7 Unión de RAG en todo el genoma
Dadas las propiedades de unión directa al ADN de RAG1, combinadas con la abundancia única de RSSs presentes en los genes receptores de antígenos, era razonable suponer que la especificidad del sitio de recombinación V(D)J es simplemente impuesta por el reclutamiento preferencial de RAG1 a sus sustratos de ADN preferidos. RAG2, debido a su PHD y a su falta de actividad catalítica intrínseca, no debería mostrar restricciones funcionales en sus patrones de localización. En consecuencia, RAG2 se une ampliamente a través del genoma de los linfocitos, ocupando una fracción importante (~ 60%) de los TSSs activos, que están enriquecidos en H3K4me3 (Ji et al., 2010; Teng et al., 2015). Sin embargo, RAG1 también se localiza en miles de sitios (~ 3500 en timocitos de ratón y células pre-B) que están co-ocupados por RAG2 y H3K4me3, abarcando una porción sustancial de promotores y potenciadores altamente activos y específicos de cada linaje (Teng et al., 2015). Esta localización generalizada también se observa en el caso de un mutante catalítico de RAG1 (D708A), lo que indica que la unión generalizada de RAG1 no refleja una acumulación posterior a la eliminación (Teng et al., 2015). Los sitios de unión de RAG1 fuera de los genes receptores de antígenos no mostraron una correlación clara con la presencia de motivos similares a los RSS (RSS crípticos, o cRSS), indicando además que los contactos específicos de la secuencia y la actividad de escisión mediada por RAG no podrían explicar los patrones de unión de RAG1 en todo el genoma. En cambio, los marcadores de accesibilidad a la cromatina son los que mejor predicen el reclutamiento de RAG1: H3K4me3, H3K27Ac, contenido elevado de GC y contenido elevado de CpG (Teng et al., 2015).
De hecho, solo un puñado de ejemplos demuestran el reclutamiento específico de RAG1 a genes receptores de antígenos a través de transfactores que interactúan tanto con RAG1 como con motivos específicos del ADN. En cada caso, la especificidad de locus del evento de reclutamiento no depende del RSS per se, sino de un motivo de unión del factor de transcripción que fortuitamente se solapa con un RSS. El locus Tcrb del ratón ilustra un caso en el que el reclutamiento dirigido de RAG1 contribuye a las restricciones «más allá de 12/23» que ayudan a mantener el orden correcto de recombinación (Dβ-Jβ antes de Vβ-DJβ). Los 3′ 23-RSSs que flanquean Dβ1 y Dβ2 contienen sitios de unión conservados para c-fos, una subunidad del factor de transcripción AP-1 (Wang et al., 2008). De manera independiente a sus propiedades de activación transcripcional, c-fos recluta preferentemente a RAG1 a los RSSs 3′ Dβ, favoreciendo así la recombinación Dβ-Jβ (Wang et al., 2008). En el linaje B, el locus análogo del receptor de antígeno es el gen Igh, donde la recombinación directa Vh-Dh está desfavorecida en relación con la recombinación Vh-DJh. En este caso, sin embargo, el orden de recombinación parece estar regulado por cambios locales en las marcas epigenéticas que siguen a la recombinación D-Jh, y marcan el producto DJ para la unión y recombinación preferente de RAG1 en relación con los segmentos del gen Dh de la línea germinal (Subrahmanyam et al., 2012). Además, la recombinación directa Vh-Dh es suprimida por un elemento de secuencia conocido como IGCR1 que se encuentra entre los grupos de genes D y V (Guo et al., 2011). IGCR1 contiene dos sitios CTCF vitales y se cree que funciona como un punto de anclaje para los bucles de cromatina que secuestran la porción DJ del locus Igh de la porción V (Guo et al., 2011; Lin, Guo, Su, Zhang, & Alt, 2015; Medvedovic et al., 2013). El locus humano Tcrd proporciona otro ejemplo de deposición de RAG1 específica del locus, donde el reclutamiento de RAG1 dependiente de Runx1 a Dδ2 favorece un evento de reordenamiento Dδ2-Dδ3 que precede a la recombinación clásica Dδ-Jδ (Cieslak et al., 2014). Esto da lugar a la inclusión específica en humanos de dos segmentos del gen D en los reordenamientos Tcrd. Por último, se ha sugerido que Pax5 interactúa con RAG y facilita el reclutamiento de RAG a los segmentos del gen Vh (Zhang et al., 2006), aunque aún no se ha demostrado que este mecanismo mejore el ensamblaje del locus Igh endógeno.
Fuera de estas excepciones, la unión de RAG1 no parece iniciarse principalmente a partir de eventos de reclutamiento específicos de la secuencia. Incluso dentro de los genes Tcr e Ig, la unión de RAG1 se extiende más allá de los límites del RSS, ocupando regiones intrónicas que están enriquecidas en H3K4me3 pero desprovistas de RSS (Teng et al., 2015). Esto no quiere decir que los RSS no desempeñen funciones secundarias en la estabilización o mejora de la unión de RAG1 tras el reclutamiento. Los genes Tcra e Igk son los principales reclutadores de la unión de RAG1 en los timocitos doblemente positivos y en las células pre-B, respectivamente, y se observan claramente picos definidos de acumulación de RAG1 sobre los RSS en los centros de recombinación (Teng et al., 2015). La excepcional densidad de RSSs en los genes receptores de antígenos es probablemente una de las características más importantes que los discrimina del resto del genoma.
