Inhibición de MDM2 a través de Nutlin-3A: Un enfoque terapéutico potencial para los mesoteliomas pleurales con inactivación de P53 de tipo salvaje inducida por MDM2

Abstract

Previamente, nuestro grupo demostró que la expresión nuclear de la ubiquitina ligasa E3 (MDM2) en el mesotelioma pleural maligno (MPM) se asocia significativamente con la disminución de la supervivencia global. Una posible explicación podría ser que la sobreexpresión de MDM2 conduce a una degradación proteasomal de TP53 que finalmente resulta en una pérdida de la apoptosis inducida por TP53 y la senescencia. Es bien sabido por otras entidades tumorales que el restablecimiento de la actividad de TP53, por ejemplo, mediante la inhibición de MDM2, da lugar a una respuesta instantánea al estrés inducido por TP53 y/o al daño del ADN de las células cancerosas. Nutlin-3A (un análogo de la cis-imidazolina) se ha descrito como un potente y selectivo inhibidor de MDM2 que previene la interacción MDM2-TP53 mediante la unión específica al bolsillo hidrofóbico de unión a TP53 de MDM2. En el presente estudio, los efectos de la inhibición de MDM2 en MPM a través de Nutlin-3A y los agentes quimioterapéuticos estándar basados en el platino se probaron comparativamente en tres líneas celulares de MPM (NCI-H2052, MSTO-211H y NCI-H2452) que mostraban diferentes perfiles de expresión de TP53, MDM2 y su inhibidor fisiológico de MDM2-P14/ARF. Nuestros experimentos in vitro con líneas celulares de MPM revelaron que Nutlin-3A, en combinación con cisplatino, producía una inducción de senescencia hasta 9,75 veces mayor (p=0,0050) y una tasa de apoptosis hasta 5 veces mayor (p=0,0067) en comparación con los regímenes de cisplatino y pemetrexed aplicados habitualmente. Así pues, Nutlin-3A, un potente inhibidor de MDM2, se asocia con una inducción significativa de la senescencia y la apoptosis en las líneas celulares de MPM, lo que convierte a Nutlin-3A en una sustancia prometedora para una terapia dirigida en el subgrupo de MPM que muestra sobreexpresión de MDM2.

1. Introducción

El mesotelioma maligno es un tumor muy agresivo que surge de superficies revestidas de mesotelio, principalmente de las cavidades pleurales (mesotelioma pleural maligno, MPM) . Cuando no se trata, la supervivencia media de los pacientes es de nueve meses . Los pacientes con MPM se ven afectados negativamente por las modalidades de tratamiento actuales, en su mayoría insuficientes, que consisten en regímenes que contienen platino y utilizan cisplatino o carboplatino como primera opción. El tratamiento con cisplatino da lugar a una tasa de respuesta de apenas el 14% y una supervivencia media de menos de siete meses. El carboplatino dio lugar a tasas de respuesta similares que oscilan entre el 6 y el 16% . En la práctica clínica, el antifolato pemetrexed, como única terapia aprobada por la FDA para el MPM, se utiliza en combinación con compuestos de platino.

Varios estudios han demostrado la eficacia de la evaluación de la expresión intratumoral de los miembros del metabolismo del ácido fólico para la predicción de la respuesta a la terapia antifolato multiobjetivo en pacientes con diferentes entidades cancerosas, pero se discuten de forma controvertida . Dado que los análogos del platino son compuestos genotóxicos que inducen daños en el ADN que conducen a la detención del ciclo celular y a la apoptosis inducida por el TP53, es básicamente concebible que el mecanismo de reparación del ADN pueda ser una de las claves asociadas a una respuesta terapéutica deteriorada. Dado que la identificación de propiedades moleculares compartidas por los MPM puede ayudar a superar la escasa respuesta al tratamiento observada, varios estudios abordaron esta cuestión . Sin embargo, las razones de la escasa eficacia de los compuestos de platino siguen siendo en gran medida desconocidas.

En resumen, hasta ahora no existen biomarcadores predictivos fiables ni conceptos terapéuticos individualizados para los MPM. Por lo tanto, las directrices actuales hacen hincapié en la necesidad de terapias innovadoras y novedosas.

