Microbiología y Experimentación

En este estudio se llevó a cabo el aislamiento y la caracterización de cepas bacterianas del municipio de Barrackpore y del vertedero de Dhapa. El crecimiento bacteriano depende de varias condiciones físico-químicas como el medio, el pH, la temperatura, el período de incubación, la fuente de carbono, etc. Por lo tanto, las diferentes condiciones en las que crecen las bacterias en el hábitat natural deben ser estudiadas antes de ir a la multiplicación masiva para su uso como descomponedor. Así, se tuvieron en cuenta los siguientes parámetros:

Características físicas y químicas de los residuos sólidos urbanos

Las bacterias pueden crecer en un amplio rango de niveles de humedad. En este estudio, se encontró que el contenido de humedad de la muestra recogida en el municipio de Barrackpore y en el vertedero de Dhapa era de aproximadamente 65,32% y 66,45% respectivamente. La población bacteriana de varios suelos está estrechamente correlacionada con su contenido de humedad. La máxima densidad bacteriana se encuentra en regiones con un contenido de humedad bastante alto y el nivel óptimo para las actividades de las bacterias aeróbicas suele ser un 50%-75% de la capacidad de retención de humedad del suelo.1 Los números de los géneros Pseudomonas, Achromobacter y Bacillus se encuentran en la mayoría de los suelos aeróbicos; donde las condiciones son anaeróbicas y húmedas aparecerá Clostridium. Los actinomicetos mostraron un aumento cuantitativo similar en tales condiciones.15

En este estudio se optimizó el ph de los dos medios seleccionados (BCDA y NA) para el cultivo de las cepas bacterianas. El ph de la muestra recogida fue de 7,79 en ambos. El pH es un factor clave para el cultivo de bacterias en medios artificiales. La optimización del pH se llevó a cabo en dos medios seleccionados, a saber, el agar nutritivo (NA) y el agar czapek dox básico (BCDA). El NA y el BCDA con un pH de 7,2 y 7,6 resultaron adecuados para el máximo crecimiento de las cepas bacterianas. A partir de los resultados, se encontró que el pH de la muestra era de alrededor de 7,79 y posible por esta razón, estas cepas también se encontraron para crecer bien en, condición in vitro a pH 7-8 en BCDA y NA. Las bacterias pueden tolerar una reacción del suelo entre los niveles de pH 4 y 10, pero el pH más favorable para la mayoría es sólo un lado alcalino a la neutralidad. Bacterias como Thiobacillus thiooxidans y Acetobacter sp. son capaces de crecer en los valores de pH muy bajos entre el nivel de pH 0 y 2 y algunos Bacillus sp. pueden crecer a pH 11.15 El crecimiento óptimo de Thermoactinomycetes se produce a pH 8 o 9 y se ve muy deprimido por reacciones de alrededor de pH 516 Vibrio, Streptococcus faecalis y Escherichia coli también toleran una reacción alcalina (pH 8-9).16

El contenido de NPK de la muestra se estudió inicialmente. Se encontró que el contenido de materia orgánica era de 27,84% (Municipio de Barrackpore) y 29,32% (Dhapa), el contenido de nitrógeno en % era de 0,165 (Municipio de Barrackpore) y 0,179 (Dhapa), el contenido de fósforo en % era de 0,502 (Municipio de Barrackpore) y 0,545 (Dhapa) y el contenido de potasio en % era de 18,29 (Municipio de Barrackpore) y 19,21 (Dhapa). Todos estos análisis dieron una clara comprensión del entorno nativo de las bacterias y, por lo tanto, fueron los factores determinantes en el aislamiento y cultivo de las cepas.

