Imagen de rayos X de la hembra de I. ricinus
Aquí, mostramos que el montaje CRYTUR de rayos X (basado en el microfoco X-RayWorx, la fuente de rayos X y el detector de rayos X CRYCAM) es muy adecuado para proporcionar una observación rápida y no destructiva de las estructuras internas impregnadas de osmio de las garrapatas hembra. La Figura 1A muestra los músculos retractores quelicerales que llegan hasta la zona de los segundos pares de las patas, los espesores de la cutícula, los músculos dentro de las patas y los palpos (Fig. 1A, Película 1). El modelo 3D obtenido a partir de imágenes de proyección de rayos X en 2D proporcionó más información espacial sobre las estructuras superficiales del capítulo de la hembra (Fig. 1B), comparable con la imagen previa por SEM (Fig. 1D), con la consiguiente posibilidad de visualizar también algunas estructuras internas (por ejemplo, los músculos, las bases de los quelíceros y la faringe) en varios cortes virtuales (Fig. 1B). La resolución de la tomografía de rayos X fue de 8.060 µm y se calculó en base al análisis de Fourier de un corte virtual reconstruido en la planicie lateral presente en el centro del objeto reconstruido. Construimos un gráfico del espectro de potencia promediado radialmente y, basándonos en el criterio de Rayleigh, evaluamos la separación entre la señal y el ruido en el 8,94% de la distancia entre el piso de ruido y el valor máximo. Dado que el modelo de rayos X se reconstruyó a partir de las imágenes de proyección en el rango de 0° a 180° con un paso de 10°, la resolución es técnicamente casi isotrópica. Sin embargo, esta resolución no fue suficiente para la observación de las piezas bucales de las ninfas (Fig. 1C,D, véase la comparación de los tamaños de las piezas bucales de las hembras y de las ninfas con el mismo aumento).
Las piezas bucales de la hembra (A-C) y de la fase ninfal (D) de Ixodes ricinus observadas mediante rayos X (A,B) y SEM (C,D). (A) La imagen de proyección de rayos X muestra los quelíceros anclados en la base del capítulo (flechas blancas) y los músculos retractores de los quelíceros (flechas negras). (B) El modelo 3D obtenido a partir de las imágenes de proyección de rayos X proporcionó una topografía del aparato bucal de la hembra comparable con la imagen de MEB de bajo aumento (C). Sólo se utilizó el MEB para observar el aparato bucal de la ninfa, incluyendo su morfología interna (D), en contraste con la hembra, donde los cortes virtuales transversales de la tomografía de rayos X nos permitieron obtener imágenes de la organización estructural interna del capítulo, los quelíceros, la faringe y el exoesqueleto de quitina. Palpo (P), base de los capítulos (BC), hipostoma (H), quelíceros (Ch), 1ª y 2ª pata (L1, L2). Barras: 100 μm.
Sección serial SEM
El modelo 3D del aparato de alimentación de la ninfa de I. ricinus que se reconstruyó a partir de secciones seriadas de resina ultrafina reveló las relaciones del salivario y el canal de alimentación con los estilitos de los capítulos (quelíceros, hipostoma) y otras estructuras asociadas, principalmente músculos (Fig. 2, películas 2 y 3)14.
El aparato de alimentación del estadio ninfal no alimentado de Ixodes ricinus. Los modelos 3D (A,D,I-N) se reconstruyeron a partir de secciones transversales seriadas (B,C,E-H) a través de la parte del capitulo fotografiada por electrones retrodispersados (recuadro) utilizando el SEM JEOL 7401 F. Barra: 25 µm.