Dado que las mutaciones del gen TP53 son extremadamente raras en el MPM , otros mecanismos como la deleción del locus o las alteraciones epigenéticas pueden contribuir a la inactivación de TP53. La sobreexpresión de MDM2 en algunos tipos de tumores puede conducir a una pérdida de la función reguladora de TP53 en las células cancerosas por su mayor degradación proteasomal . P14/ARF, el inhibidor fisiológico de MDM2, es reconocido como un supresor de tumores y contribuye a este mecanismo mediante la inducción de la detención del ciclo celular tanto de manera dependiente de TP53 como independiente de TP53. Además, la regulación de los miRNAs parece desempeñar un papel importante. En estudios anteriores, hemos demostrado una fuerte sobreexpresión nuclear de MDM2 en aproximadamente el 25% de los MPM; esta observación se limitó a los MPM epitelioides o a los componentes epitelioides de los MPM bifásicos. Los pacientes con MPM MDM2-positivo mostraron una supervivencia global (SG) y una supervivencia libre de progresión (SLP) significativamente inferiores a las del MPM MDM2-negativo. Esto podría explicarse por una actividad y/o estabilidad de TP53 significativamente disminuida o completamente abolida, mediada por una sobreexpresión de MDM2.

Un restablecimiento de la actividad de TP53, por ejemplo, mediante la inhibición de MDM2, podría dar lugar a una respuesta instantánea al estrés inducido por TP53 y/o al daño del ADN de las células cancerosas. Nutlin-3A (un análogo de la cis-imidazolina) es un inhibidor potente y selectivo de MDM2 con un valor IC50 de 90nM y evita la interacción MDM2-TP53 al unirse al bolsillo hidrofóbico de unión a TP53 de MDM2 .

Por lo tanto, el objetivo de este estudio fue comprobar el efecto de la inhibición de MDM2 en MPM a través de Nutlin-3A en comparación con las estrategias quimioterapéuticas comunes contemporáneas utilizando tres líneas celulares que muestran diferentes perfiles de marcadores relativos al estado de TP53, P14/ARF- y el nivel de expresión de MDM2.

2. Material y Métodos

2.1. Experimentos con líneas celulares

Basado en la revisión de la literatura, se estimaron las concentraciones para los citostáticos (Nutlin-3A , cisplatino y pemetrexed , respectivamente).

Las líneas celulares humanas de MPM se obtuvieron de la American Type Culture Collection en 2012-08 (Manassas, VA, USA). Las líneas celulares se autentificaron y se analizaron para detectar contaminaciones utilizando un servicio comercial (Multiplexion, Heidelberg, Alemania) y se volvieron a analizar por última vez directamente después de finalizar los experimentos.

NCI-H2052, NCI-H2452 y MSTO-211H se cultivaron en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (Invitrogen, CA, EE. UU.) que contenía un 10% de suero bovino fetal (Invitrogen) a 37 °C en una atmósfera humidificada con un 5% de CO2. Las células se cultivaron hasta una confluencia del 85% al 95%, se lavaron con solución salina tamponada con fosfato (Invitrogen) y se tripsinizaron con 1 ml de tripsina al 0,05%-0,53 mM de ácido etilendiaminotetraacético, rojo fenol (Invitrogen). La tripsinización se detuvo añadiendo medio fresco a la reacción. Se transfirieron aproximadamente 10 μl a un hemocitómetro (BRAND, Wertheim, Alemania) para contar las células. Se sembraron 1.000 células por pocillo (100 μl) en microplacas 96/U (Eppendorf, Hamburgo, Alemania) adecuadas para la detección por luminiscencia y fluorescencia. Se dejó que las células se adhirieran durante la noche a 37°C y 5% de CO2. Al día siguiente, se retiró el medio y se aplicó a cada pocillo un medio fresco que contenía uno de los citostáticos o sin aditivo. Se aplicó cisplatino (10μM; TEVA, Petah Tikva, Israel) pemetrexed (200μM; Lilly, IN, EE.UU.) y Nutlin-3A (5, 10 o 20μM; Sigma-Aldrich, MO, EE.UU.) solos o en combinación. Nutlin-3A tuvo que solubilizarse en dimetilsulfóxido (Sigma-Aldrich). Las concentraciones de los citostáticos aplicados se resumen en la Tabla 1. Los cultivos celulares que contenían citostáticos y el medio en blanco se incubaron durante tres días a 37°C y 5% de CO2. A las 72 horas, se evaluaron la necrosis, la apoptosis y la viabilidad celular mediante los siguientes ensayos de luminiscencia: CytoTox-Glo™ Cytotoxicity Assay (Promega), Caspase-Glo® 3/7 Assay (Promega), y CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay (Promega). Los ensayos se realizaron según las recomendaciones del proveedor. Se midieron al menos cuatro puntos de datos por fármaco citostático y ensayo de luminiscencia. La luminiscencia se evaluó utilizando un lector de microplacas de luminiscencia SpectraMax L (Molecular Devices, CA, USA). La luminiscencia (unidades luminiscentes relativas; RLU) se midió a 570 nm y el tiempo de integración se ajustó a 1 segundo. La temperatura del SpectraMax L se mantuvo entre 21,5°C y 24,5°C durante las mediciones. Además, de cada línea celular se preparó un bloque FFPE para el análisis inmunohistoquímico y de qPCR.

