Los criptocromos

Los relojes biológicos circadianos son osciladores bioquímicos que realizan ciclos cada 24 horas aproximadamente y que pueden ser reiniciados (arrastrados) por la exposición a la luz y a otras señales ambientales. En los animales existe un oscilador central en el cerebro que controla el comportamiento circadiano de todo el organismo, así como osciladores periféricos en algunos tejidos. La oscilación surge de un bucle de retroalimentación transcripcional en el que interviene un conjunto de factores de transcripción del reloj, entre los que se encuentran el tiempo (Tim), el periodo (Per), el reloj (Clk) y Bmal1, así como los criptocromos. Los criptocromos se expresan de forma ubicua en los órganos y tejidos de todos los organismos, y generalmente son proteínas nucleares que regulan la expresión génica. Los criptocromos animales mejor estudiados son el criptocromo Cry de Drosophila y los criptocromos Cry1 y Cry2 de ratón , y los dos criptocromos CRY1 y CRY2 de Arabidopsis también han sido ampliamente estudiados.

Drosophilacryptochromes

Drosophila Cry es una proteína predominantemente nuclear que media la regulación del reloj circadiano por la luz , aunque también puede encontrarse en el citosol . Regula el reloj circadiano interactuando directamente con la proteína Tim para suprimir el bucle de retroalimentación negativa del reloj (Figura 3a). La luz estimula la interacción Cry-Tim, que promueve la ubiquitinación y la degradación dependiente de proteosomas de Tim y reprime la formación del heterodímero Per-Tim. La inhibición del heterodímero de las proteínas Clock y Cycle por el heterodímero Per-Tim se libera así y la fase de la oscilación circadiana se restablece (Figura 3a). Sin embargo, aparentemente el criptocromo no es el único fotorreceptor que arrastra el reloj circadiano en Drosophila. La ritmicidad conductual de la mosca crybmutante, que carece de la función Cry, puede sin embargo ser arrastrada en respuesta a la luz a menos que la transducción de la señal por el pigmento visual sea también eliminada. Además de su papel como fotorreceptor para el arrastre del oscilador central de Drosophila, Cry también tiene un papel independiente de la luz en la función del oscilador circadiano periférico.

Criptócromos de mamíferos

Las dos funciones de Drosophila Cry -como fotorreceptor para el arrastre del reloj circadiano junto con los pigmentos visuales y como componente integral del complejo proteico oscilador circadiano- son también características de los criptocromos de mamíferos. Los criptocromos de mamíferos son proteínas predominantemente nucleares, pero también pueden encontrarse en el citosol. Al igual que el Cry de Drosophila, los criptocromos de mamíferos desempeñan funciones dependientes e independientes de la luz en la regulación del reloj circadiano. Varias observaciones demuestran el papel dependiente de la luz de las proteínas Cry de mamíferos. Los ratones knockout que carecen de uno o ambos genes Cry tienen una capacidad reducida o abolida para inducir la expresión de genes como per y el protooncogén c-fos en respuesta a la luz . Además, las pupilas de los ratones mutantes que carecen tanto de Cry1 como de Cry2 tienen respuestas reflejas reducidas a la luz.

Por otra parte, el ratón mutante doble cry1 cry2 muestra una ritmicidad aparentemente normal en condiciones cíclicas de luz-oscuridad, pero pierde la ritmicidad instantánea y completamente en condiciones de funcionamiento libre (siempre oscuro) . Estas observaciones indican que las proteínas Cry desempeñan una función esencial e independiente de la luz en el oscilador circadiano central de los mamíferos, y que los criptocromos no son los únicos fotorreceptores que median el control del reloj por la luz. El hecho de que los criptocromos sean partes integrales del oscilador central de los ratones hace que sea casi imposible probar directamente su papel en el control lumínico del reloj. No obstante, se ha comprobado que, de forma análoga a la situación de Drosophila, el mutante cry del ratón conserva su capacidad para mediar en la entrada de luz a menos que la función de los pigmentos visuales también se interrumpa al mismo tiempo. Los ratones triplemente mutantes que portan mutaciones de ambos criptocromos junto con una mutación degenerativa de la retina son casi arrítmicos en condiciones de ciclo luz-oscuridad . Estos resultados demuestran que las proteínas Cry de los mamíferos están efectivamente implicadas en la regulación del reloj circadiano por la luz, pero su papel en la regulación lumínica del reloj circadiano es llevado a cabo de forma redundante por otros fotorreceptores. Ahora parece claro que los fotorreceptores adicionales que actúan junto con los criptocromos para el control del oscilador circadiano de los mamíferos son las opsinas de los conos de los bastones y la proteína relacionada melanopsina.