Características de cultivo de las cepas bacterianas

En nuestro estudio, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 y C3 -estas 9 cepas bacterianas fueron aisladas en medios de cultivo. El agar czapek dox (BCDA) fue adecuado para el crecimiento masivo de BM3, D1,C2 y el agar nutriente (NA) fue adecuado para el crecimiento masivo de BM1, BM2, D2, D3, D4, C3. Se observó que el medio con extracto de levadura y xilano era adecuado para el crecimiento máximo de las bacterias, pero Pseudomonas sp., Bacillus spp. y Aeromonas sp. crecieron bien en el medio de agar nutritivo. Se utilizó la observación visual y microscópica para caracterizar las cepas seleccionadas. Se anotan los detalles de las características de las colonias de las bacterias (Tabla 1). La tinción de Gram es un método antiguo y fiable para observar las bacterias. Las bacterias Gram negativas se decoloraron con alcohol, perdiendo el color púrpura del cristal violeta. Las bacterias Gram positivas no se decoloraron y permanecieron de color púrpura.

En la presente investigación, BM1, BM2, BM3, D1, D2, D3, D4, C2 y C3 -se aislaron estas 9 cepas bacterianas y se llevó a cabo la caracterización microbiológica. Los resultados mostraron que BM1, BM3, D1 son bacilos grampositivos, BM2 son bacilos cortos grampositivos, D2 son diplobacilos grampositivos, D3, C2 son bacilos gramnegativos, D4 son bacilos cortos gramnegativos y C3 son cocos grampositivos. También se realizaron diferentes pruebas bioquímicas a los 9 aislados para conocer sus características bioquímicas. Los detalles de los caracteres bioquímicos de las bacterias se anotan en la (Tabla 2).

Los resultados anteriores dieron una idea de la morfología, las características de las colonias y la naturaleza bioquímica de las cepas aisladas que ayudaría a la identificación y caracterización de las cepas bacterianas aisladas en el futuro.

Optimización de las condiciones de crecimiento

En la presente investigación, se observó el crecimiento de las cepas aisladas en varios medios de crecimiento como NA, ACDA y BCDA. Se observó que el agar czapek dox básico (BCDA) era adecuado para el crecimiento masivo de BM3, D1, C2 y el medio de agar nutritivo (NA) era adecuado para el crecimiento masivo de BM1, BM2, D2, D3, D4, C3.

En este experimento, los cultivos bacterianos de 9 cepas se incubaron a diferentes temperaturas como 25, 29, 34, 37 y 40 °C. El crecimiento óptimo de todas las cepas se encontró en 37 °C. El rango de temperatura óptimo para las bacterias es de unos 25-36°C. Un gran número de bacterias puede crecer bastante bien por encima de la temperatura 10-4°C.6 Sultana17 observó que las temperaturas de 33± 4°C eran ideales para el crecimiento de las bacterias.17 Ciertas bacterias se desarrollan más vigorosamente a temperaturas inferiores a 20°C. Los termófilos crecen bien a temperaturas de 45-65 °C y algunos termófilos son incapaces de multiplicarse por debajo de 40°C.1

Las cepas obtenidas en este estudio se incubaron durante diferentes períodos de incubación (6, 12, 24, 36, 48 y 72h). El período de incubación de 24 horas fue adecuado para BM1, BM2, D2, D3, D4 y C3, mientras que BM3, D1 y C2 resultaron adecuados con un período de incubación de 36 h. Las bacterias coliformes crecen en el período de incubación de 24± 2h y a 32°C y muestran un buen crecimiento a 37°C durante 48 h de incubación. En la observación visual, se encontró que después de 24 horas de incubación, el color de BM2 era naranja claro, BM1 era blanco y BM3 era blanco cremoso en su medio preferido (BCDA y NA). Tras 48-72h de incubación, el color de BM2 era naranja, BM1, D1 era amarillo, C2 era rojo y BM3, D2, D3, D4, C3 permanecían de color blanco cremoso. Los tipos de colonias de las cepas BM1, BM2, D2 y D4 eran húmedas y el resto eran cremosas. Los estafilococos y los micrococos producen colonias de color marrón dorado, amarillo o blanco en medios ordinarios. Algunos enterococos, corineformes y enterobacterias pueden producir colonias negras en los medios ordinarios.8

Ensayo de antagonismo

Se empleó el método de estrías cruzadas para determinar el antagonismo entre las cepas bacterianas para su futura aplicación en diferentes aspectos. Se describen los detalles del antagonismo dentro de los aislamientos bacterianos (Tabla 3).