2.2. Aislamiento de ARN y qPCR en tiempo real

Los niveles de expresión de ACTB (gen de referencia), MDM2 y P14/ARF, se investigaron mediante TaqMan qPCR en tiempo real en las tres líneas celulares de MPM. Para ello, se aisló el ARN cortando de tres a cinco secciones de 4μm del bloque FFPE con un microtomo (Leica, SM 2000 R, Wetzlar, Alemania). El ARN total se aisló utilizando el kit miRNeasy FFPE (Qiagen, Hilden, Alemania) y el protocolo del fabricante, salvo dos modificaciones (digestión con proteinasa K durante la noche; elución en 25μl). Las concentraciones de ARN se midieron mediante espectrometría UV/VIS (NanoDrop ND-1000, PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemania). El ARN se almacenó a -80°C. Para la síntesis de ADNc, se utilizó el kit de síntesis de ADNc iScript Select y su protocolo (Bio-Rad Laboratories, Inc, CA, EE.UU.) con una entrada de 1μg de ARN total por reacción.

Para la qPCR en tiempo real, se utilizaron los ensayos de expresión génica TaqMan on Demand (AoD) para ACTB (Hs03023943_g1), MDM2 (Hs01066942_m1) y P14/ARF (Hs99999189_m1) (Applied Biosystems®; CA, EE.UU.). Los volúmenes de reacción se modificaron utilizando el 50% de los volúmenes totales de reacción recomendados con 50 ng de ADNc de entrada. Cada diana se midió por triplicado. Los valores Ct de P14/ARF y MDM2 se normalizaron a los valores medios de ACTB. La qPCR en tiempo real y el análisis de datos se realizaron en un LightCycler 480 II de Roche (Roche, Basilea, Suiza) y el software correspondiente. Todos los experimentos de qPCR en tiempo real se realizaron de acuerdo con las directrices MIQE.

2.3. Inmunohistoquímica

La inmunohistoquímica se llevó a cabo de acuerdo con los protocolos estándar utilizando un manchador automatizado (Ventana Discovery XT, Munich, Alemania). Tras la validación en tejidos de referencia (liposarcoma para MDM2, adenocarcinoma pulmonar para TP53), las investigaciones inmunohistoquímicas se realizaron con anticuerpos dirigidos contra MDM2 (clon IF2, Calbiochem, Darmstadt, Alemania, dilución: 1:80) y TP53 (clon BP53-12, Zytomed, Berlín, Alemania; dilución: 1:5000). El pretratamiento para la recuperación de antígenos se realizó calentando en agua desionizada a pH 6 durante 30 minutos. La expresión de la proteína se evaluó utilizando un sistema de puntuación de IHC de cuatro etapas basado en el porcentaje de núcleos de células tumorales con una inmunorreacción positiva (Puntuación 0: sin señal; Puntuación 1 (expresión débil): 1-25%; Puntuación 2 (expresión moderada): 26-50%; Puntuación 3 (expresión fuerte): >50%).

2.4. Análisis estadístico

Los análisis estadísticos y gráficos se realizaron con el entorno de programación estadística R (v3.4.2).

Para el análisis entre grupos individuales, se aplicó la prueba de suma de rangos de Wilcoxon Mann-Whitney (no paramétrica) o la prueba t de los estudiantes de dos caras (paramétrica). Para las variables ordinales con más de dos grupos (diferencias de señal de luminiscencia entre todos los grupos de tratamiento), se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis (no paramétrica) o ANOVA (paramétrica) para detectar las diferencias de grupo.

El nivel de significación estadística se definió como p<0,05.

