntica, la caries dental, la cirugía dental, los implantes dentales o la periodoncia. El objetivo del presente trabajo fue revisar los recientes avances en materiales de PLGA y sus potenciales usos en el campo dental.
1. Introducción
El ácido poli(láctico-co-glicólico) o PLGA es uno de los polímeros sintéticos biodegradables más utilizados con éxito en el campo médico siendo aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos y la Agencia Europea del Medicamento . La biocompatibilidad, la biodegradabilidad, la flexibilidad y los mínimos efectos secundarios son las principales ventajas del uso de este polímero para aplicaciones biomédicas. Los principales mecanismos de síntesis y degradación se describen en la Figura 1. En el presente trabajo se describen con detalle los usos actuales del PLGA en el campo dental y la relación entre diferentes campos dentales como la endodoncia, la periodoncia, la caries dental, la cirugía dental o los implantes dentales y diversos materiales de PLGA: membranas, andamios, películas y nano o micropartículas.
2. El PLGA en odontología
Los materiales de PLGA resultan eficaces en una amplia variedad de aplicaciones dentales, como se muestra en la figura 2. Se utilizan en una multitud de formas, desde el desarrollo de tornillos para la fijación ósea , el tratamiento de los patógenos periodontales , y la producción de la mucosa bucal o en los procedimientos de tapado de la pulpa directa . El PLGA se puede utilizar en el tratamiento periodontal, para una mejor administración local de antibióticos y para disminuir los efectos secundarios sistémicos de la administración general de antibióticos , en forma de implantes de PLGA , discos , y películas dentales . Asimismo, los tejidos compuestos de gel de PLGA pueden utilizarse en la regeneración ósea, ya que los tejidos no tejidos de gel de PLGA altamente degradable y SiO(2)-CaO que se expusieron a fluidos corporales simulados durante 1 semana dieron lugar a la deposición de una capa de cristales de apatita en su superficie . El compuesto granular de PLGA cargado con gatifloxacina y fosfato b-tricálcico es un medio de administración local en el tratamiento de la osteomielitis, ya que el compuesto consiguió administrar lentamente la gatifloxacina y mostró una actividad bacteriana suficiente in vitro contra Streptococcus milleri y Bacteroides fragilis, microorganismos responsables de la osteomielitis. Además, tras sólo 4 semanas de implantación, el PLGA cargado con GFLX y el βTCP consiguieron reducir significativamente la inflamación y favorecer la osteoconducción y la vascularización de los lugares tratados en la mandíbula de conejo. Además, el andamio de PLGA esterilizado es un material prometedor para producir mucosa bucal de ingeniería tisular. Además, los compuestos de PLGA con biocerámica pueden utilizarse en el recubrimiento directo de la pulpa mediante la incorporación de factores de crecimiento en las micropartículas de PLGA o mediante el recubrimiento directo de la pulpa con compuestos de PLGA de dientes expuestos mecánicamente. Sin embargo, no se observó ningún tejido duro en el recubrimiento pulpar directo con PLGA y la necrosis pulpar fue evidente debido a la baja adhesión del PLGA a la pulpa a pesar de la biocompatibilidad mostrada en la prueba celular . Así pues, los compuestos de PLGA con biocerámicas siguen siendo una mejor opción que el PLGA solo en el recubrimiento pulpar, con una mejor respuesta tisular en comparación con el hidróxido de calcio . Los prometedores resultados de los materiales de PLGA sugieren la necesidad de realizar más estudios, principalmente en el ámbito de la administración de sustancias a los tejidos dentales o en lo que respecta a las capacidades de recubrimiento pulpar que presentan los composites de PLGA.
3. Membranas de PLGA
Una variedad de membranas poliméricas biorreabsorbibles se utilizan en las técnicas de regeneración ósea porque permiten procedimientos de un solo paso, reduciendo así las molestias y los costes del paciente y las posibles complicaciones quirúrgicas . También se consigue una mayor regeneración ósea cuando se aplica una membrana en la terapia periodontal . Teniendo en cuenta esto, las membranas de PLGA se han estudiado con resultados prometedores, ya sea solas o, más recientemente, combinadas con otros materiales. La tabla 1 indica la variedad de estudios en animales y humanos relativos a las membranas de PLGA en odontología.
