Micronúcleo
Los MN se originan a partir de fragmentos cromosómicos o cromosomas enteros que se retrasan en la anafase durante la división nuclear y no se incluyen en los núcleos principales.13,18,19 Los MN son pequeños cuerpos extranucleares que surgen en las células en división a partir de fragmentos acéntricos de cromosomas o cromosomas enteros que se retrasan en la anafase y no se incluyen en los núcleos hijos en la telofase.20 En la telofase, se forma una envoltura nuclear alrededor de los cromosomas y fragmentos rezagados, que luego se desenrollan y asumen gradualmente la morfología de un núcleo interfásico, excepto que son más pequeños que los núcleos principales de la célula (de ahí el término «micronúcleo»).19 Los MN que albergan fragmentos cromosómicos pueden ser el resultado de la rotura directa de ADN de doble cadena, la conversión de roturas de una sola cadena en roturas de doble cadena después de la replicación celular o la inhibición de la síntesis de ADN.20
Los MN pueden formarse por diferentes vías: a saber, a partir de fragmentos de cromosomas acéntricos o de cromátidas. Una pequeña proporción de fragmentos cromosómicos acéntricos puede surgir simplemente de roturas de ADN de doble cadena no reparadas. Otros mecanismos que podrían conducir a la formación de MN a partir de fragmentos acéntricos incluyen la reparación por escisión simultánea de bases dañadas (por ejemplo, la 8-oxo-deoxiguanosina) o inapropiadas incorporadas en el ADN (por ejemplo, el uracilo) que se encuentran en proximidad y en hebras de ADN complementarias opuestas.21 Otro mecanismo que puede dar lugar a MN por pérdida de cromosomas es la hipometilación de la citosina en las secuencias de repetición centroméricas y pericentroméricas, como las clásicas repeticiones satelitales en las regiones pericentroméricas y las repeticiones de orden superior del ADN satélite en el ADN centromérico.21 Debido al papel central de las proteínas del cinetocoro en el acoplamiento de los cromosomas con el huso, es probable que las mutaciones que conducen a defectos en la dinámica de interacción del cinetocoro y los microtúbulos puedan ser la causa de la formación de MN debido a la pérdida de cromosomas en la anafase. Otras variables que probablemente aumenten la formación de MN por pérdida de cromosomas son los defectos en el ensamblaje del huso mitótico, los defectos en el punto de control de la mitosis y la amplificación anormal del centrosoma.21
El destino de las MN después de su formación en la célula micronucleada es poco conocido. Su destino postmitótico incluye: (1) eliminación de la célula micronucleada como consecuencia de la apoptosis; (2) expulsión de la célula (cuando se espera que el ADN dentro de la MN no sea funcional o capaz de replicarse debido a la ausencia de los componentes citoplasmáticos necesarios); (3) reincorporación al núcleo principal (cuando el cromosoma reincorporado puede ser indistinguible de los del núcleo principal y podría reanudar la actividad biológica normal); y (4) retención dentro del citoplasma de la célula como entidad extranuclear (cuando la MN puede completar una o más rondas de replicación del ADN/cromosoma).20,22
La ventaja clave del ensayo CBMN radica en su capacidad para detectar tanto eventos clastogénicos como aneugénicos, que conducen a aberraciones cromosómicas estructurales y numéricas, respectivamente.20 Los clastógenos inducen MN al romper la doble hélice del ADN, formando fragmentos acéntricos que son incapaces de adherirse a las fibras del huso y de integrarse en los núcleos hijos, por lo que quedan fuera durante la mitosis. Lo mismo ocurre con los cromosomas enteros con los cinetocoros dañados; no pueden adherirse a los microtúbulos que tiran de las cromátidas hacia las células hijas durante la mitosis y, por tanto, quedan fuera de los nuevos núcleos. Este daño podría ser generado por sustancias químicas que reaccionan con las proteínas que forman los cinetocoros.23,24
Los antígenos son sustancias químicas que impiden la formación del aparato del huso durante la mitosis. Estos agentes generan no sólo cromátidas enteras que quedan fuera de los núcleos, formando así MN, sino también la formación de células multinucleadas, en las que cada núcleo contendría un número diferente de cromosomas. También es probable que estos agentes induzcan un aumento de las figuras mitóticas que se observan claramente en los mismos portaobjetos. Con el ensayo CBMN es posible distinguir entre las MN que se originan a partir de cromosomas enteros y las que se originan a partir de fragmentos acéntricos, así como determinar si se está produciendo una malsegregación de cromosomas entre núcleos en una célula binucleada que puede no contener MN, mediante el uso de sondas centroméricas.8,10,19