3. Resultados

Los perfiles de expresión de MDM2, TP53 y P14/ARF difieren entre las líneas celulares investigadas y se resumen en la Tabla 2. Las exploraciones de las tinciones inmunohistoquímicas se muestran en la Figura 1; los resultados de la qPCR se visualizan en la Figura 2. El NCI-H2052 mostró una pronunciada inmunoexpresión de MDM2, pero poca expresión de P14/ARF y TP53. Inmunohistoquímicamente, el MSTO-211H no mostró expresión de MDM2 y P14/ARF, pero sí de TP53. El NCI-H2452 no mostró expresión de MDM2 ni de TP53, pero se detectó la expresión de P14/ARF. Las líneas celulares investigadas representan la constelación molecular de la que se informó en estudios anteriores de pacientes con MPM .

Línea celular MDM2 P53 P14/ARF NCI-H2052 «+» «+» «+/-« MSTO-211H «+/-« «+» «-« NCI-H2452 «-« «-« «+»

-: expresión mínima o nula +: expresión medible +/-: poca expresión medible

Tabla 2

Constelación de marcadores moleculares de las líneas celulares MPM investigadas. Se muestra la inmunoexpresión o la expresión de ARNm de los marcadores investigados para cada línea celular investigada.

(a) NCI-H2052, tinción anti-P53 tinción anti-MDM2
(b) NCI-H2052, tinción anti-MDM2

(c) NCI-H2452, tinción anti-P53

(d) NCI-H2452, tinción anti-MDM2

(e) MSTO-211H, tinción anti-P53

(f) MSTO-211H, tinción anti-MDM2

(a) NCI-H2052, tinción anti-P53(b) NCI-H2052, tinción anti-MDM2
(b) NCI-H2052, tinción anti-MDM2
(c) NCI-H2452, tinción anti-P53
(d) NCI-H2452, tinción anti-MDM2
(e) MSTO-211H, tinción anti-P53
(f) MSTO-211H, tinción anti-MDM2

Figura 1

Tinción inmunohistoquímica de las líneas celulares MPM investigadas con anticuerpos dirigidos contra P53 y MDM2. El NCI-H2052 muestra una fuerte tinción (Puntuación 2) respecto a P53 (a) y MDM2 (b). NCI-H2452 no mostró inmunoexpresión para P53 ((c), Puntuación 0) ni para MDM2 ((d), Puntuación 0). MSTO-211H se tiñó positivamente para P53 ((e), Puntuación 1) y MDM2 ((f), Puntuación 1). Las barras de escala indican 100 μm para las imágenes (a) y (b) y 500 μm para las imágenes (c), (d), (e) y (f).

Figura 2

El gráfico de barras muestra la expresión relativa de ARNm de MDM2, P53 y P14/ARF en las líneas celulares de MPM investigadas. En el eje x se muestran las líneas celulares investigadas y la respectiva expresión de ARNm de P53, MDM2 y P14/ARF. En el eje de abscisas se muestran los valores 2∧ΔCt de la expresión relativa de ARNm de los genes diana investigados tras la normalización frente al gen de referencia ACTB (actina, beta). NCI-H2052 y MSTO-211H muestran una expresión elevada de MDM2, mientras que NCI-H2452 mostró una expresión mínima de MDM2. La expresión del ARNm de TP53 se redujo en el NCI-H2452 en comparación con las otras dos líneas celulares. La expresión de P14/ARF estaba por debajo del límite de detección en los especímenes investigados. Respuesta de las líneas celulares de MPM a pemetrexed, cisplatino y concentraciones variables de Nutlin-3A

Se probó el cisplatino (10μM) y el pemetrexed (200μM) como agente único, así como en combinación, frente a tres concentraciones de Nutlin-3A (5μM, 10μM y 20μM).

3.1.1. Viabilidad celular

NCI-H2052. Cualquier concentración de Nutlin-3A fue superior en la reducción de la viabilidad celular en comparación con cisplatino o pemetrexed o su combinación, respectivamente (p=0,0039). En cambio, el tratamiento con pemetrexed solo mostró una viabilidad celular significativamente elevada. El tratamiento con cisplatino solo mostró una mayor viabilidad celular que cisplatino y pemetrexed en combinación.

MSTO-211H. Pemetrexed combinado con cisplatino se asoció con la mayor viabilidad celular, seguido de cisplatino solo y la menor concentración de Nutlin-3A (p=0,0952). El pemetrexed combinado con cisplatino redujo significativamente la viabilidad celular, pero Nutlin-3A (10μM) mostró una reducción ligeramente mayor. La mayor concentración de Nutlin-3A redujo la viabilidad celular al mínimo.