Al igual que el Cry de Drosophila, los criptocromos de los mamíferos interactúan físicamente con las proteínas del reloj, incluyendo los reguladores de la transcripción de unión al promotor Per, Clk y Bmal1 (Figura 3b). A diferencia del Cry de Drosophila, las proteínas Cry de mamíferos son componentes del bucle de retroalimentación negativa del reloj circadiano (Figura 3b). La interacción física del criptocromo con otros componentes del reloj afecta a su actividad, interacción, degradación o tráfico nuclear y, en consecuencia, altera la regulación transcripcional de los genes del reloj. Sin embargo, la interacción entre los criptocromos y otras proteínas del reloj, como Per, Clk y Bmal1, no parece verse afectada por la luz, lo que sugiere que tales interacciones pueden no ser el mecanismo de fotoentrenamiento del reloj circadiano, como ocurre en Drosophila. Además de la regulación directa de la transcripción a través de la interacción física con los reguladores de la transcripción de unión al promotor, los criptocromos también pueden afectar al reloj circadiano mediante la participación en la regulación de las modificaciones de las histonas , pero la forma en que esto funciona aún no se ha dilucidado.

Los criptocromos de Arabidops

Arabidopsis CRY1 y CRY2 son proteínas predominantemente nucleares que median la regulación de la expresión génica y el arrastre del reloj circadiano en respuesta a la luz . CRY1 y CRY2 desempeñan papeles importantes en la fotomorfogénesis de las plantas, como la inhibición de la elongación del tallo por la luz azul, la estimulación de la expansión de las hojas por la luz azul y la regulación de la iniciación floral por la duración del día . Parece que los criptocromos controlan los cambios en el desarrollo de las plantas a través de cambios en la expresión de los genes en respuesta a la luz. CRY1 y CRY2 juntos son responsables de los cambios dependientes de la luz azul en la expresión génica de hasta el 10-20% del genoma de Arabidopsis.

Hay al menos dos mecanismos por los que los criptocromos pueden afectar a los cambios de expresión génica nuclear en respuesta a la luz. En primer lugar, una molécula de criptocromo puede interactuar con proteínas asociadas a la maquinaria transcripcional para afectar directamente a la transcripción. El CRY2 de Arabidopsis se une a la cromatina de forma independiente de la secuencia de ADN (y M. Maymon y C.L., observaciones no publicadas), pero no está claro cómo una proteína que interactúa con la cromatina de forma independiente de la secuencia puede regular la expresión génica. A diferencia de los criptocromos animales que han demostrado regular la transcripción a través de interacciones físicas con reguladores de la transcripción que se unen al promotor, no se ha informado de tal interacción para los criptocromos vegetales. Un modelo alternativo es que los criptocromos vegetales pueden interactuar con proteínas que ejercen otras funciones celulares para regular la estabilidad, la modificación y el tráfico celular de los reguladores de la transcripción. Por ejemplo, se ha descubierto que los criptocromos de las plantas interactúan con una ubiquitina ligasa E3, COP1, lo que sugiere que los criptocromos de las plantas pueden actuar de una forma aún no descubierta para los criptocromos de los animales. En consonancia con este punto de vista, también se ha descubierto recientemente que los criptocromos de Arabidopsis median en la supresión por la luz azul de la degradación dependiente del proteasoma de un importante regulador floral, CONSTANS . El mecanismo catalítico de los criptocromos no ha sido completamente dilucidado, pero se pueden encontrar algunas pistas en el mecanismo de las fotoliasas CPD, donde el FAD juega el principal papel catalítico. En una reacción de reparación del ADN, la fotoliasa CPD se une al dímero de pirimidina del ADN y lo «vuelca» desde el interior del dúplex de ADN a la cavidad de acceso al FAD de la enzima, para formar un complejo estable. El otro cromóforo (pterina o deazaflavina), también llamado cromóforo «antena», absorbe fotones de luz azul o UV-A y transfiere la energía de excitación a la flavina del FAD. La flavina en el estado de excitación dona un electrón al dímero de pirimidina para dividir el anillo de ciclobutano. El electrón se transfiere de nuevo a la flavina en este proceso, lo que da lugar a la regeneración de la flavina en estado básico. El dinucleótido reparado ya no cabe en la cavidad de acceso del FAD, por lo que se disocia de la fotoliasa. El papel exacto del FAD y de la cavidad de acceso al FAD en la función de los criptocromos sigue sin estar claro, pero es concebible que también pueda estar implicado en las reacciones de transferencia de electrones.