BM2 presenta antagonismo con todas las demás cepas, por lo que no es posible desarrollar un consorcio utilizando esta cepa como uno de los aislados. D1, D3 también tienen antagonismo con la mayoría de las otras cepas. BM1 es la cepa más potente, ya que no presenta antagonismo con ninguna de las demás cepas. BM3, D2, D4, D5 y D6 tienen antagonismo con unos pocos aislados y estas cepas junto con BM1 pueden probarse en diferentes combinaciones para preparar el consorcio.

Ensayo de tolerancia a metales pesados

Se seleccionaron cinco metales pesados (As, Zn, Pb, Hg, Cd) para determinar la capacidad de tolerancia al metal de las cepas bacterianas aisladas (BM1, BM2, BM3, DF1, D2, D3, D4, C2, C3). La prueba de tolerancia indicó que, entre los cinco metales pesados experimentados, la tolerancia máxima se dio con el Pb, que mostró el crecimiento de los microorganismos hasta 4000ppm, y la tolerancia mínima con el Cd, que no mostró crecimiento por encima de 30ppm. La CIM se observó cuando los aislados no crecieron en las placas incluso después de 10 días de incubación. El resultado muestra que para las tres bacterias la CIM osciló entre 250ppm y 350ppm para As, Cd (10-30ppm), Zn (200-300ppm), Hg (200-300ppm) y Pb (3000-4000ppm) (Tabla 4). En el presente estudio, la mayor tolerancia al As y al Cd se encontró en BM1, mientras que la mayor tolerancia al Zn se observó en BM2 y BM3 mostró la máxima acumulación de Hg y Pb. En nuestro estudio el metal más tóxico (con la MIC más baja) es el Cd mientras que el metal menos tóxico probado es el Pb (Tabla 4).

MIC se observó cuando los aislados no crecieron en las placas incluso después de 10 días de incubación.18 Mergeay et al.19 probaron las concentraciones inhibitorias mínimas (CIM) de varios metales diferentes y descubrieron que el metal más tóxico (con la CIM más baja) era el mercurio, mientras que el metal menos tóxico era el manganeso.19 La tolerancia microbiana a cada concentración de metal pesado se representó mediante la prueba de ensayo en taza. El diámetro de la zona de inhibición alrededor de cada vaso aumentó con el incremento de la concentración de metales pesados, lo que indica el efecto tóxico de los metales pesados sobre el crecimiento de los microorganismos. El municipio de Barrackpore y el vertedero de Dhapa recogen todos los residuos sólidos, tanto domésticos como industriales, de la ciudad de Barrackpore y de Calcuta, respectivamente, y de sus alrededores. Los residuos procedentes de fuentes domésticas e industriales son el entorno adecuado donde los microorganismos pueden desarrollar resistencia a los metales pesados. La presencia de pequeñas cantidades de metales pesados en los residuos sólidos puede inducir la aparición de microorganismos resistentes a los metales pesados. La resistencia microbiana a los metales pesados se atribuye a una serie de mecanismos de desintoxicación desarrollados por los microorganismos resistentes, como la complejación por exopolisacáridos, la unión con las envolturas celulares bacterianas, la reducción de metales, el eflujo de metales, etc. Estos mecanismos se codifican a veces en genes plasmídicos que facilitan la transferencia de la resistencia a los metales tóxicos de una célula a otra.20 El organismo resistente a los metales pesados podría ser un agente potencial para la biorremediación de la contaminación por metales pesados. Dado que los metales pesados son todos similares en su mecanismo tóxico, la tolerancia a múltiples metales es un fenómeno común entre las bacterias resistentes a los metales pesados.21

Ensayo de sensibilidad a los antibióticos

La prueba de sensibilidad a los antibióticos ayuda a determinar la eficacia de un antibiótico contra el organismo de prueba. Se examinaron los 9 aislados para determinar su sensibilidad a cuatro antibióticos y el resultado se observa (Tabla 5). La mayoría de los aislados producen compuestos antimicrobianos que pueden servir a la ciencia médica. D1, D3 y D5 no mostraron actividad antimicrobiana.