NCI-H2452. La mayor concentración de Nutlin-3A (20μM) redujo la viabilidad celular al mínimo (p=0,0017). 10μM de Nutlin-3A fue el segundo inhibidor más potente de la viabilidad celular, seguido de cisplatino solo, pemetrexed solo y cisplatino en combinación con pemetrexed. La concentración más baja de Nutlin-3A mostró el impacto más débil en la reducción de la viabilidad celular.

Los gráficos de caja para la viabilidad celular destacan la disminución de la viabilidad celular con el aumento de la concentración de Nutlin-3A en las líneas celulares probadas. Los resultados de todas las líneas celulares con respecto a la senescencia/viabilidad celular se resumen en las Figuras 3(a)-3(c).

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Figura 3

Inducción de la senescencia en líneas celulares de MPM mediante pemetrexed cisplatino y concentraciones variables de Nutlin-3A, así como concentraciones variables de Nutlin-3A combinadas con cisplatino. La Figura 3 muestra los gráficos de caja de la viabilidad/senescencia celular para las tres líneas celulares MPM investigadas. En el eje Y se muestran las RLU (unidades de luminiscencia relativas). Unas RLU altas indican una alta viabilidad celular, mientras que unas RLU bajas indican senescencia. En el eje x se muestran las concentraciones de los citostáticos aplicados y el control. En las tres líneas celulares de MPM, 20μM Nutlin-3A mostró la mayor inhibición de la viabilidad celular en comparación con los otros citostáticos de agente único y las concentraciones aplicadas. Esto es cierto frente a otras concentraciones de Nutlin-3A (NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,007, NCI-H2452: p<0,001), cisplatino (NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,018, NCI-H2452: p=0.004), pemetrexed (NCI-H2052: p=0,032, MSTO-211H: p=0,008, NCI-H2452: p=0,006), y una combinación de ambos (NCI-H2052: p=0,003, MSTO-211H: p=0,002, NCI-H2452: p<0,001). Además, las concentraciones más altas de Nutlin-3A (10μM, 20μM) combinadas con el régimen de cisplatino mostraron la mayor inhibición de la viabilidad celular en comparación con los citostáticos aprobados actualmente, ya sea como agentes únicos (cisplatino: NCI-H2052: p=0,021, MSTO-211H: p=0,022, NCI-H2452: p=0,006; pemetrexed: NCI-H2052: p=0,014, MSTO-211H: p=0,029, NCI-H2452: p<0,001) o en combinación (NCI-H2052: p=0,003, MSTO-211H: p=0,014, NCI-H2452: p<0,001).

3.1.2. Apoptosis

NCI-H2052. En la línea celular NCI-H2052, la mayor tasa de apoptosis se encontró para 20μM de Nutlin-3A, mientras que los otros enfoques de tratamiento mostraron una inducción de apoptosis similar (p=0,14).

MSTO-211H. En MSTO-211H, las mayores tasas de apoptosis se encontraron con pemetrexed, seguido de pemetrexed en combinación con cisplatino y diferentes concentraciones de Nutlin-3A (p=0,0219). Casi no se observó apoptosis para el cisplatino solo y Nutlin-3A.

NCI-H2452. NCI-H2452 reveló la mayor tasa de apoptosis en respuesta a Nutlin-3A en la concentración más alta (20μM), seguido de cisplatino (p=0,0359). Se encontraron tasas de apoptosis significativamente menores para los restantes citostáticos.

Los resultados de la apoptosis se resumen en las figuras 4(a)-4(c).

(a)

(b)

(c)

.
(a)
(b)
(c)

Figura 4

La figura 4 muestra los gráficos de caja para la apoptosis de las líneas celulares MPM investigadas. En el eje Y se muestran las RLU (unidades de luminiscencia relativas). Las RLU y las tasas de apoptosis crecientes muestran una correlación directa. En el eje X se muestran las concentraciones de los citostáticos aplicados y el control. Para las líneas celulares NCI-H2052 y NCI-H2452 (mostradas en las Figuras 4(a) y 4(c), respectivamente), 20μM Nutlin-3A mostró la mayor inducción de apoptosis al comparar los agentes individuales (cisplatino: NCI-H2052: p=0,084, NCI-H2452: p=0,028; pemetrexed: NCI-H2052: p=0,011, NCI-H2452: p=0,049) pero también frente a cisplatino combinado con pemetrexed (NCI-H2052: p=0,015, NCI-H2452: p=0,008). MSTO-211H (mostrado en la Figura 4(b)), la tasa de apoptosis más alta, se encontró para pemetrexed seguido de 5μM, 20μM Nutlin-3A, y la combinación de pemetrexed y cisplatino (todos p<0,001). Al analizar Nutlin-3A en combinación con cisplatino, para la línea celular NCI-H2052, (a) la mayor tasa de apoptosis se encontró para 10μM de Nutlin-3A combinado con cisplatino (todos p<0,001). MSTO-211H (b) las tasas de apoptosis de 10μM Nutlin-3A combinado con cisplatino son comparables al tratamiento con pemetrexed solo (p=0,493) significativamente mejoradas frente a todos los demás enfoques (p=0,016). En el NCI-H2452 (c), el tratamiento con cisplatino combinado con 20μM y 10μM de Nutlin3A mostró la mayor inducción de apoptosis al lado de 20μM de Nutlin-3A solo (p=0,004) pero no muestra diferencias estadísticamente significativas en comparación con el tratamiento con 20μM de Nutlin-3A como agente único (p=0,199).

