Líneas celulares
Las líneas celulares y sus fuentes son las siguientes: 293T (ATCC CRL-11268), 786-O (ATCC CRL-1932) y HK-2 (ATCC CRL-2190). Las células THP-1 fueron proporcionadas amablemente por el Banco de Células Madre de la Academia China de Ciencias. Las células se cultivaron en medio DMEM (para 293T y 786-O), MEM (para HK-2) o RPMI 1640 (THP-1) con 10% de suero bovino fetal y 2 mM de l-glutamina, a 37 °C en presencia de 5% de CO2. Antes de la infección por bacterias, el tratamiento por proteínas o el análisis de quimiotaxis, el medio se cambió a un medio libre de suero.
Cruzas bacterianas y plásmidos
Las cepas bacterianas y los plásmidos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla Suplementaria S3. Las cepas de E. coli se cultivaron a 37 °C en medio Luria-Bertani (LB) en condiciones estáticas durante 12 h con los antibióticos adecuados cuando fue necesario, a las siguientes concentraciones: Kanamicina a 50 μg/ml, ampicilina a 100 μg/ml y cloranfenicol a 15 μg/ml. La cepa ΔhlyA se generó mediante la sustitución de hlyA por un gen cat utilizando la recombinasa λ-Red. Para generar la cepa ∆hlyA p-hlyA, el gen hlyA se amplificó por PCR a partir del cromosoma de la cepa CFT073 de la UPEC y se ligó a pTRC99A en los sitios enzimáticos KpnI y XbaI, y el plásmido se transformó en ∆hlyA por electroporación. Los genes hlyC y hlyA del CFT073 o el ADN complementario (ADNc) que codifica para la Nectina-2 se amplificaron mediante PCR y se clonaron en pET-28a ( + ) para producir proteínas recombinantes activas marcadas con FLAG o con HA, o la Nectina-2. Para producir HlyA inactiva marcada con FLAG (pro-HlyA), el gen hlyA sin hlyC de CFT073 se clonó en pET-28a ( + ) en los sitios enzimáticos XbaI y XhoI. La Nectina-2 marcada con Myc se integró en el vector pLenti-Hygro para su transfección.
Expresión y purificación de la proteína recombinante HlyA, pro-HlyA y Nectina-2 humana
La expresión de la HlyA recombinante o de la pro-HlyA se realizó en E. coli BL21 (DE3), y la expresión de la Nectina-2 se realizó en Rosetta (DE3). Antes de la inducción con 100 μM de IPTG, las bacterias se cultivaron a 37 °C hasta alcanzar una DO600 de 0,6 a 0,8. Las bacterias cultivadas se recogieron por centrifugación (8000 × g durante 5 minutos a 4 °C) tras 12 h de inducción a 16 °C en LB con IPTG. Las bacterias se lisaron con lisozima y ultrasonidos y el sobrenadante se centrifugó para eliminar las partículas (18.000 × g durante 30 min a 4 °C). A continuación se purificaron las proteínas utilizando el sistema de purificación Ni-NTA (GenScript, Nanjing, China). Las proteínas se eluyeron con 250 mM de imidazol. Las fracciones con los fragmentos de HlyA se agruparon, se dializaron en imidazol 150 mM, imidazol 50 mM y dos veces con PBS. Posteriormente, las fracciones que contenían la proteína deseada se concentraron a 500 μl utilizando unidades de filtrado centrífugo Amicon Ultra-15 (Millipore, Burlington, MA, USA). El último tampón de diálisis que tenía un entorno iónico similar al de la proteína HlyA purificada se utilizó como control de la proteína purificada en los experimentos. La concentración final de proteínas se determinó espectrofotométricamente (Nanodrop-2000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE.UU.) utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA (23225, Thermo Scientific).
