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Factores correctores y señales de reconocimiento

Un sistema modelo para la terapia de sustitución enzimática surgió de los estudios de fibroblastos de piel cultivados derivados de pacientes con enfermedades de almacenamiento de mucopolisacáridos (MPS). Dichos fibroblastos mostraban una acumulación excesiva de glicosaminoglicanos, que se interpretó como debida a una degradación inadecuada de estas macromoléculas . Se descubrió por casualidad que una mezcla de fibroblastos derivados de pacientes con MPS I (síndrome de Hurler) y MPS II (síndrome de Hunter) presentaba un patrón normal de metabolismo de glicosaminoglicanos (Figura 1) . Se sabía que las dos enfermedades eran genéticamente distintas, ya que la MPS I se hereda de forma autosómica recesiva y la MPS II es un trastorno ligado al cromosoma X, lo que llevó a Fratantoni et al. a plantear la hipótesis de que los fibroblastos de diferentes genotipos se proporcionaban mutuamente el producto génico que faltaba. Estudios posteriores demostraron que no era necesario que las células genéticamente distintas estuvieran en contacto entre sí para que se produjera dicha corrección cruzada, ya que el medio condicionado por una podía ser correctivo para la otra. La estrategia de la corrección cruzada podría extenderse a las enfermedades relacionadas: las células que se corrigieran mutuamente tendrían un genotipo diferente, mientras que las células que no se corrigieran de forma cruzada tendrían el mismo genotipo (pero véase la importante excepción más adelante).

Como el síndrome de Hurler se había postulado como una enfermedad de almacenamiento lisosómico basada en la observación de los lisosomas del hígado dramáticamente hinchados en los pacientes afectados , Fratantoni et al. plantearon la hipótesis de que los «factores correctivos» en el medio condicionado podrían ser enzimas lisosómicas que eran secretadas por una línea celular y endocitadas por la otra. Sin embargo, los factores correctores no se correspondían con ninguna enzima lisosómica conocida en ese momento (esta situación cambió un par de años más tarde, cuando se descubrió un MPS de deficiencia de β-glucuronidasa). Se procedió a la purificación de los factores correctores de Hurler y Hunter, no a partir de un medio condicionado, sino de la orina, un fluido corporal relativamente rico en enzimas lisosomales. Se asignó una función a los factores purificados utilizando una variedad de métodos bioquímicos, lo que dio lugar a que los factores correctores de Hurler y Hunter se denominaran α-l-iduronidasa e iduronato sulfatasa, respectivamente.

Las células que requerían el factor corrector de Hurler para normalizar su metabolismo de los glucosaminoglicanos (de pacientes con el síndrome de Hurler y con el síndrome de Scheie) también tenían una actividad deficiente de α-l-iduronidasa ). La corrección de los fibroblastos de Hurler se acompañó de la captación de α-l-iduronidasa. Como buenos augurios para la terapia de sustitución enzimática, la captación fue notablemente eficiente y sólo hubo que internalizar una cantidad muy pequeña de α-l-iduronidasa para proporcionar una corrección completa.

Este podría haber sido el final de la historia, excepto por una pequeña discrepancia en el patrón de elución de la actividad enzimática y la actividad correctora de una columna de hidroxiapatita , lo que sugiere que las dos actividades del factor corrector de Hurler no eran precisamente idénticas. Siguiendo esta discrepancia, Shapiro et al. separaron la α-l-iduronidasa en fracciones correctivas y no correctivas en una columna de heparina-Sepharose, indicando que el factor correctivo tenía alguna característica que no era necesaria para la actividad catalítica pero sí para la captación. Del mismo modo, se encontraron múltiples formas de β-glucuronidasa, que diferían en la captación y la actividad correctora.