El genoma en general, sin embargo, exhibe un reclutamiento de RAG1 independiente del RSS, que probablemente ocurre a través de interacciones no específicas entre RAG1 y el ADN que están mediadas por varios dominios en el núcleo de RAG1, incluyendo el NBD (Teng et al., 2015; Yin et al., 2009). Además, el reclutamiento indirecto de RAG1 a la cromatina puede ocurrir a través de su interacción con RAG2, aunque este último no puede explicar completamente los patrones de unión de RAG1, que se mantienen parcialmente en ausencia de RAG2, aunque con una intensidad disminuida (Teng et al., 2015).
El rango genómico de los sitios de unión de RAG1, aunque más amplio de lo predicho, se expande aún más en ausencia de dominios no centrales de RAG1 o RAG2. En ausencia de la región C-terminal de RAG2 (que incluye el PHD), RAG1 se difunde hacia sitios con menores densidades de H3K4me3, en lugar de dirigirse a los TSS más activos (Teng et al., 2015). Una posibilidad es que esto resulte de un desenmascaramiento de las actividades de unión al ADN no específicas de RAG1, dada la ausencia del dominio autoinhibitorio que se encuentra en la región C-terminal de RAG2 (Lu et al., 2015). Otra posibilidad es que, en ausencia del dominio PHD de RAG2, el complejo RAG tenga menos propensión a dirigirse a las regiones de alto H3K4me3. También puede ser relevante para el patrón de unión de RAG1 el hecho de que la deleción de la región C-terminal de RAG2 conduce a la regulación de los niveles de proteína RAG1 (Teng et al., 2015). El núcleo de RAG1 también se une de forma mucho más promiscua que el RAG1 de longitud completa y, curiosamente, presenta una intensidad de unión elevada en muchos sitios de receptores no antigénicos, pero una intensidad reducida en el locus Tcra, en relación con el RAG1 de longitud completa (Teng et al., 2015). Esto podría reflejar cambios en las propiedades intrínsecas de unión al ADN de la proteína RAG1 truncada, o la ausencia de actividades codificadas en los extremos no centrales de RAG1 (como la ubiquitlación de histonas mediada por RING o la autoinhibición mediada por el extremo C). También podría ser relevante el hecho, señalado anteriormente, de que el núcleo de RAG1 se expresa a niveles sustancialmente más altos que el RAG1 de longitud completa.
La recombinasa RAG tolera la variación de la secuencia no sólo en sus sustratos, en particular en el espaciador RSS, sino también en el heptámero y el no-ámero (Hesse et al., 1989; Lewis, Agard, Suh, & Czyzyk, 1997; Marculescu, Le, Simon, Jaeger, & Nadel, 2002; Ramsden, Baetz, & Wu, 1994; Zhang & Swanson, 2008). Incluso la interacción RAG1-nonamer mediada por el NBD depende de relativamente pocos contactos específicos de la secuencia (Yin et al., 2009). Los RSS que pueblan los genes de los receptores de antígenos son diversos en su contenido de secuencia (a veces divergiendo significativamente de los motivos heptámero y nonámero consensuados), y el reconocimiento de sustratos por parte de RAG debe ser lo suficientemente flexible como para permitir la máxima diversidad de repertorios. Fuera de los genes receptores de antígenos, los sitios de unión de RAG1 no muestran preferencia acumulativa por ninguna firma de secuencia en particular (Teng et al., 2015).
Sin embargo, el reconocimiento flexible de sustratos por parte de RAG crea un problema para el resto del genoma. Los requisitos de secuencia bastante mínimos para un RSS funcional (al menos, según las reglas que entendemos actualmente) permiten que los cRSSs ocurran con bastante frecuencia en los genomas de los vertebrados (Lewis et al., 1997). El peligro de los cRSS fortuitos se hace evidente por su participación en los reordenamientos genéticos dependientes de RAG que contribuyen a la linfomagénesis (Larmonie et al., 2013). Dado que la mayor parte de la unión de RAG1 en todo el genoma se rige por el reclutamiento inespecífico al ADN o a la cromatina accesible, parecería biológicamente prudente limitar la disponibilidad de fuertes cRSSs en las proximidades de los sitios de unión de RAG1 y así minimizar el potencial de la actividad de RAG fuera del objetivo. De hecho, los sitios de unión a RAG1 en los linfocitos de ratón y humanos están preferentemente desprovistos de cRSSs (Teng et al., 2015), y proponemos que esto se ha producido debido a las presiones selectivas impuestas por los reordenamientos genéticos que se producen fuera de los genes del receptor de antígeno. Así, el repertorio de TSSs asociados a RAG1 está protegido de la actividad de RAG durante la recombinación V(D)J. Especulamos que los raros cRSSs que retienen la actividad y continúan mediando en el reordenamiento ectópico infrecuente se han mantenido en el genoma debido a su solapamiento con secuencias reguladoras o funcionales en sus loci anfitriones, o simplemente no han ejercido consecuencias negativas lo suficientemente fuertes como para ser seleccionados en contra.