RESULTADOS
La biotipificación de los aislados de Shewanella según dos esquemas distintos proporcionó resultados similares (Tabla1). La mayoría de los aislados clínicos (74%) pertenecían al biovar 2 de Gilardi (biotipo 2 del CDC), siendo negativos a la sacarosa y la maltosa mientras crecían en agar SS y en medios que contenían altas concentraciones de NaCl. La única diferencia importante observada entre el esquema de clasificación de Gilardi (6) y el de Weyant et al. (22) fue que los aislados del biovar 3 (negativos a la sacarosa, maltosa, SS y NaCl) no fueron agrupados por el sistema de biotipado del CDC. En contraste con los aislados humanos, el biovar 1 (biotipo 1 de los CDC) predominó (67%) entre las cepas no humanas. Estas cepas suelen producir ácido a partir de maltosa y/o sacarosa y no crecen en agar con alto contenido en sal o en agar SS. Basándose en las recientes propuestas taxonómicas de Nozue y otros (15), las cepas del biovar 2 (biotipo 2 de los CDC) se identificarían como S. alga, mientras que todas las cepas del biovar 1 (biotipo 1 de los CDC) y 6 de las 7 cepas del biovar 3 se designarían como S. putrefaciens; la cepa restante del biovar 3 se identificó posteriormente como S. alga. Desde el punto de vista clínico, se observó un predominio de S. alga (77%), mientras que se confirmó que la mayoría de los aislamientos no humanos (89%) eran de S. putrefaciens (Tabla 1).
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Designaciones de biovar, biotipo y especie de los aislados de Shewanella según varios esquemas
Todos los 10 aislados de Shewanella, cuando se analizaron en los sistemas API 20E, API NFT, RapID NF Plus y Vitek, se identificaron como S. putrefaciens, con una excepción. Cuatro de las cinco cepas de S. putrefaciens produjeron números de perfil inaceptables en el sistema API 20E (nº 0602026 y 0602006); la quinta cepa generó un número de biotipo raro para S. putrefaciens. Todas las cepas de S. alga dieron una excelente identificación como S. putrefaciens en el API 20E. El sistema API NFT identificó las 10 cepas de Shewanella como S. putrefaciens con identificaciones de buenas a excelentes, con una excepción, también una cepa de S. putrefaciens (valor discriminatorio bajo, 48 h). RapID NF Plus identificó las 10 cepas de Shewanella como S. putrefaciens, con una precisión del 99,9%. Del mismo modo, todas las cepas fueron identificadas por Vitek (con una precisión del 97 al 99%) como S. putrefaciens, aunque tres cepas de S. putrefaciens necesitaron de 5 a 9 h de incubación antes de la identificación final, en contraste con los resultados de 4 h para las otras 7 cepas. Sin embargo, las reacciones de los carbohidratos (arabinosa y maltosa) en los sistemas API 20E, API NFT y Vitek permiten asignar correctamente la mayoría de las cepas a los taxones correspondientes (S. putrefaciens y S. alga) si se leen manualmente después de las identificaciones finales como S. putrefaciens.
La comparación de las propiedades bioquímicas y enzimáticas de las especies de Shewanella reveló una serie de diferencias (Tabla 2). En todas las cepas de S. alga se detectó hemólisis en agar sangre de oveja, como informaron Nozue et al. (15), pero sólo en un par de cepas de S. putrefaciens. La mayoría de las cepas de S. alga mostraron este fenotipo sólo después de una incubación prolongada (48 a 72 h), y la zona de hemólisis era a menudo irregular y difícil de detectar. Se confirmaron otras actividades que anteriormente ayudaban a la separación de S. alga y S. putrefaciens, como el crecimiento a 42°C, el crecimiento en medios con altas concentraciones de sal (6,5%) y la producción de ácido a partir de l-arabinosa, sacarosa y maltosa. Encontramos un número sustancialmente mayor de cepas de S. putrefaciens que crecían en agar SS de lo que se había informado anteriormente; la mayoría de ellas procedían de fuentes no humanas. Con la excepción de la ribosa, la producción de ácido a partir de la oxidación de carbohidratos se asoció exclusivamente a S. putrefaciens. Sin embargo, los patrones de azúcares variaron considerablemente entre estos aislados, siendo algunos positivos para la arabinosa, la maltosa y la sacarosa, mientras que otros sólo fueron positivos para la maltosa o fueron asacarolíticos (cepas del biovar 3). Se detectaron varias actividades enzimáticas nuevas entre algunos aislados de Shewanella que, hasta donde sabemos, no se habían notificado anteriormente. Entre ellas se encuentran las actividades de tirosinasa, alquilsulfatasa, quitinasa y elastasa (Tabla 2); la mayoría de estas enzimas se encontraron en aislados no humanos deS. putrefaciens. La mayoría de las cepas de S. alga y S. putrefaciens produjeron un sideróforo, según se determinó en los ensayos de Chrome Azurol S. Esta actividad fue débil, y cinco cepas (tres de S. alga y dos de S. putrefaciens) no crecieron en este medio.