Modelo de pielonefritis de ratón
Todos los estudios con animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Médica de Tianjin, Tianjin, China. Se hizo todo lo posible para minimizar el sufrimiento de los animales y reducir el número de animales utilizados. Los ratones hembra C57BL/6J, de 6 a 8 semanas de edad, se adquirieron en la Academia de Ciencias Médicas Militares (Pekín, China). El modelo de ratón con pielonefritis aguda se estableció según lo descrito anteriormente.53 Las bacterias se cultivaron durante la noche en medio LB estático a 37 °C. Las bacterias cultivadas se dispersaron por centrifugación (5000 × g durante 5 minutos a 4 °C) y se resuspendieron en PBS para obtener una densidad de 2 × 1010 UFC/ml. Con un intervalo de 3 horas, se inocularon ratones C57BL/6J hembra anestesiados por vía intrauretral con 50 μl de cepas UPEC (109 UFC) dos veces.54,55 A las 12, 24 y 48 hpi, se sacrificaron los ratones y se extrajeron sus riñones asépticamente y se homogeneizaron en 1 ml de PBS que contenía 0,025% de Triton X-100, y luego se diluyeron en serie para el recuento de bacterias. A las 24 horas, los tejidos renales también se utilizaron para la citometría de flujo, la histología y el análisis de citoquinas proinflamatorias.
Análisis de citometría de flujo
Las suspensiones de células individuales se generaron mediante la digestión con 1,5 mg/ml de colagenasa IV (C5138, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EE.UU.) y 100 ng/ml de DNasa I en PBS durante 30 minutos a 37 °C bajo agitación suave. A continuación, las suspensiones celulares digeridas se filtraron a través de un colador celular de 70 μm (352350, BD Biosciences, San José, CA, EE.UU.) para obtener suspensiones unicelulares. Los receptores Fc se bloquearon con CD16/32 (101319, Biolegend, San Diego, CA, EE.UU.) y las suspensiones unicelulares se incubaron con los siguientes anticuerpos anti-CD11b conjugado con APC (17-0112-82, Thermo Fisher Scientific), anti-Ly6G conjugado con PE (127608, Biolegend), anti-F4/80 conjugado con FITC (11-4801-82, Thermo Fisher Scientific), anti-CD11c conjugado con PE (127608, Biolegend), anti-CD206 conjugado con PerCP/Cy5.5 (141716, Biolegend). Las células se analizaron en un citómetro de flujo FACSCanto II (BD Biosciences) utilizando el software Flow Jo (FlowJo, Ashland, OR, EE.UU.).
Tinción H&E e inmunohistoquímica
Los riñones se fijaron en formalina tamponada con fosfato al 10% durante al menos 24 h. A continuación, el tejido fijado se incrustó en parafina y se cortó en secciones de 5 μm. Los portaobjetos se tiñeron con hematoxilina y eosina. Los cambios histopatológicos renales se evaluaron mediante una escala de 6 puntos en la que 0, 1, 2 y 3 indicaban lesiones histológicas normales, leves, moderadas y graves (el daño patológico se localizaba principalmente en la médula y en la unión cortical-medular); mientras que 4, 5 y 6 indicaban lesiones histológicas leves, moderadas y graves (el daño patológico se localizaba principalmente en más partes del riñón). Los exámenes histológicos fueron analizados por dos personas que no conocían los grupos experimentales.56,57 Para el análisis inmunohistoquímico, las secciones se tiñeron con el anticuerpo anti-Nectina-2 (27171-I-AP, 1:200, Proteintech, Chicago, IL, USA). Las imágenes se adquirieron con un microscopio (BX46, Olympus, Tokio, Japón).
Análisis de inmunofluorescencia de tejidos y células
Los riñones se incrustaron en compuesto OCT con nitrógeno líquido. Los bloques congelados se cortaron en secciones de 5 µm, y se secaron al aire a temperatura ambiente durante 1 h, y se fijaron con acetona fría durante 10 min. A continuación, las secciones congeladas se sumergieron inmediatamente en metanol durante 20 minutos y luego en metanol con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos. Los tejidos se bloquearon con albúmina de suero bovino (BSA) al 5% durante 1 h, y se incubaron con el anticuerpo anti-F4/80 (ab6640, Abcam, 1:200), el anticuerpo anti-Ly6G (ab210402, Abcam, 1:200), el anticuerpo Nectin-2, (ab135246, Abcam, 1:200) en tampón de bloqueo durante toda la noche a 4 °C cuando fue necesario. A continuación, los portaobjetos se lavaron cinco veces con PBS y se incubaron con un anticuerpo secundario marcado con Alexa Fluor 488/549 (Proteintech, 1:200) durante 1 hora a temperatura ambiente. Para la visualización de los núcleos, las secciones de tejido se contratinaron con DAPI. Las imágenes se adquirieron con un microscopio fluorescente (IX73, Olympus). Las células 293T transfectadas con pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 se cultivaron en un cubreobjetos Lab-Tek y se trataron con 75 nM de HlyA durante 6 h, se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 15 min y se sometieron a tinción de inmunofluorescencia con el anticuerpo anti-MYC-Tag (66003-2-Ig, 1:25, Proteintech) y el anticuerpo HA-Tag (2367S, 1:200, CST) a 4 °C durante la noche. Se utilizó un segundo anticuerpo marcado con Alexa Fluor 488/594 (Proteintech) incubando a temperatura ambiente durante 1 h. Se obtuvieron imágenes de las células utilizando un microscopio de fluorescencia confocal (FV1000-D, Olympus).