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Se estudiaron las membranas de PLGA para la regeneración periodontal. Los procedimientos de raspado y alisado radicular seguidos de la colocación de membranas de PLGA dieron como resultado una adhesión clínica significativa y una ganancia ósea en los defectos distales a los segundos molares mandibulares , mientras que recientemente se ha utilizado una membrana de PLGA bioactiva y reabsorbible en defectos calvariales para mejorar la cicatrización ósea en conejos . La adición de diversas sustancias activas a las membranas de PLGA permitió mejorar los resultados. Así, se utilizó una membrana de PLGA recubierta de un gel de atelocolágeno que incluía rhBMP-2 para la reconstrucción de transecciones y defectos de la mandíbula, y los análisis histológicos sugieren que la membrana de PLGA se absorbió gradualmente y fue sustituida por tejido conectivo fibroso o tejido óseo . Además, las películas bicapa de ácido hialurónico injertadas con PLGA se han probado con éxito para la regeneración ósea guiada en ratas, lo que ha permitido cubrir el 63,1% del área del defecto óseo, sin efectos negativos. El ácido hialurónico-PLGA se sintetizó en forma de nanopartículas de 150 nm y posteriormente se incorporó a una película de mezcla de bicapa de HA-PLGA de 33 micras, que se degradó y absorbió completamente en 12 semanas . También se fabricaron membranas macroporosas biorreabsorbibles para la cicatrización ósea a partir de una combinación de ácido poliláctico-co-ácido glicólico-co-ε-caprolactona (PLGC) . En un estudio de 6 meses sobre la mandíbula canina se utilizaron diferentes membranas de PLGC solas o reforzadas con titanio, y todas mostraron más hueso que los controles, incluso si las membranas se utilizaron solas o junto con hueso autólogo . En estudios recientes se utilizaron membranas de PLGA tratadas con plasma de oxígeno y con nanopartículas de SiO2 que lograron promover un 59% de neoformación ósea mucho más que las membranas de PLGA solas, en un experimento reciente en cráneos de conejos.
Otros estudios se centraron en el comportamiento in vivo de diferentes membranas como el colágeno, el copolímero de polilactida/poliglicolida y el copolímero de ácido cítrico. Los resultados no muestran diferencias estadísticas entre estas membranas. Asimismo, la membrana de copolímero de ácido poliglicólico/poliláctico PGA/PLA condujo a resultados relativamente similares en comparación con la aplicación de membranas de colágeno . Además, no se observaron diferencias estadísticamente significativas cuando se utilizaron injertos de tejido conectivo en lugar de las membranas de PLGA , lo que sugiere que se obtuvieron mejores resultados cuando se añadió hidroxiapatita a la membrana de polímero . Un estudio reciente sobre 40 pacientes concluyó que la membrana de PLGA era capaz de evaluar con éxito la regeneración ósea, pero el control mostró mejores resultados en el mantenimiento del grosor horizontal del hueso regenerado y reveló menos complicaciones en los tejidos blandos . En general, el proceso de añadir factores promotores del hueso u otros materiales a las membranas de PLGA parece mejorar los resultados en la regeneración del tejido óseo.
4. Andamios de PLGA
Los andamios de PLGA se utilizan actualmente como biomateriales independientes, portadores de células o dispositivos de administración de fármacos . La investigación en medicina se beneficia del desarrollo de los andamios de PLGA encontrando muchas aplicaciones potenciales en campos como la regeneración del tejido cardíaco , la curación de heridas , la regeneración ósea guiada del tejido óseo , la entrega de factores de crecimiento y genes , y el cultivo de células madre . En los últimos años, se han dedicado muchos esfuerzos a la ingeniería del tejido óseo para desarrollar andamios biodegradables con una excelente biocompatibilidad y propiedades mecánicas que imitan las de los tejidos óseos naturales. Los andamios de PLGA se han utilizado para regenerar tejidos dañados, por ejemplo, en la formación de hueso o en la odontología regenerativa, junto con la terapia basada en células madre . La tabla 2 muestra los estudios relativos a las aplicaciones de los andamios de PLGA en la curación y regeneración ósea. La formación ósea se obtuvo con soportes de PLGA incorporados con injerto óseo autógeno o diferentes sustancias promotoras del hueso, como la proteína morfogenética ósea-2 BMP-2 o la simvastatina . El aumento de la cresta alveolar, muy necesario en la terapia de implantes dentales, también pudo beneficiarse de los materiales de PLGA, ya que se reconstruyeron sitios atróficos utilizando PLGA biorreabsorbible, aloinjerto óseo y una proteína osteoinductora como la rhBMP-2 . Las cavidades fueron significativamente mayores en las ratas tratadas tras la extracción con PLGA/PEG1, tras sólo 4 semanas de implantación . También los andamios de PLGA cargados con simvastatina y SDF-1α promovieron la regeneración ósea significativamente más que los controles en defectos calvariales de ratón . Además, la adición de proteínas morfogenéticas óseas humanas recombinantes a los andamios de esponja de PLGA-gelatina mostró una formación ósea significativamente mayor sin reacciones inmunes u otras reacciones adversas en el aumento de la cresta alveolar en perros .