Desde el exterior del capítulo, la saliva y la harina de sangre son expulsadas/succionadas en una estrecha hendidura, el canal preoral, formada entre el surco del hipostoma en el lado ventral y los quelíceros en el lado dorsal (Fig. 2A). En Rhipicephalus (antes Boophilus) microplus, una fina membrana, también llamada canal, recubre el surco hipostómico12. Curiosamente, esta estructura falta en Ixodes hexagonus9, Haemaphysalis longicornus15 e I. ricinus. En el interior del capitulum, la saliva/sangre continúa hacia la cavidad del salivarium, y este camino común termina con la separación de un canal de alimentación del salivarium (Fig. 2A,B). Desde el lado dorsal de la garrapata, el canal alimentario se sitúa por debajo del salivario. El salivario no es una estructura permanentemente fija, sino que se crea por la colocación de los quelíceros por encima de la parte dorsal del hipostoma. El canal alimentario se separa de la vía común abriéndose en la faringe. Su techo está formado al principio por una diminuta laminilla (Fig. 2B, flecha verde) que se agranda en una varilla corta dentro de la profundidad del capítulo (Fig. 2C,I verde) y continúa como una placa esclerotizada más grande en forma de ala (también conocida como alae) (Fig. 2E,I, verde). Todas estas estructuras juntas forman el labrum. En la parte inferior del labrum, hay un proceso similar a un diente adyacente al orificio de la faringe (Fig. 2C,E, flechas negras). Esta estructura dentada fue descrita en I. hexagonus, I. holocyclus y Rhipicephalus microplus9,12,16. El proceso dentario parece encajar en un surco del orificio de la faringe, por lo que se supone que es una parte importante de la válvula faríngea. La identificación de este proceso dentado como el labrum se justifica por su similitud con el labrum de las garrapatas argasidas, que también se extiende desde el techo de la faringe hasta el canal alimentario13,16. La estructura anatómica del canal alimentario, el diminuto labrum y la válvula en I. ricinus, es coherente con el lento proceso de alimentación de estas garrapatas, en el que se alternan largos pulsos de succión con el pulso de secreción salival durante su largo periodo de alimentación de sangre. Sin embargo, en las garrapatas blandas, el labrum se extiende distalmente a lo largo de todo el canal alimentario. Esto es coherente con el rápido proceso de alimentación en esas garrapatas en las que el rápido aleteo del labrum se sincroniza con la rápida succión y salivación para alimentarse en sólo 1-2 horas13. Basándonos en nuestras observaciones EM, esta parte anterior del techo faríngeo no estaba conectada con los músculos y probablemente forma una parte estacionaria (de apoyo) de la válvula (Fig. 2B). El techo faríngeo está conectado a las placas subhipostómicas que crean los lados y el suelo de la faringe (Fig. 2C flechas blancas). Estas placas están conectadas a las grandes bandas musculares dilatadoras unidas en sus lados opuestos a la cutícula ventral. Los músculos dilatadores anteriores de la faringe (ADM, mostrados en la Fig. 2C,E,I como estructuras de color rosa claro) están situados sólo en la parte anterior de la faringe y su contracción/relajación permite abrir/cerrar la válvula del orificio faríngeo9,12. Las ADM están unidas a la esquina superior y a los lados profundos de la parte anterior de la faringe. La parte media de las paredes de la faringe está asociada a otro grupo de músculos dilatadores cuya contracción expande el lumen faríngeo hacia los lados. Estos músculos dilatadores laterales de la faringe (LDM) pueden verse en la Fig. 2G y como estructuras de color rosa intenso en la Fig. 2I,J. Los LDM permiten la ampliación masiva del lumen faríngeo posiblemente también debido a la pared en forma de doble Y en la parte anterior (Fig. 2G) y la pared en forma de triple Y en la parte posterior de la faringe en una sección transversal (Fig. 2H) descrita por Arthur et al.9 y Sonenshine y Anderson13. La alternancia de contracción y relajación de ambos grupos musculares dilatadores dilata la faringe, sincronizada con la apertura de la válvula anterior, creando un potente pulso de succión. La relajación del LDM, tras el cierre de la válvula faríngea, aprieta la faringe y conduce la sangre ingerida posteriormente hacia el esófago y el intestino medio. La sincronización temporal entre la apertura/cierre del orificio faríngeo, coordinada con la apertura y cierre de la válvula faríngea y la compresión/ampliación del lumen en la parte media de la faringe, permite la succión, así como el movimiento del alimento hacia el esófago y también evita la regurgitación de la sangre de vuelta al huésped9,12. El revestimiento interno de la faringe está esclerotizado, mientras que la pared del esófago está revestida por células epiteliales (Fig. 2A). El esófago pasa a través del singanglio y se fusiona con el intestino medio (datos no mostrados).
El salivario es una gran cavidad situada entre la faringe y los quelíceros (Fig. 2A-E). La parte anterior del salivario es compartida para el paso de la sangre y la saliva, luego la faringe está separada del suelo del salivario por la pequeña lamela (ver arriba). El techo y los lados laterales del salivario están reforzados por la placa queliceral esclerotizada (ChP en la Fig. 2C,E,F y la estructura roja mostrada en la Fig. 2M) que se extiende más adentro de la cavidad del cuerpo de la garrapata. En la parte posterior del salivario, los lados laterales de esta placa están conectados a músculos fijados en extremos opuestos a los lados laterales de la cavidad del cuerpo de la garrapata. Estos músculos laterales del salivario (LMS), pueden verse en la Fig. 2E,F,K,L marcados en púrpura claro. La contracción de los músculos aplana la placa, que está fuertemente conectada a la pared del salivario, lo que conduce a un estrechamiento/cierre del espacio interior del salivario, sin embargo sólo en su parte posterior detrás de la separación de la faringe.