Infección de células epiteliales de riñón con cepas UPEC
Las células epiteliales de riñón humano (786-O o HK-2) se sembraron en placas de 24 pocillos, 24 h antes de las infecciones UPEC. Para la inhibición de ADAM10, las células se preincubaron con el inhibidor de ADAM10 GI254023X (Sigma-Aldrich) durante 20 h antes de las infecciones. Las células se infectaron con bacterias a la multiplicidad de infección (MOI) indicada durante 6 h o se estimularon con las concentraciones indicadas de HlyA purificada o pro-HlyA durante 12 h. En algunos experimentos, las células se trataron con ∆hlyA (MOI 0.01) con HlyA purificada (75 nM) durante 6 h. Para el ensayo de invasión, tras 6 h de infección, las células se lavaron cinco veces con PBS y se trataron con 200 μg/ml de gentamicina durante 1 h para eliminar las bacterias extracelulares. A continuación, las células se lavaron dos veces con PBS y se lisaron con 500 μl de tritón X-100 al 0,2% en PBS y se colocaron en placas de agar LB para enumerar las bacterias intracelulares.
Asayo inmunoenzimático (ELISA)
Se midieron los niveles de GM-CSF en el sobrenadante de las células 786-O infectadas, de las células 786-O tratadas con HlyA/pro-HlyA o de los riñones homogeneizados después de la infección utilizando un kit de desarrollo de ELISA (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China) según las instrucciones del fabricante. Se extrajeron los riñones de los ratones y se homogeneizaron en PBS que contenía un 1% de Tritón X-100 y tabletas completas de cóctel de inhibidores de la proteasa sin EDTA (11697498001, Roche, Indianápolis, IN). A continuación, los homogeneizados se incubaron en hielo durante 30 minutos y se centrifugaron a 10.000 × g durante 10 minutos a 4 °C; se recogieron los sobrenadantes y se utilizaron para el ensayo ELISA de GM-CSF, IL-1β, TNF-α, IL-6 y MIP-2 según las instrucciones del fabricante (Neobioscience Technology Company, Shenzhen, China).
Asayos de citotoxicidad
Se recogieron los sobrenadantes de cultivo de las células 786-O tratadas con proteínas purificadas o con tampón de diálisis durante 12 h, y se detectó la presencia de lactato deshidrogenasa (LDH) utilizando un kit de ensayo de citotoxicidad no radiactivo CytoTox-96 (G1780, Promega, Madison, WI, USA).
Muestras de orina de pacientes
Se recogieron muestras de orina de pacientes infectados por cepas de UPEC sometidos a tratamiento en el Segundo Hospital de la Universidad Médica de Tianjin, y se determinó la presencia del gen hlyA en la cepa de UPEC aislada de la orina de cada paciente mediante PCR (Tablas suplementarias S2 y S4). La orina se concentró a 200 μl utilizando unidades de filtrado centrífugo Amicon Ultra-15 (UFC901024, Millipore), y luego el líquido concentrado se detectó mediante el kit de desarrollo ELISA (Neobioscience Technology Company). Los estudios asociados con las muestras de los pacientes fueron aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Tianjin, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los pacientes.