Ensayo de actividad antimicrobiana

La producción de compuestos antimicrobianos parece ser un fenómeno general para la mayoría de las bacterias. En el presente estudio, 3 aislados mostraron actividad antibacteriana y 5 aislados mostraron actividad antifúngica, pero 3 aislados no mostraron ni actividad antibacteriana ni antifúngica contra los patógenos. El resultado se ha representado (Tabla 6). Los miembros del género Bacillus producen una variedad de compuestos antimicrobianos, muchos de ellos identificados como péptidos, lipopéptidos y derivados fenólicos. La búsqueda de nuevos metabolitos secundarios con actividad biológica diversa en entornos variados ha cobrado mayor atención en los últimos años.

Producción de enzimas extracelulares

Con la creciente concienciación sobre la protección del medio ambiente, el uso de enzimas, particularmente de extremófilos, ha ganado una considerable atención en muchos procesos industriales. En los últimos años, las enzimas microbianas han sustituido a los catalizadores químicos en la fabricación de productos químicos, textiles, farmacéuticos, papel y productos químicos agrícolas alimentarios. Los bioprocesos industriales basados en enzimas compiten ahora directamente con los procesos químicos establecidos. Sin embargo, en este estudio, los 9 aislados se sometieron a un ensayo cualitativo para la producción de ocho enzimas diferentes, como proteasa, lecitinasa, DNasa, lipasa, celulasa, amilasa, catalasa y oxidasa. Subramani y Narayanasamy realizaron un estudio similar.23 Curiosamente, en nuestro estudio 6 de ellas mostraron la producción de la enzima proteasa, que tiene un alto valor comercial. Todas las 9 cepas produjeron la enzima catalasa y oxidasa. El resultado se observa (Tabla 7).

Ensayo de proteasa

6 cepas (BM1, BM3, D1, D3, C2 y C3) de entre las 9 aisladas mostraron producción de proteasa. La proteasa tiene una amplia aplicación en la industria alimentaria, la industria de los detergentes, los productos farmacéuticos, así como en la degradación de residuos sólidos, por lo que se llevó a cabo un ensayo cuantitativo de la proteasa producida. Se determinó la actividad de la enzima proteasa así producida y el resultado se expresó en UI/ml. El resultado se representa (Tabla 8). El ensayo cuantitativo de la proteasa demostró invariablemente que, entre las 6 cepas, la BM1 produce proteasa con un alto valor de título y Gupta et al.,24 informaron de forma similar sobre la producción de proteasa alcalina a partir de especies bacterianas y su aplicación industrial.

Potencial de degradación de residuos por las bacterias aisladas

La enzima proteasa tiene una amplia aplicación en la degradación de residuos. Así, las 6 cepas capaces de producir la enzima proteasa fueron sometidas a la prueba de eficiencia de degradación de residuos. En nuestro estudio se puede observar que BM1 tiene el mayor potencial de degradación seguido de BM3. BM1 es también un potente productor de enzimas proteasas, por lo que también posee una mayor capacidad de degradación (Figura 1). A medida que los residuos son descompuestos por los microorganismos (bacterias), el peso de la hojarasca disminuye. En el presente estudio de descomposición, observamos que el peso de la hojarasca tratada disminuyó porque las bacterias la descompusieron y la convirtieron en moléculas simples. El porcentaje de pérdida de peso de las muestras de residuos aumentó con la progresión del proceso de descomposición, como puede verse en la figura 1. Una observación similar fue reportada por Zaved et al.,25 sobre el estudio de la pérdida de peso de la basura por bacterias específicas en Bangladesh. En nuestro estudio se puede observar que BM1 tiene el mayor potencial de degradación seguido. Así pues, BM1 puede utilizarse eficazmente para la biorremediación de residuos sólidos.