Las sondas de ADN centroméricas se utilizan para distinguir entre las MN que se originan a partir de cualquier evento de pérdida de cromosomas enteros y las MN que contienen fragmentos cromosómicos acéntricos. El uso de sondas de ADN centromérico específicas de los cromosomas permite tanto la determinación de eventos específicos de pérdida cromosómica que dan lugar a MN como la segregación desigual de cromosomas específicos entre los núcleos hijos, incluso en ausencia de formación de MN.21 Las sondas pancentroméricas deben utilizarse únicamente para distinguir entre las MN originadas por roturas cromosómicas (centrómero negativo) y la pérdida cromosómica (centrómero positivo). Las sondas centroméricas específicas de los cromosomas deben utilizarse únicamente para medir la malsegregación (debida a la no disyunción o a la pérdida de cromosomas) que afecta a cromosomas únicos.8,10,19,21,25 La evaluación del origen mecánico de las MN individuales mediante la identificación del centrómero y el cinetocoro contribuye a la alta sensibilidad y especificidad del método.20
Hay factores importantes que influyen en la frecuencia de las MN de referencia en los linfocitos humanos. La edad y el sexo son las variables demográficas más importantes que afectan al índice de MN; las frecuencias en las mujeres son mayores que las de los hombres por un factor de 1,2-1,6, dependiendo del grupo de edad.26 La frecuencia de MN se correlacionó significativa y positivamente con la edad en hombres y mujeres y se ve afectada por factores dietéticos como la deficiencia de folato y los niveles plasmáticos de vitamina B12 y homocisteína. También se propuso que el índice de MN puede verse influido por la propensión de las células de un individuo a someterse a la apoptosis, y por factores genéticos como los polimorfismos genéticos.10,20,27
De forma general, la formación de MN se atribuye a una variedad de insultos al material genético, que podrían clasificarse como factores exógenos y endógenos. Los factores exógenos incluyen la radiación, los agentes químicos y la invasión de microorganismos. Los factores endógenos incluyen defectos genéticos, cambios patológicos, deficiencia de ingredientes nutricionales esenciales (por ejemplo, ácido fólico) y lesiones inducidas por productos metabólicos deletéreos (como las especies reactivas del oxígeno).28
La hipótesis de una asociación predictiva entre la frecuencia de MN en el ensayo CBMN en linfocitos y el desarrollo del cáncer está respaldada por una serie de hallazgos: (1) se infirió una asociación entre la frecuencia de MN y el riesgo de cáncer a partir de las similitudes mecanísticas con las aberraciones cromosómicas, que demostraron ser predictivas del cáncer; (2) in vitro, se observa una alta concordancia entre las aberraciones cromosómicas y las MN; (3) se observa un aumento de la frecuencia de MN en linfocitos de pacientes con cáncer y en pacientes con síndromes que los hacen propensos al cáncer, como el síndrome de Bloom y la ataxia telangiectasia; (4) la frecuencia de MN está significativamente asociada a la concentración en sangre de vitaminas como el folato, cuyas deficiencias se asocian a un mayor riesgo de padecer algunos cánceres; (5) existe una relación directa entre las frecuencias de MN y las primeras etapas de la carcinogénesis: a saber, una asociación significativa entre el aumento de las frecuencias de MN y las categorías de diagnóstico de bajo y alto grado de carcinogénesis cervical en las mujeres.20
La formación de anomalías nucleares como las MN, los reordenamientos cromosómicos y los puentes de anafase (que conducen a ciclos de rotura-fusión-puente y a la generación de más MN) son acontecimientos que se observan comúnmente en las primeras etapas de la carcinogénesis. Los niveles elevados de MN indican defectos en la reparación del ADN y en la segregación cromosómica que podrían dar lugar a la generación de células hijas con una dosis de genes alterada, o a una desregulación de la expresión génica que podría conducir a la evolución del fenotipo de inestabilidad cromosómica que suele observarse en el cáncer. Estas consideraciones dan apoyo mecánico a una posible asociación causal entre la frecuencia de MN y el riesgo de cáncer. Un estudio de Bonassi et al.29 observó una asociación entre la frecuencia de MN y el riesgo de cáncer en neoplasias no hematológicas, lo que sugiere que los sucesos de daño genómico en los linfocitos pueden estar correlacionados con los sucesos que inician el cáncer en otros tejidos a través de un factor genético, dietético o ambiental común.