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Los andamios compuestos de PLGA/CaP también se han aplicado en procedimientos de regeneración ósea (solos o en combinación con células de osteoblastos ). El biomaterial bicapa de PLGA/CaP (fosfato de calcio) se empleó con mayor regeneración periodontal en defectos de furcación de clase II en perros que las membranas flexibles tradicionales, mostrando mayores valores volumétricos óseos, número trabecular y grosor trabecular . Además de PLGA/CaP, otros compuestos como los andamios de PLGA/apatita y los andamios de PLGA/β-fosfato tricálcico han demostrado ser bioeficaces en la formación de hueso . En los defectos periodontales de los perros se formó una cantidad significativamente mayor de cemento y hueso después de recibir tratamiento con rhGDF-5 recubierto en partículas de fosfato beta-tricálcico (beta-TCP) e inmerso en un compuesto de poli(ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) biorreabsorbible. Además, los andamios de PLGA, solos o en combinación con células, se utilizaron en el aumento del seno maxilar. La regeneración ósea se obtuvo sembrando en un andamio de PLGA células madre mesenquimales de la médula ósea o células madre de la pulpa dental. Además, se ha demostrado que los andamios de PLGA/hidroxiapatita promueven la proliferación y la diferenciación de las células madre. También se regeneró hueso utilizando un andamio de PLGA/hidroxiapatita sembrado con células grasas desdiferenciadas o un andamio de fosfato de calcio de PLGA con células madre de la médula ósea. La adición de células madre de médula ósea a los andamios de fosfato cálcico de PLGA mostró una formación ósea 20 veces mayor que la de los andamios solos.
Los materiales poliméricos se han utilizado como andamios para guiar a las células madre dentales con el objetivo de crear estructuras similares a los dientes. Los materiales de PLGA se han utilizado en la regeneración de la dentina o para producir estructuras similares a la dentina . Los investigadores lograron sembrar y cultivar células madre de la pulpa dental en andamios de PLGA, y esos andamios se trasplantaron en conejos y parecieron producir estructuras similares a la osteodentina, así como estructuras tubulares bicapa de túbulos paralelos alineados verticalmente que se asemejan a la dentina tubular. Además, el PLGA/fosfato tricálcico con células de brotes dentales dio lugar a tejidos similares a la dentina y a la pulpa. Se sembraron células madre de la pulpa dental porcina en andamios de PLGA y se implantaron en canales de rata de dientes extraídos, que se colocaron en alvéolos frescos postextracción de cerdos mini . Después de 10 semanas de implantación, el análisis histológico mostró una matriz orgánica recién formada que se depositaba de forma consistente en las paredes del canal y la presencia de una capa continua de células polarizadas o no polarizadas que mostraban una morfología columnar o en forma de huso . Además, las células estromales del tejido adiposo sobre un andamio de PLGA regeneraron capas de hueso, ligamento periodontal y cemento . La tabla 3 indica las principales aplicaciones de los andamios de PLGA en la odontología regenerativa.