Extracción de ARN y qRT-PCR
Las células 786-O se infectaron con CFT073, ∆hlyA o ∆hlyA p-hlyA (MOI 0,01) durante 4 h. El ARN se extrajo utilizando un kit de extracción de ARN total (Solarbio, Pekín, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante y se transcribió de forma inversa utilizando el kit de síntesis de ADNc de primera cadena RevertAid (Thermo Fisher Scientific). La qRT-PCR se realizó utilizando una mezcla maestra FastStart Universal SYBR Green (Roche, Basilea, Suiza) en un sistema 7900 Fast Real-Time PCR (Roche). Las condiciones del ciclo de PCR fueron 95 °C durante 5 minutos, seguidos de 40 ciclos de 95 °C durante 20 s, 60 °C durante 20 s y 72 °C durante 20 s. Se utilizó β-actina como control endógeno y los datos se normalizaron basándose en el nivel de transcripción de β-actina en el tipo salvaje y se cuantificaron utilizando el método del ciclo de umbral crítico comparativo 2-∆∆Ct. Los cebadores utilizados se enumeran en la Tabla Suplementaria S4.
Ensayos de quimiotaxis
Los ensayos de migración celular se realizaron utilizando cámaras Transwell (tamaño de poro 5 μm, Costar, Corning 3421, Corning, NY, USA). Las células THP-1 (2 × 106 en 200 μl) se resuspendieron en medio RPMI 1640 sin suero y se añadieron a la cámara superior. El sobrenadante de las células 786-O infectadas se mezcló con 1 μg/ml de anticuerpo neutralizante contra el GM-CSF humano (502203, BVD2-23B6, Biolegend) o IgG2a de control (400515, Rat IgG2a, Biolegend) y se incubó durante 30 min. A continuación, se añadieron 600 μl de medio con el sobrenadante a la cámara inferior como quimioatrayente. Tras 3 h o 6 h de incubación a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2, se contaron las células migradas en la cámara inferior.
Liposomas de clodronato y tratamiento con anticuerpos anti-GM-CSF
Para eliminar los macrófagos, se administraron 200 µl de PBS o liposomas de clodronato a los ratones por vía intravenosa 24 h antes de la infección.32,33 Para neutralizar el GM-CSF, se inyectó por vía intravenosa en los ratones un anticuerpo neutralizante contra el GM-CSF (505408, MP1-22E9, Biolegend, 250 µg) o la IgG2a de control (400533, Rat IgG2a, Biolegend, 250 µg) 1 h antes de la infección.33,58
Anticuerpos y western blotting
Los anticuerpos se obtuvieron de las siguientes empresas: anticuerpo monoclonal anti-FLAG (F1804, Sigma-Aldrich), anticuerpo anti-MYC-Tag (66004-I-Ig, Proteintech, Chicago, IL, EE.UU.), y anticuerpo anti-Nectina-2 (ab135246, Abcam, Cambridge, Reino Unido). Los lisados de células enteras se prepararon utilizando el tampón de lisis RIPA (Millipore), con inhibidores de proteasa completos (Roche, Basilea, Suiza). Se utilizó el kit de ensayo de proteínas BCA (Thermo Fisher) para determinar la concentración de proteínas. Para revelar la unión de los anticuerpos se utilizó IgG anti-conejo conjugada con HRP (1:10000, Sigma-Aldrich) o IgG anti-ratón (1:10000, Sigma-Aldrich). Los complejos inmunorreactivos se detectaron utilizando el sustrato quimioluminiscente HRP de Immobilon Western (Millipore) y se expusieron a una máquina GE Amersham Imager 600.