Además, el suelo del extremo posterior del salivario está conectado a un pequeño grupo de músculos oblicuos (músculos unidos al suelo del salivario, MS en la Fig. 2E,F,J,N, marcados en azul claro) unidos en las partes opuestas a la parte superior de la parte delantera de la faringe. Estos músculos permiten el movimiento hacia arriba y hacia abajo de la parte posterior del piso del salivario. Estos músculos han sido descritos en hembras de I. holocyclus16. La posibilidad de que el suelo del salivario pueda bajar o subir se ha propuesto anteriormente en relación con el rápido estallido de saliva, basándose en un registro de señales eléctricas durante la ingestión de R. microplus y Dermacentor andersoni12,17,18,19,20. Durante la salivación de R. microplus, se observaron desviaciones rápidas (hasta 30 por segundo) hacia abajo en la conductividad, seguidas de picos más grandes al final de la salivación. Una explicación de estas mediciones son las contracciones de los músculos de la parte anterior de la faringe, acompañadas de una pulsación similar de la membrana sobre el canal alimentario (canal hipostomal) que abre un canal para la expulsión de la saliva20. Suponemos que los pequeños músculos oblicuos unidos al suelo del salivario pueden generar una vibración que facilite el movimiento de la saliva. Sin embargo, también los músculos laterales que influyen en el diámetro del espacio interior del salivario pueden participar en la expulsión de la saliva fuera de las piezas bucales (no incluido en la animación). Sugerimos que el movimiento de los quelíceros dentro de la piel del huésped también puede ayudar a expulsar la saliva del salivario hacia la piel del huésped. Las bases de los quelíceros (ChB en la Fig. 2A,B) están situadas directamente sobre el salivario (desde la vista dorsal) y especulamos que estas estructuras pueden comprimir localmente el salivario para ayudar a la expulsión de la saliva. Las extensiones de los quelíceros, que eran ligeramente asíncronas, se observaron mediante microscopía intravital de dos fotones directamente en el lugar de alimentación durante todo el periodo de ingestión de I. scapularis21. Observamos que los quelíceros comienzan a moverse de forma ligeramente asíncrona tras la aplicación de pilocarpina en la cutícula dorsal de hembras de I. ricinus no alimentadas y parcialmente alimentadas (películas 5 y 6, respectivamente). Las bases quelicerales (ChB en la Fig. 2A,B) están situadas directamente encima del salivario (desde la vista dorsal) y podemos especular que estas estructuras pueden expandir o comprimir el salivario y ayudar a expulsar la saliva. Se sabe que la aplicación de pilocarpina, un fármaco colinérgico no endógeno, induce la salivación indirectamente a través del sistema nervioso central de la garrapata22, mientras que su efecto en otros tejidos de la garrapata permanece oculto. Por lo tanto, no podemos excluir el movimiento de los quelíceros mediado por la pilocarpina en nuestros experimentos como un efecto adicional de este fármaco en las garrapatas. Bockenstedt et al. sugirieron que los quelíceros obligan a retroceder a las fibras de colágeno que pueden comprimir el lugar de alimentación, lo que confirma en gran medida nuestras hipótesis de expulsión de saliva mediada por los quelíceros hacia el hospedador21.
Justo antes del final de la cavidad del salivario, los conductos salivales pareados entran en sus esquinas laterales12. Ambos conductos salivales están encerrados en una lámina de tejido (TSD en la Fig. 2C,E,F,M,N, de color púrpura oscuro) que probablemente sujeta de forma flexible los conductos salivales a las esquinas laterales del salivario.
Simulación de la salivación y succión de la sangre basada en el modelo 3D
Durante el proceso de alimentación en las garrapatas ixódidas, la salivación alterna con la succión lenta o rápida de la sangre y puede incluir un periodo de descanso. Los porcentajes de tiempo dedicados a cada actividad durante la ingestión de la hembra son variables y se basan en la hora del día, el tamaño de las garrapatas, etc.18. En la película 4, animamos tanto el canal de alimentación como el canal para el paso de la saliva con las estructuras asociadas y mostramos cómo funcionan estas estructuras. El proceso de alimentación de la mayoría de las garrapatas ixódidas comienza con la secreción de sustancias similares al cemento, lo que permite que la garrapata se fije en la piel del hospedador y selle el hueco entre la lesión de alimentación y las piezas bucales insertadas23,24,25. El periodo de salivación puede terminar con un breve estallido de saliva16,17,18,19. La expulsión de la saliva es probablemente facilitada por la vibración de la parte posterior del suelo del salivario; el movimiento de las bases de los quelíceros también puede estar en juego (Película 6). Antes de que comience la succión de sangre, el orificio de la parte posterior del salivario se estrecha gracias a los músculos laterales estirados entre el techo del salivario y la pared lateral del cuerpo de la garrapata. A esta acción le sigue la apertura de la válvula faríngea y una expansión de la faringe anterior causada por la contracción de los músculos dilatadores anteriores. Posteriormente, la parte media de la faringe se estira a lo largo de su eje longitudinal y la sangre se introduce en la faringe. La válvula faríngea anterior se cierra antes de que la pared faríngea se contraiga de nuevo y la sangre sea empujada posteriormente hacia el esófago. Esta onda peristáltica se repite hasta que comienza la salivación. Al comienzo de la salivación, los músculos restrictores laterales del salivario se relajan, ampliando así la cavidad del salivario. El descenso y la elevación repetidos del techo del salivario en su parte posterior probablemente facilitan la entrega de saliva al canal preoral.