¿Qué es la secuenciación en tiempo real de una sola molécula (SMRT)?

Por el Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Revisado por Christian Zerfaß, Ph.D.

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• ¿Cómo funciona la secuenciación SMRT?
• Estudio de la metilación del ADN en bacterias; una aplicación de la secuenciación SMRT

La secuenciación del ADN funciona utilizando la ADN polimerasa para añadir nucleótidos a una plantilla. Hay varias tecnologías disponibles para la secuenciación del ADN. Una de ellas es la secuenciación en tiempo real de una sola molécula, o secuenciación SMRT.

Investigador examinando la diapositiva de transparencia de la secuencia de ADN. Crédito: Shawn Hempel /

¿Cómo funciona la secuenciación SMRT?

Al igual que con otras tecnologías de secuenciación de ADN, el primer paso tras la extracción del ADN es preparar una «biblioteca». Este proceso prepara el ADN para la secuenciación; en este caso, se añaden adaptadores a cada extremo de una molécula de ADN de doble cadena, lo que permite que el ADN se convierta en una plantilla circular de una sola cadena. Esto significa que el ADN puede secuenciarse de forma continua.

Esta biblioteca de ADN, o la plantilla de ADN, se introduce en un secuenciador de ADN que contiene «guías de onda de modo cero» que tienen la ADN polimerasa inmovilizada en un extremo. Una sola molécula de ADN se inmoviliza en estas guías de onda de modo cero, y la ADN polimerasa comienza a añadir nuevos nucleótidos a una cadena de ADN sintetizada de novo complementaria al ADN molde. Las bases de estos nucleótidos se etiquetan, y la incorporación de estas bases a la cadena de ADN en crecimiento provoca la emisión de luz. Esta emisión de luz se lee entonces en tiempo real, y como la emisión de cada base es diferente, esto permite identificar la base específica.

La principal ventaja de la secuenciación SMRT es la generación de lecturas de secuenciación largas de alta precisión, lo que mejora el ensamblaje de genomas completos. Esto se debe a que las lecturas de secuenciación más largas significan que se requiere menos «construcción» para ensamblar el genoma.

Estudio de la metilación del ADN en bacterias; una aplicación de la secuenciación SMRT

¿Qué es la metilación del ADN?

La adición de un grupo metilo al ADN, también conocida como metilación, ocurre en todos los reinos de la vida. Hay tres nucleótidos metilados presentes en las bacterias; m5C (C5-metil-citosina, que también está presente en los eucariotas), m6A (N6-metil-adenina) y m4C (N4-metil-citosina, que sólo se encuentra en las bacterias). La metilación se produce después de la síntesis de nuevas cadenas de ADN, y tiene lugar en nucleótidos específicos.

Los grupos metilo sobresalen de la doble hélice del ADN, y por lo tanto pueden afectar a la unión entre el ADN y las proteínas de unión al ADN. Esto, a su vez, repercute en procesos como la replicación de los cromosomas, la reparación de los desajustes del ADN, así como en el momento de la transcripción de los genes y la formación de linajes epigenéticos.

Mecanismos epigenéticos: la metilación o acetilación del adn puede activar o no la transcripción de genes. Image Credit: ellepigrafica /

¿Por qué es importante la metilación del ADN en las bacterias?

Las bacterias están infectadas por virus, por lo que necesitan un mecanismo de protección para superar las infecciones virales. Aquí es donde entran en juego los sistemas de modificación por restricción; este sistema está formado por una enzima de restricción, que rompe el ADN en sitios específicos, y una ADN metiltransferasa, que añade un grupo metilo a la adenina (A) o a la citosina (C).

En la mayoría de los sistemas de modificación por restricción, la ADN metiltransferasa actúa para proteger el ADN bacteriano de la enzima de restricción. La presencia de la ADN metiltransferasa significa que el ADN bacteriano se metila, mientras que el ADN viral infectante no lo hace. Esto a su vez significa que el ADN viral es degradado por la enzima de restricción, mientras que el ADN bacteriano está protegido debido a que la enzima de restricción no actúa sobre el ADN metilado. Sin embargo, hay que tener en cuenta que hay enzimas de restricción que actúan sobre el ADN modificado.

Estudios recientes han insinuado que puede haber funciones adicionales para los sistemas de restricción-modificación. Por ejemplo, la eliminación de ciertos sistemas de modificación de la restricción dio lugar a un cambio en la expresión de los genes, que está relacionado con la diferencia en la metilación del ADN. Los sistemas de modificación de la restricción también pueden causar roturas de doble cadena y mutaciones C-T, influyendo así en la evolución de las bacterias. Más recientemente, se han desarrollado tecnologías capaces de determinar la metilación de todo un genoma bacteriano, lo que se conoce como el «metiloma».

¿Cómo se determina el metiloma mediante la secuenciación SMRT?

Como la secuenciación SMRT da resultados en tiempo real, puede utilizarse para detectar modificaciones del ADN, incluidas las metilaciones. La ADN polimerasa incorpora nucleótidos a un ritmo constante, pero este ritmo puede cambiar si el nucleótido de la plantilla ha sido modificado. Esto puede notarse durante el proceso de secuenciación.

Blow at al. utilizó la secuenciación SMRT para mapear las modificaciones del ADN en 230 microorganismos. Las modificaciones que buscaron incluían m5C, m6A y m4C. Los autores descubrieron que el 93% de estos microorganismos mostraban metilación del ADN, y también encontraron 834 motivos que estaban metilados. Esto permitió a los autores identificar qué motivos son los objetivos de 620 metiltransferasas de ADN.

Interesantemente, los autores observaron que aunque el 48% de los organismos estudiados tenían una metiltransferasa de ADN, no había pruebas de que hubiera también una enzima de restricción. Por lo tanto, es posible que la metilación del ADN desempeñe un papel importante en la regulación del genoma, u otra función importante en los microorganismos que aún está por identificar.

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Escrito por

Dra. Maho Yokoyama

La Dra. Maho Yokoyama es investigadora y escritora científica. Se doctoró en la Universidad de Bath, Reino Unido, tras realizar una tesis en el campo de la microbiología, en la que aplicó la genómica funcional al Staphylococcus aureus . Durante sus estudios de doctorado, Maho colaboró con otros académicos en varios trabajos e incluso publicó algunos de sus propios trabajos en revistas científicas revisadas por expertos. También presentó su trabajo en conferencias académicas de todo el mundo.

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