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Aunque muestran resultados prometedores en una variedad de aplicaciones, la biocompatibilidad de los andamios de PLGA es objeto de debate. Los productos de degradación del PLGA (ácido láctico y glicólico) pueden disminuir el pH de los tejidos circundantes, causando inflamación o reacciones de cuerpo extraño in vivo . Además, los productos de degradación ácidos tienen el potencial de inhibir la formación de cristales de apatita, lo que conduce a una osteointegración presumiblemente deficiente. Las propiedades hidrofóbicas de los poliésteres biorreabsorbibles influyen negativamente en su adhesión celular. Además, en un intento de reducir la inflamación y mejorar la biocompatibilidad del PLGA se han incorporado con resultados prometedores diferentes partículas a los materiales de PLGA: nanopartículas de titanio , nanopartículas de tripolifosfato , partículas de hueso desmineralizado y partículas de nanoapatita . Además, los andamios de PLGA se funcionalizaron con fibronectina y las fibras de PLGA se recubrieron con una capa de apatita. Otro problema es el hecho de que los microorganismos aeróbicos y anaeróbicos nacidos en la saliva se adhirieron significativamente más al PLGA en comparación con otros andamios poliméricos (PLLA y PLLA-TCP). E. faecalis (una bacteria presente en las infecciones endodónticas recurrentes) y P. gingivalis (un patógeno relacionado con la periodontitis) mostraron la mayor adhesión al andamio de PLGA, lo que hace temer posibles infecciones asociadas a los implantes.
5. Micropartículas de PLGA
El concepto de utilizar sistemas de administración de liberación sostenida basados en polímeros para mantener concentraciones de fármacos terapéuticos durante periodos de tiempo más largos está aceptado desde hace décadas . Las micropartículas y nanopartículas se prefieren sobre otros métodos como resultado de su flexibilidad en la preparación y uso . Varias aplicaciones médicas de las micropartículas de PLGA incluyen la administración de genes, la terapia anticancerosa y las vacunas. Las micropartículas de PLGA se han estudiado con éxito en una amplia gama de campos dentales, como la terapia endodóntica, la vacunación contra la caries dental, la odontología regenerativa, la cirugía dental o la periodoncia. También la Tabla 4 resume las principales aplicaciones de las micropartículas de PLGA en odontología.
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En endodoncia las microesferas de PLGA y zeína fueron capaces de entregar amoxicilina a niveles significativos en el canal radicular y superaron los niveles de concentración necesarios para una adecuada desinfección endodóntica . Se eligió la amoxicilina porque es eficaz contra Enterococcus faecalis, un microorganismo responsable del fracaso endodóntico y el más resistente a la preparación del canal radicular y a los apósitos intracanales . Además, las microesferas de PLGA incorporadas con la proteína D de unión al glucano recombinante de Streptococcus mutans (rGbpD) pueden dar lugar a una futura vacuna dental, como demuestra un estudio sobre ratas inmunizadas tratadas con microesferas de PLGA recubiertas de quitosano. Los factores de crecimiento incorporados a las microesferas de PLGA inducen la formación de dentina terciaria , mientras que las microesferas de poli(D,L-lactida-co-glicolida) cargadas de trombina formaron un nuevo dispositivo hemostático biodegradable . La periodoncia también puede beneficiarse de las propiedades de administración controlada de las micropartículas de PLGA. Se ha incorporado una gran variedad de sustancias a los portadores de PLGA y se han liberado lentamente a nivel local para el tratamiento y la regeneración periodontal: tetraciclina , doxiciclina o clorhexidina . Se fabricaron microesferas de PLGA incorporadas con hidroxiapatita y ofloxacina para utilizarlas como sistema de administración local de fármacos para el tratamiento de la periodontitis y mostraron buenos resultados contra S. aureus y E. coli , mientras que las micropartículas de PDLLA-PLGA rellenas de factores de crecimiento y diferenciación fueron capaces de acelerar la osteogénesis, la maduración ósea, la realineación de las fibras y la cementogénesis del aparato periodontal, en los maxilares de ratas . La regeneración