I.U.B.: 3.1.27.5
C.A.S.9001-99-4
Reacción enzimática (la imagen se abrirá en una nueva ventana)
La ribonucleasa pancreática (RNasa) es una endorribonucleasa. Cataliza la escisión del enlace fosfodiéster entre la 5′-ribosa de un nucleótido y el grupo fosfato unido a la 3′-ribosa de un nucleótido de pirimidina adyacente. Esta escisión forma un fosfato 2′,3′-cíclico, que luego se hidroliza al correspondiente fosfato 3′-nucleósido.
La RNasa se encuentra en mayor cantidad en la pancreasa de los rumiantes (Barnard 1969). El componente principal de la enzima cristalina es la RNasa A; un componente menor es la RNasa B. La RNasa B es la forma glicosilada de la RNasa A (Beintema et al. 1976).
Historia:
El trabajo de Jones en 1920 suele citarse como el «inicio» de la ribonucleasa pancreática (Richards y Wycoff 1971). La RNasa fue aislada por Dubos y Thompson en 1938 y cristalizada por Kunitz en 1940.
En 1947 Worthington fue la primera empresa en fabricar RNasa cristalina altamente purificada. A principios de la década de 1950, la empresa Armour preparó enzima cristalina cruda y la ofreció a un precio muy asequible. A lo largo de las décadas de 1960 y 1970, la RNasa A fue una de las favoritas para estudiar, principalmente porque es notablemente termoestable y está presente en alta concentración en una fuente accesible, el páncreas bovino. Estos estudios condujeron a la elucidación de la estructura cristalina (Anfinsen 1959, Groves 1966 y Scheraga 1967), a la determinación de la secuencia de aminoácidos (Smyth et al. 1963), a la identificación del mecanismo catalítico (Beers 1960) y a la aclaración de las vías de plegado (Hantgan et al. 1974). La RNasa A fue la primera enzima y la tercera proteína para la que se determinó una secuencia correcta de aminoácidos (Raines 1998).
Se han concedido cuatro premios Nobel por trabajos relacionados con los estudios de la RNasa (Anfinsen, Moore, Stein y Merrifield). La vasta literatura y los numerosos estudios han hecho de la RNasa la enzima más ampliamente estudiada del siglo XX (Raines 1998).
Trabajos recientes continúan investigando la síntesis y maduración de la RNasa en el retículo endoplásmico de las células vivas (Geiger et al. 2010). También se sigue dedicando mucho trabajo a estudiar el plegamiento y la agregación de la RNasa (Benito et al. 2008, Iwaoka et al. 2008, y Arai et al. 2010). Se está estudiando el papel de la enzima en el desarrollo del cáncer y en la regulación de los genes (Shlyakhovenko 2009), y se están desarrollando agentes quimioterapéuticos para el cáncer (Chao et al. 2010).
Especificidad:
La RNasa A es específica para los enlaces de nucleósidos de pirimidina (Volkin y Cohn 1953). Se cree que la reacción tiene lugar en dos pasos. En el primer paso, se escinde el enlace 3′,5′-fosfodiéster, generando un intermediario fosfodiéster cíclico 2′,3′. En el segundo paso, el fosfodiéster cíclico se hidroliza a un grupo 3′-monofosfato. El primer paso es inespecífico con respecto a la base nitrogenada del sustrato; sin embargo, el segundo paso es absolutamente específico para los nucleótidos de pirimidina con fosfatos 2′,3′-cíclicos terminales. La RNasa B tiene la misma especificidad que la RNasa A hacia el citidilato cíclico y el ARN de levadura (Plummer y Hirs 1963). La RNasa A muestra una preferencia por los sustratos más grandes (Nogués et al. 1995).
