La adición de tetramisol (Sigma T1512, una solución madre de 10 mg/mL en H2O diluida a aproximadamente 100 μg/mL en sales de huevo) es opcional; este fármaco paraliza los gusanos y facilita el corte. Cortar inmediatamente: si se contrae demasiado, los gusanos no liberarán muchos huevos. Utilizar una hoja de bisturí nueva cada día, ya que se corroe rápidamente. El exceso de tetramisol hará que se forme un precipitado en la solución de NaOCl.
Para obtener el máximo rendimiento, se pueden liberar más huevos tratando los gusanos cortados durante aproximadamente 1 minuto con un volumen igual de la solución de NaOCl añadida directamente a la gota de corte. Tan pronto como se liberen los huevos, añadir el mismo volumen de EGM que de NaOCl utilizado para evitar más daños en los huevos. Este tratamiento matará los estadios pronucleares y dañará los embriones unicelulares. El tratamiento con NaOCl durante 3 minutos sigue siendo necesario antes de tratar con quitinasa para conseguir una digestión uniforme. Para los huevos anteriores a la fase de dos células, en los que la cáscara es todavía algo permeable, añadir un volumen igual de EGM en cuanto se corten los gusanos. Después de esto, muchos pueden sobrevivir al tratamiento con NaOCl y quitinasa durante 3 minutos, y algunos seguirán en la fase de una célula después del tratamiento con quitinasa y la eliminación de la envoltura vitelina si se trabaja con rapidez.
Las pipetas de transferencia satisfactorias se hacen con capilares de 5 a 30 μL de SMI micropipettor (Fisher 21-380-9C) o con capilares de 4 pulgadas de World Precision Instruments (1B100F-4), tirando dos veces sobre una llama muy pequeña. Para ello, primero se calienta y se tira suavemente para hacer una sección central fina, luego se enfría brevemente y después se recalienta más suavemente mientras se mantiene el capilar bajo tensión para el tirón final. El tirón ideal produce una pipeta con un vástago definido y una sección estrecha que se va estrechando gradualmente, de aproximadamente 3/4 a 1 pulgada. Se puede hacer un pequeño quemador de gas montando una aguja de jeringa grande en un corcho, con una abrazadera de tornillo en el tubo para ajustar el flujo de gas. Alternativamente, se pueden hacer pipetas de tamaño consistente tirando en un extractor automático. Antes de usarlas, rompa el capilar hasta la punta deseada, unos 100-150 μm (tres o cuatro veces el diámetro del huevo) pellizcando entre la uña del pulgar y la punta del dedo o usando una cuchilla de afeitar bajo un microscopio de disección. Un microscopio Microforge puede ayudar a hacer pipetas consistentes aunque no es necesario. Mantenga el diámetro de la pipeta pequeño para minimizar la transferencia de líquido. Si los huevos se adhieren al interior de la pipeta, muchos pueden recuperarse enjuagando con la solución de NaOCl o el EGM a medida que se avanza. Prevea cambiar las pipetas con frecuencia, y tenga un buen suministro extraído antes de una sesión de trabajo.
Si la digestión con quitinasa no funciona en 8 minutos, probablemente no funcionará en absoluto. Los problemas más comunes son el hipoclorito o el estado fisiológico de los gusanos (la puesta del primer día parece dar huevos más duros). El hipoclorito debe ser un lote no caducado, y suele ser pobre un mes o así antes de la fecha de caducidad. Mantenga el caldo refrigerado en una botella oscura con ventilación, llena hasta casi el tope. Mezcle un tubo de 3 ml justo antes de empezar y manténgalo en hielo; funcionará durante unas 3 horas y luego deberá ser sustituido.
Después del tratamiento enzimático y especialmente después de la permeabilización, los embriones son bastante pegajosos y se aglutinan; esto puede minimizarse pipeteando uno o sólo unos pocos a la vez. Los pequeños grumos pueden romperse expulsando de la pipeta con un poco de fuerza unas cuantas veces.
Las pipetas de permeabilización se tiran a mano de la misma manera que las pipetas de transferencia, utilizando capilares de inyección Kwik-fil (1B100F-4 de World Precision Instruments). El hilo interior puede ayudar a cortar la envoltura vitelina. El tirón ideal da una larga conicidad gradual en la sección fina para poder cortarla al diámetro deseado. Las pipetas se cortan con una hoja de bisturí nueva sobre Parafilm bajo el visor de disección. Se puede hacer un adaptador para la pipeta bucal con un tubo Tygon de pequeño calibre enroscado en una aguja de jeringa unida a un tubo bucal. Llene la punta de la pipeta con EGM hasta el orificio más ancho y pruebe con el primer lote de embriones quitados; vuelva a cortar la punta de la pipeta si es demasiado pequeña. El tamaño ideal variará en función de la edad del embrión que se intente obtener; los estadios muy tempranos son más frágiles y necesitan un orificio ligeramente mayor; los embriones de más de ocho células se comprimen con menos daño y a menudo saldrán de las pipetas más grandes con la envoltura vitelina intacta. Estos embriones no permeabilizados continuarán desarrollándose hasta la fase de eclosión.
Utilice una jeringa en la pipeta de boca para llenar y limpiar las pipetas de permeabilización; la permeabilización real se realiza mediante la presión del aire de la boca. Las pipetas pueden permanecer en el aire durante varias horas sin secarse, ya que el orificio es muy pequeño, pero al secarse acabarán por obstruirse. Almacene las pipetas (vale la pena guardar una buena, y durará varias semanas) enjuagando la punta varias veces con agua destilada y suspendiendo la punta de la pipeta en un tubo de agua destilada estéril o HCl 0,1 M, utilizando una «bandera» de cinta adhesiva en la pipeta para que no se hunda completamente.
Si la pipeta es correcta, sólo se tarda unos minutos en permeabilizar un lote de embriones aspirándolos individualmente en la pipeta y expulsándolos suavemente. Saldrán más o menos comprimidos dependiendo del diámetro interior de la pipeta, pero se redondean de nuevo en pocos minutos. Si hay mucha lisis con la permeabilización, o bien la digestión fue incompleta o el orificio de la pipeta era demasiado pequeño. Dado que las membranas celulares son bastante lábiles durante 4-5 minutos después del inicio de la citocinesis, los embriones desvitelizados durante y justo después del clivaje pueden lisarse o los blastómeros pueden fusionarse, sufriendo posteriormente un clivaje tetrapolar anormal. Si es crítico, compruebe durante un experimento y elimine tales embriones.
Una pestaña muy fina (una herramienta tradicional de microscopía electrónica) montada en un palillo con pegamento es la herramienta más satisfactoria para la separación manual rápida de blastómeros; una aguja de vidrio también funciona, pero se rompe fácilmente. Las pestañas pueden limpiarse con alcohol y un pañuelo de papel. Los blastómeros se lisan si se separan justo después de una división; 5-10 minutos después del clivaje es el mejor momento para realizar manipulaciones exitosas, a menos que se necesiten separaciones más tempranas. Las separaciones AB/P1 son las más fáciles. También se pueden separar embriones de cuatro células. Alternativamente, para obtener blastómeros P2 y EMS, se puede separar P1 después de la primera división y EMS/P2 después de la segunda. Los blastómeros del linaje P pueden reconocerse por su tamaño relativo y su disposición lineal. Con un bajo rendimiento, se pueden separar MS, E, P3 y C de los cuatro descendientes de un blastómero P1 inicial aislado. Las identificaciones celulares realizadas sobre la base del tamaño de las células pueden confirmarse examinando los distintos períodos del ciclo celular.