ósea es el campo dental en el que se concentran la mayoría de los estudios relativos a las micropartículas de PLGA. La administración intracelular de estrógenos (un esteroide sexual que aumenta la formación de hueso) mediante micropartículas de PLGA catiónico regula significativamente la diferenciación osteogénica de las células estromales mesenquimales de la médula ósea humana mejorando las expresiones de los marcadores de diferenciación osteogénica ALP y Cbfa-1 después de 1 y 2 semanas . Las microesferas de PLGA que contienen simvastatina, factores de crecimiento o dexametasona mejoran significativamente la formación de hueso. También se utilizaron micropartículas de PLGA cargadas con factores de crecimiento para mejorar la osteointegración de los implantes de titanio, mientras que las microesferas de PLGA con bifosfonatos pueden utilizarse en el futuro para tratar la reabsorción ósea alveolar. Se desarrollaron microesferas de PLGA inyectables que contenían fluvastatina para mejorar la osteogénesis alrededor de los implantes de titanio en la tibia de ratas y, tras una única inyección, las microesferas de PLGA con fluvastatina estimularon con seguridad la formación de hueso alrededor de los implantes de titanio y aumentaron las propiedades mecánicas del hueso . La retención biomecánica de los implantes mejoró tras la adición de micropartículas de PLGA cargadas con insulina, según concluyó un estudio en animales con ratas diabéticas de tipo I . Además, las micropartículas de PLGA se utilizaron para mejorar la osteointegración de los implantes de titanio, también en ratas diabéticas de tipo II , ya que el factor de crecimiento similar a la insulina I fue liberado lentamente durante 30-40 días por las micropartículas de PLGA y condujo a la deposición ósea alrededor de la interfaz de los implantes de titanio . Un andamio incorporado con micropartículas de PLGA cargadas con una proteína morfogenética ósea (rhBMP-2) fue más eficaz para inducir la osteointegración del implante que el mismo andamio con la proteína directamente encapsulada sin las micropartículas de PLGA . El uso de micropartículas también planteó varios problemas prácticos. Así, cuando se estudiaron las partículas en procedimientos de terapia de implantes, algunos autores informaron de la pérdida de fármacos de PLGA durante la colocación del implante. Diferentes enfoques, como la inserción de sangre mezclada con microesferas de PLGA en el orificio del implante o la adición de la sangre mezclada con PLGA en los implantes de titanio , mostraron una pérdida significativa de las micropartículas de PLGA, debido a la fricción mecánica.
La multitud de aplicaciones dentales en las que se pueden utilizar las partículas de PLGA es alentadora. Los prometedores resultados en el campo de la regeneración ósea y la periodoncia pueden necesitar más estudios y ensayos clínicos. En general, las micropartículas de ácidos polilácticos-poliglicólicos parecen ser un prometedor dispositivo de administración controlada en el tratamiento dental.
6. Nanopartículas de PLGA
Las micropartículas y nanopartículas se diseñan principalmente como sistemas de administración de fármacos dirigidos con el objetivo de minimizar los efectos secundarios asociados al uso de los fármacos libres. Se han utilizado varios términos para describir las nanopartículas: nanotransportadores, nanovehículos, nanosistema, nanodisco, nanogranito, nanorod, nanotubo, conjugados fármaco-polímero, conjugados fármaco-proteína, liposomas, micelas poliméricas, dendrímeros y nanocristales de fármacos . Las nanopartículas ofrecen una amplia gama de ventajas, como un menor tamaño de partícula que facilita la penetración en las células, una mayor eficiencia de atrapamiento para aumentar la liberación del fármaco, una menor concentración mínima inhibitoria y concentraciones bacterianas mínimas, lo que significa que se consigue una mejor actividad antibacteriana con una menor cantidad de fármaco . En el campo de la medicina, las nanopartículas de PLGA se desarrollaron como portadoras de genes y también se han estudiado ampliamente como sistemas de administración de vacunas o en la terapia contra el cáncer . Las nanopartículas de PLGA dirigidas, pero no las micropartículas, entregan específicamente el antígeno a las células dendríticas humanas.