La existencia de una señal específica para la captación de una enzima lisosomal había sido sugerida por los resultados de un estudio sobre un trastorno recientemente descubierto que se asemeja a la MPS – denominado enfermedad de las células de inclusión (enfermedad de las células I) debido a las prominentes inclusiones de fase densa en los fibroblastos cultivados. Mientras que estos fibroblastos tenían múltiples deficiencias de enzimas lisosomales, el medio que los rodeaba contenía un gran exceso de enzimas lisosomales . Sin embargo, las enzimas secretadas por los fibroblastos de la enfermedad de las células I no eran endocitadas por otras células y no eran correctoras; presumiblemente, carecían de la señal para su captación en los lisosomas . Dado que varias enzimas lisosomales estaban afectadas por este defecto de un solo gen (la enfermedad de las células I se hereda de forma autosómica recesiva), se postuló que la señal era una modificación postraduccional de las proteínas enzimáticas. Se postuló además que era de naturaleza de carbohidrato, ya que podía ser destruida por un tratamiento suave de periodato . El concepto de un sistema de reconocimiento basado en carbohidratos estuvo fuertemente influenciado por los descubrimientos de Ashwell y sus colegas sobre el papel de los carbohidratos en la captación de glicoproteínas circulantes por el hígado.

La presencia de una señal específica reconocible implicaba un proceso saturable, mediado por el receptor, y sugería que la captación de enzimas lisosomales seguiría la cinética de Michaelis-Menten. Se esperaba que los análogos de las señales de reconocimiento se comportaran como inhibidores competitivos de la captación. Esta expectativa se investigó mediante la captación de α-l-iduronidasa y de β-glucuronidasa por los correspondientes fibroblastos deficientes. El descubrimiento por parte de Kaplan et al. de que el mejor inhibidor de la captación de la β-glucuronidasa era el manosa-6-fosfato (M6P), y su sugerencia de que el M6P era (o formaba parte) de la señal de reconocimiento largamente buscada, fue sorprendente, ya que anteriormente no se había informado de la existencia de ningún carbohidrato fosforilado en las glicoproteínas de mamíferos. Se confirmó inmediatamente para la captación de la α-l-iduronidasa y otras enzimas lisosomales, utilizando una variedad de métodos bioquímicos; la prueba definitiva vino del análisis estructural de los grupos de carbohidratos fosforilados . La señal descubierta a través de la endocitosis resultó ser también la señal para dirigir las hidrolasas nacientes a los lisosomas.

Se demostró que el defecto en la enfermedad de las células I, que impide que las células sinteticen la señal de reconocimiento de la M6P, es una deficiencia de la primera de las dos enzimas implicadas en la síntesis de la señal de la M6P . Se descubrieron dos receptores para la M6P; la química y la biología de los receptores de la M6P y su papel en el tráfico celular se convirtieron en un campo amplio y muy activo de la biología celular . Estos temas son objeto de muchas revisiones, incluidos los capítulos 3 y 5 de este volumen. La importancia del sistema M6P para la terapia de reemplazo enzimático se discutirá más adelante.

Al mismo tiempo que estos estudios en fibroblastos cultivados, un sistema in vivo condujo al hallazgo de otra señal para la captación de enzimas lisosomales. Se descubrió que varias enzimas lisosomales, inyectadas por vía intravenosa en ratas, se eliminaban rápidamente de la circulación; sin embargo, persistían mucho más tiempo si se pretrataban con periodato o si se co-inyectaban con una agalactoglicoproteína . Una vez más, se postuló que los hidratos de carbono proporcionaban señales para el reconocimiento específico. En este caso, el azúcar clave para el reconocimiento fue la manosa, y la captación se produjo en las células reticuloendoteliales del hígado. Se demostró que el receptor de la manosa, que reconoce la N-acetilglucosamina y la l-fucosa además de la manosa, se encuentra en la superficie de los macrófagos. Es de cierto interés histórico que los experimentos de captación de invertasa, que ocuparon un lugar destacado en la propuesta original de terapia de sustitución enzimática (véase más arriba), tuvieron éxito porque la invertasa es una glicoproteína con cadenas de manano que son reconocidas por el receptor de manosa.