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Propiedades bioquímicas y enzimáticas de S. alga y S. putrefaciens
Los aislados de Shewanella seleccionados que crecieron bien a 35°C se caracterizaron además por su actividad enzimática utilizando API-ZYM (Tabla 3) y por los perfiles de ácidos grasos celulares con el sistema MIDI. De los nueve sustratos atacados por una o ambas especies de Shewanella con API-ZYM, las actividades globales más altas para siete de estas enzimas se asociaron con S. alga. La única actividad que se encontró más fuerte en S. putrefaciens fue la valina arilamidasa, aunque esta actividad era extremadamente débil incluso en estas cepas. Ambas especies produjeron una actividad de fosfatasa alcalina uniformemente fuerte. Una observación adicional fue que todas las cepas de S. alga produjeron sistemáticamente ocho de estas nueve enzimas, con la única excepción de la valina arilamidasa. En cambio, S. putrefaciens era más heterogénea, ya que cuatro de las nueve enzimas detectadas no estaban universalmente presentes en todas las cepas. El análisis de las cepas de 14Shewanella indicó que los ácidos grasos predominantes eran i-15:0, 17:1ω8c y 16:0; algunas cepas producían grandes cantidades de 16:1ω7c (del 9 al 18%), mientras que otras producían cantidades insignificantes. Aunque la mayoría de los picos de ácidos grasos fueron bastante consistentes entre las cepas de S. alga y S. putrefaciens analizadas, se observaron varias diferencias (Tabla 4). Se observaron valores medios más altos de ácido pentadecanoico y de ácido cis-9-heptadecenoico (17:1ω8c) en el caso de S. alga, mientras que lo contrario ocurrió en el caso de S. putrefaciens con respecto a los ácidos hexadecanoico y dodecanoico. Para el ácido hexadecanoico, no se observó ningún solapamiento en el rango total de ácidos grasos entre S. alga y S. putrefaciens; para el ácido pentadecanoico y 17:1ω8c, sólo un aislado de S. putrefaciens o de S. alga produjo un valor que cayera dentro del rango del otro. Si bien ningún pico individual fue diagnóstico, el uso de los cuatro picos juntos separó claramente las 14 cepas de Shewanella en dos grupos según las especies.
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Propiedades enzimáticas de Shewanellaspecies determinadas por la prueba API-ZYM
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Separación de S. alga y S. putrefaciens mediante el análisis de ácidos grasos
Se encontró que las 23 cepas de S. putrefaciensc podían dividirse en tres grupos separados basados en varias características fenotípicas (Tabla 5). El grupo 1, que constaba de ocho cepas, incluida la ATCC 8073, producía ácido a partir de la maltosa, la sacarosa y la arabinosa y utilizaba ácido urocánico. Las cepas del grupo 1 se dividieron por igual entre los aislados clínicos y los no humanos. Las cepas del grupo 2 (n = 6), entre las que se encontraba la ATCC 8071, se distinguían principalmente de las del grupo 1 por la incapacidad de oxidar la sacarosa y la maltosa. De nuevo, la mitad de estas cepas procedían de material clínico. Las cepas del grupo 3 (n = 9), todas de origen ambiental (zona del lago Michigan), diferían drásticamente de las de los grupos 1 y 2. Crecían mal o no crecían. Crecían mal o no crecían a 35°C, producían quitinasa y no se pigmentaban en agar triptófano. Las nueve cepas del grupo 3 produjeron inicialmente α-glucosidasa, pero al repetir la prueba sólo tres cepas dieron un resultado positivo constante. La maltosa fue oxidada, pero no la sacarosa ni la arabinosa. A diferencia de los grupos 1 y 2, el ácido urocánico no se utilizó como fuente de energía.
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Biogrupos de S. putrefaciens
Recientemente, Vogel y sus colegas (21) han observado diferencias entre S. alga y S. putrefaciens en sus susceptibilidades a ciertos agentes antimicrobianos, como la penicilina, la ampicilina y la tetraciclina. Esto, unido al informe que relaciona la actividad hemolítica con S. alga y su aparente asociación con la enfermedad humana, sugiere posibles diferencias de patogenicidad entre estas dos especies (Tabla6). Por lo tanto, seleccionamos 10 cepas (5 de cada especie) para su posterior análisis. Aunque no observamos diferencias importantes en la susceptibilidad a la penicilina, la ampicilina y la tetraciclina entre estos dos grupos en función de la categoría de susceptibilidad (susceptible, intermedia o resistente), sí observamos que las CIM medias para S. alga de la penicilina, la ampicilina y la tetraciclina (∼200, 56 y 5.2 μg/ml, respectivamente) eran mayores que las correspondientes CIM de S. putrefaciens (3, 1,3 y 1,1 μg/ml, respectivamente).
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Propiedades de virulencia de las especies deShewanella
Cuatro de las cinco cepas de S. putrefaciens se adhirieron débilmente (+) a fuertemente (+++) (Tabla 6) a las células HEp-2 en los ensayos de adherencia; en cambio, ninguna cepa de S. alga mostró características adhesivas similares, aunque cuatro cepas se adhirieron fuertemente al fondo del portaobjetos de vidrio. No se detectaron actividades invasivas en ninguna cepa deShewanella. Aunque se observó una reacción hemolítica retardada en agar sangre de oveja para las cinco cepas de S. alga (Tabla 2), no se detectó betahemólisis con la técnica de superposición de agar ni con los ensayos en caldo (Tabla 6); las cepas de E. tarda de control dieron positivo en 1 h en ambas pruebas. Para las cinco cepas de S. alga (y un aislado de S. putrefaciens), se observó a veces una débil reacción citotóxica durante los estudios de adhesión e invasión. Esta reacción citotóxica se manifestó por la aparición de células HEp-2 con una morfología celular anormal, incluyendo restos celulares (fantasmas). Sin embargo, se encontraron diferencias en la patogenicidad en ratones entre estas dos especies, ya que la DL50 media en ratones Swiss Webster para S. alga fue de 1,9 × 108 UFC, mientras que la de S. putrefaciens fue de 8,4 × 108 UFC (P < 0,02).