Las nanopartículas de PLGA pueden utilizarse en una amplia variedad de aplicaciones en medicina dental, como se muestra en la Tabla 5. Las nanopartículas de PLGA cargadas de minociclina mostraron una mejor actividad antibacteriana que el uso de minociclina libre y pueden proporcionar un sistema portador potencial para el transporte de antibióticos a los tejidos periodontales. La zona de inhibición de las nanopartículas cargadas de minociclina (9,2 mm) fue mayor que la de la minociclina libre (3,5 mm) contra el Aggregatibacter actinomycetemcomitans, el patógeno más importante en las infecciones periodontales . Además, las nanopartículas de PLGA cargadas de azul de metileno mostraron un mayor efecto fotodinámico que la MB libre y mostraron una eliminación de aproximadamente un orden de magnitud de las especies de biopelículas de E. faecalis (un microorganismo que se encuentra en los fracasos endodónticos) en canales radiculares infectados experimentalmente de dientes humanos extraídos. También las nanopartículas de PLGA cargadas de azul de metileno mostraron un mayor efecto fotodinámico que el MB libre en suspensiones de bacterias de la placa dental humana, así como en biofilms recogidos de 14 pacientes con periodontitis crónica. Así, las nanopartículas de PLGA cargadas con fotosensibilizador azul de metileno podrían utilizarse en infecciones endodónticas, así como en la reducción de las bacterias de la placa dental humana que se encuentran en pacientes con periodontitis crónica . Además, las nanopartículas de PLGA aportan mejoras significativas a las técnicas de regeneración ósea, aportando factores de crecimiento y diferenciación con resultados prometedores. La administración de nanopartículas de PLGA cargadas con proteína morfogenética ósea-2 a células madre mesenquimales de la médula ósea indujo una formación ósea mucho más extensa in vivo que la implantación de las nanopartículas cargadas sólo con BMP-2 o de células madre diferenciadas osteogénicamente . Asimismo, las nanopartículas de PLGA que contienen simvastatina se utilizaron para potenciar la osteogénesis de las células madre mesenquimales de la médula ósea, que pueden utilizarse posteriormente en la regeneración ósea . Las nanopartículas de PLGA con factor de crecimiento también se han utilizado con éxito en la terapia de implantes, estimulando la formación de hueso adyacente a la superficie de un implante dental insertado en el hueso . El análisis histomorfométrico mostró un porcentaje medio de contacto hueso-implante del 44%, tras sólo 12 semanas de implantación en tibias de conejo . Los resultados obtenidos en estos estudios son prometedores, pero se necesitan más experimentos para comprobar los efectos de la aplicación de nanopartículas de PLGA en tratamientos dentales.
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7. Limitaciones del PLGA
En conclusión, hasta la fecha, las membranas de PLGA tienen resultados controvertidos cuando se utilizan solas en la terapia de regeneración ósea . Algunos autores sugieren que el PLGA tiene efectos benéficos limitados en la regeneración ósea y periodontal. Además, los microorganismos orales (como S. mutans, E. faecalis, P. nigrescens, P. gingivalis, S. sanguis y C. albicans) parecen tener una buena adherencia a los andamios de PLGA in vitro y esto podría dar lugar a infecciones relacionadas con las bacterias in vivo . La investigación debe intensificarse y ampliarse para superar los problemas prácticos encontrados en la manipulación de las micropartículas de PLGA . Y también hay que tener en cuenta los insuficientes datos relativos a las nanopartículas de PLGA en el campo dental.
8. Conclusiones
Debido a su biocompatibilidad, los materiales de PLGA se han estudiado con éxito en casi todos los campos dentales, desde la endodoncia hasta la periodoncia y la implantología. Los prometedores resultados de los experimentos in vitro e in vivo sugieren que deberían realizarse más estudios relativos a las aplicaciones del PLGA en la investigación dental.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no existe ningún conflicto de intereses en relación con la publicación de este artículo.
Agradecimientos
Bogdan Calenic reconoce que este trabajo está parcialmente apoyado por el Programa Operativo Sectorial de Desarrollo de Recursos Humanos (SOPHRD), financiado por el Fondo Social Europeo y el Gobierno Rumano bajo el Contrato no. POSDRU 141531. Daniela Miricescu desea agradecer la beca para jóvenes científicos 2014-2016 recibida de la Universidad de Medicina y Farmacia Carol Davila, Bucarest, Rumanía. Maria Justina Roxana Virlan reconoce que este trabajo está parcialmente apoyado por el Programa Operativo Sectorial de Desarrollo de Recursos Humanos (SOP HRD), financiado por el Fondo Social Europeo y por el Gobierno Rumano bajo el Contrato no. SOP HRD/159/1.5/S/135760.