La enzima escinde en residuos de citidina dos veces más rápido que en residuos de uridilo (Richards y Wyckoff 1971). Se ha descubierto que la Thr45 es la más importante para mediar en la especificidad de pirimidina, tanto formando enlaces de hidrógeno con bases de pirimidina como excluyendo estéricamente las bases de purina (del Cardayré y Raines 1994). La cadena lateral de Asp83 es importante para estabilizar el estado de transición durante la escisión de sustratos que contienen uridina; este residuo no tiene ningún efecto sobre la cinética de escisión de la citidina (del Cardayré y Raines 1995).
Composición:
La forma de la proteína se asemeja a un riñón, con los residuos del sitio activo situados en la hendidura (Richardson 1981, y Raines 1998). La estructura secundaria contiene largas láminas beta antiparalelas de cuatro hilos y tres hélices alfa cortas (Raines 1998). La RNasa A contiene cuatro enlaces disulfuro, que son críticos para la estabilidad de la enzima nativa. Dos de estos enlaces disulfuro se encuentran entre una hélice alfa y una hoja beta y contribuyen más a la estabilidad térmica que los otros dos (Klink et al. 2000). La RNasa B es una glicoproteína que contiene en Asn34 un único oligosacárido compuesto por seis residuos de manosa y dos residuos de N-acetilglucosamina (Tarentino et al. 1970).
Características moleculares:
La RNasa A es una proteína pequeña, la enzima madura sólo tiene 124 residuos de aminoácidos, sin ningún carbohidrato unido. La RNasa A contiene 19 de los 20 aminoácidos, faltando sólo el triptófano (Nogués et al. 1995, y Raines 1998). La estructura tridimensional de la RNasa A está totalmente codificada por su secuencia de aminoácidos (White y Anfinsen 1959, y Raines 1998). Los ocho genes humanos similares a la RNasa A están localizados en el cromosoma 14. Cada uno de ellos codifica una secuencia de señal secretora y contiene una tríada catalítica invariable de dos histidinas y una lisina con un motivo conservado (CKXXNTF) (Marshall et al. 2008).
Se han identificado las secuencias de aminoácidos de muchos homólogos de la RNasa A, lo que hace de la RNasa A un sistema modelo para la evolución molecular de los vertebrados (Dyer y Rosenberg 2006). A partir de las secuencias y su distribución en una serie de especies se ha establecido que la RNasa A es una proteína moderna que evoluciona rápidamente (Doolittle 1992, y Raines 1998).
Número de acceso a la proteína: P61823
Clasificación CATH (v. 3.2.0):
- Clase: Alfa-Beta
- Arquitectura: Rollo
- Topología: Proteína P-30
Peso molecular:
- RNasa A: 13,7 kDa (Hirs et al. 1956b)
- RNasa B: 14,700 ± 0,3 (Plummer y Hirs 1963)
PH óptimo: RNasa A: 7,0-7,5 (Brown y Todd 1955)
Punto isoeléctrico:
- RNasa A: 9,3 (Ui 1971)
Coeficiente de extinción:
- RNasa A y B: 8.640 cm-1M-1 (Teórico)
- RNasa A: E 1%, 280 = 7,3 (Worthington RNase A)
- RNasa B: E 1%, 280 = 5.77 (Teórico, RNasa B)
Residuos del sitio activo:
- Histidina (H12, H119)
- Lisina (K41)
Activadores:
- Cloruro de sodio (Weickmann et al. 1981)
- Sulfato (Moosavi-Movahedi et al. 2006)
Inhibidores:
- Iones de metales pesados
- Inhibidor de ribonucleas (RI), una proteína de 50 kDa que constituye ≤ 0.01% de la proteína en el citosol de las células de mamíferos (Takahashi 1967)
- Complejos de uridina-vanadato (Lindquist et al. 1973)
Aplicaciones:
- Eliminación del ARN durante el aislamiento del ADN
- Análisis de la secuencia del ARN
- Ensayos de protección de la RNasa
- Cuantificación o mapeo del ARN
- Purificación del ADN plasmídico
- Aislamiento del ADN genómico
- Marcador de peso molecular
.