Análisis de far-western y LC-MS/MS
El protocolo de far-western blotting se llevó a cabo como se ha descrito previamente.59 Las células 786-O se lavaron dos veces con PBS frío, y las proteínas de la membrana celular se aislaron utilizando un kit de extracción de proteínas de membrana y citosol (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las proteínas solubles asociadas a la membrana se analizaron mediante electroforesis en gel de dodecil sulfato de sodio y poliacrilamida en geles al 10%. A continuación, las proteínas se transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (PVDF) (Merck Millipore, Darmstadt, Alemania). Las proteínas transferidas se renaturalizaron utilizando el tampón AC reduciendo gradualmente la concentración de guanidina-HCl.59 A continuación, la membrana se bloqueó con leche desnatada al 5% en el tampón TBST durante 1 h. Después, la membrana se incubó con 30 μg/ml de HlyA marcada con FLAG purificada o con tampón de diálisis durante toda la noche a 4 °C. Tras el lavado, la membrana se incubó con un anticuerpo anti-FLAG diluido 1:1000 (Sigma-Aldrich) durante una noche a 4 °C en leche desnatada al 5% en el tampón TBST. A continuación, la membrana se lavó a fondo y se incubó con IgG antiratón conjugado con HRP (1:10000, Sigma-Aldrich)
Las bandas diferenciales entre el grupo del tampón de diálisis y el grupo de HlyA marcado con FLAG se identificaron mediante LC-MS/MS, realizada con un espectrómetro de masas nanoLC-LTQ-Orbitrap XL (Thermo, San José, CA, EE.UU.) acoplado a un sistema de HPLC Eksigent nano LC 1D plus en Majorbio (Shanghai, China). Los péptidos trípticos se digirieron completamente de forma enzimática y se ionizaron utilizando la ionización nano electrospray.33 Los datos se analizaron utilizando un espectro de masas de barrido completo (300 a 1800 m/z). Por último, se utilizó Proteome Discoverer (versión 1.4.0.288, Thermo Scientific) para analizar los datos de MS.
RNA de interferencia y sobreexpresión de Nectin-2
Los RNAs de pequeña interferencia (siRNAs) para los genes objetivo y un siRNA de control codificado (siScr) fueron sintetizados por GenePharma (Shanghai, China). Los siRNAs se transfectaron en células 786-O o HK-2 utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen). pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2 se transfectó en células 786-O o HK-2 utilizando Lipofectamine 3000 (Invitrogen) para sobreexpresar Nectin-2. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, se analizó la expresión proteica de las células mediante western blotting. Las secuencias de los siRNAs se enumeran en la Tabla Suplementaria S4.
Inmunoprecipitación
Las células 293T se transfectaron con el vector pLenti-Hygro o con pLenti-Hygro-Myc-Nectin-2, y luego se cultivaron durante 48 h. A continuación, las células se incubaron con HlyA marcada con FLAG (75 nM) durante 6 h después de la transfección y se lisaron en tampón de lisis (50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1% NP-40, 0,2 mM EDTA, 150 mM NaCl) para realizar ensayos de western blot o inmunoprecipitación (IP). Las células 786-O se incubaron con HlyA marcada con FLAG (75 nM) o con tampón de diálisis durante 6 horas y luego se lisaron con tampón de lisis para el ensayo de IP de proteínas. Los sobrenadantes celulares se incubaron con perlas anti-FLAG M2 (A2220, Sigma-Aldrich) o perlas anti-Myc M2 (A7470, Sigma-Aldrich) durante 12 h a 4 °C para la IP de proteínas marcadas con FLAG o Myc. Para la IP de la proteína Nectina-2, los sobrenadantes celulares se incubaron con el anticuerpo anti-Nectina-2 (ab135246, Abcam) durante 12 h a 4 °C, y luego se incubaron con agarosa Protein A/G (20241, Thermo Fisher) durante 2 h a 4 °C. Se utilizó como control la IgG normal de conejo (2729S, CST). Tras la incubación, los precipitados se recogieron mediante centrifugación, se lavaron cinco veces con el tampón de lisis y se analizaron mediante inmunotransferencia utilizando el anticuerpo monoclonal anti-FLAG, el anticuerpo anti-MYC-Tag o el anticuerpo anti-Nectina-2.
La HlyA recombinante expresada y purificada con FLAG (1 µg) se incubó con 1 μg de Nectina-2 recombinante purificada expresada en bacterias en tampón de unión (20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,1 % Triton-X 100, 100 mM NaCl, 20% glicerina,1% BSA) durante 12 h. A continuación, los complejos se sometieron a la IP de la proteína con FLAG o a la IP de la proteína Nectina-2. Finalmente, las proteínas complejas se analizaron mediante inmunotransferencia.
Análisis estadístico
La significación estadística de las diferencias entre grupos se comprobó mediante el análisis de la varianza (ANOVA). Se utilizó la prueba no paramétrica de Mann-Whitney para calcular la significación estadística en los experimentos in vivo.