Aunque la región PHR que contiene el o los cromóforos es la parte más conservada de las proteínas, se ha demostrado que el dominio carboxi-terminal tiene un papel en la función o la regulación de los criptocromos tanto animales como vegetales. La expresión de los dominios carboxi-terminales de los criptocromos de Arabidopsis fusionados a la enzima marcadora b-glucuronidasa confiere una respuesta de crecimiento constitutiva a la luz incluso en la oscuridad en ausencia de la región PHR . En cambio, las regiones PHR de los criptocromos de Drosophila y Xenopus son fisiológicamente activas en ausencia del dominio carboxi-terminal . El dominio carboxi-terminal del Cry de Drosophila es importante para la estabilidad de la proteína, la interacción con Tim y la sensibilidad del fotorreceptor a las señales luminosas circadianas , mientras que el dominio carboxi-terminal del Cry de Xenopus es necesario para su localización nuclear .

Los criptocromos están regulados por fosforilación. Se ha demostrado que los criptocromos de Arabidopsis se fosforilan en respuesta a la luz azul y que esto está asociado a la función y regulación de los fotorreceptores . Además, cuando el CRY1 de Arabidopsis se expresó en células de insectos, se descubrió que sufría una autofosforilación dependiente del ATP y de la luz azul . No se sabe si los criptocromos animales también se unen al ATP, aunque se ha demostrado que los criptocromos de ratón están fosforilados .

La interacción entre la región PHR del CRY1 de Arabidopsis y el ATP tiene algunas características interesantes que recuerdan a la interacción entre el dímero de pirimidina y la fotoliasa: los grupos fosfato del ATP están expuestos al disolvente; las moléculas de adenina y ribosa están enterradas en lo más profundo de la cavidad de acceso al FAD; y el ATP puede tener un contacto mediado por agua con el FAD . La interacción de la región CRY1 pHR de Arabidopsis con el ATP también carece de varias características comúnmente encontradas en las interacciones proteína-ATP, como la interacción proteína-fosfato, el contacto proteína-Mg2+ y un residuo de serina cercano para la fosfotransferencia. Un examen de la topología de la estructura de la región PHR de CRY1 muestra, sin embargo, que todas estas características podrían ser proporcionadas por el dominio carboxi-terminal del criptocromo (Figura 4). La observación de que los dominios carboxi-terminales ricos en serina de los criptocromos de Arabidopsis fusionados a la β-glucuronidasa están constitutivamente fosforilados in vivo (, sugiere que puede producirse una fosfotransferencia desde el ATP unido a la cavidad de acceso al FAD al dominio carboxi-terminal cercano (Figura 4a). También es concebible que el FAD excitado por fotones pueda desencadenar la transferencia de electrones al nucleótido y la fosfotransferencia del ATP a los residuos de serina en el dominio carboxi-terminal. Dado que la superficie de la región PHR está predominantemente cargada negativamente, especialmente en el lugar donde es probable que el dominio carboxi-terminal interactúe con ella, el dominio carboxi-terminal fosforilado sería entonces repelido de la superficie de la región PHR, dando lugar a un cambio de conformación del criptocromo. Este cambio conformacional le permitiría interactuar con otras proteínas de señalización y propagar la señal luminosa (Figura 4a). Alternativamente, otra molécula de criptocromo que se una a la cavidad de acceso al FAD también puede proporcionar las características que faltan para una interacción productiva entre ATP y criptocromo. De hecho, tanto la interacción CRY2-CRY2 como las interacciones CRY1-CRY2 pueden detectarse en Arabidopsis (D. Shalitin, X. Yu y C.L., observaciones no publicadas). La formación de un homo-oligómero o un hetero-oligómero de criptocromos proporcionaría un mecanismo para la fosfotransferencia intermolecular, que puede cambiar la estructura de los criptocromos (Figura 4b, c).