3.1.3. La necrosis de las células no se vio influida por ninguno de los quimioterapéuticos en comparación con el control (datos no mostrados). Respuesta de las líneas celulares de MPM a concentraciones variables de Nutlin-3A combinadas con cisplatino

En experimentos adicionales, se comprobó la inducción de apoptosis utilizando un régimen de Nutlin-3A o una combinación de Nutlin-3A y cisplatino. Se compararon tres combinaciones de Nutlin-3A (5μM, 10μM y 20μM) más cisplatino (10μM) con cisplatino (10μM) solo, pemetrexed (200μM) solo, Nutlin-3A solo (10μM) y una combinación de cisplatino y pemetrexed.

3.2.1. Viabilidad celular

NCI-H2052. Nutlin-3A sola y su combinación con cisplatino mostraron una inducción de senescencia significativamente mayor en comparación con el otro régimen (p=0,0051). Sólo 5μM Nutlin-3A en combinación con cisplatino mostró menor potencia para inducir índices de senescencia que 5μM Nutlin-3A sin cisplatino. Las concentraciones más altas de Nutlin-3A (10 y 20μM) con cisplatino redujeron la viabilidad celular al mínimo. La mayor viabilidad celular se encontró con pemetrexed, seguido de la combinación de pemetrexed y cisplatino.

MSTO-211H. Cualquier combinación de Nutlin-3A con cisplatino indujo un aumento significativo de la senescencia celular en comparación con cisplatino, pemetrexed o una combinación de ambos (p=0,0059). Sin embargo, la combinación de cisplatino y pemetrexed mostró una eficacia similar en comparación con el régimen más bajo de Nutlin-3A/cisplatino y Nutlin-3A solo. Las concentraciones más altas de Nutlin-3A combinadas con cisplatino redujeron la viabilidad celular al mínimo.

NCI-H2452. Nutlin-3A en combinación con cisplatino o solo fue superior en comparación con los otros citostáticos, excepto en la concentración más baja de 5μM (p=0,0089). Curiosamente, el cisplatino mostró una eficacia comparable a la de 10μM de Nutlin-3A solo y al cisplatino en combinación con 5μM de Nutlin-3A. La mayor viabilidad celular se observó con pemetrexed, cisplatino en combinación con pemetrexed y 5μM Nutlin-3A. La mayor concentración de Nutlin-3A (20μM) con cisplatino mostró la mayor tasa de senescencia.

Los gráficos de caja para la viabilidad celular destacan que la viabilidad celular disminuyó con el aumento de la concentración del régimen de cisplatino/Nutlin-3A en las líneas celulares probadas. Los resultados de la senescencia/viabilidad celular se resumen en las Figuras 3(a)-3(c).

3.2.2. Apoptosis

NCI-H2052. En la línea celular NCI-H2052, las concentraciones más altas de Nutlin-3A combinadas con cisplatino aplicado indujeron un aumento significativo de la apoptosis en comparación con el pemetrexed solo o combinado con cisplatino (p=0,0069). Las mayores tasas de apoptosis se encontraron para 10μM de Nutlin-3A en combinación con cisplatino.

MSTO-211H. La línea celular MSTO-211H mostró la mayor apoptosis cuando se trató con pemetrexed solo (p=0,0035). La segunda tasa de apoptosis más alta se encontró con 10μM de Nutlin-3A combinado con cisplatino. El pemetrexed en combinación con cisplatino dio lugar a la tercera tasa de apoptosis más alta. El cisplatino en combinación con 20μM de Nutlin-3A fue más potente que el cisplatino solo, Nutlin-3A solo y la concentración más baja de Nutlin-3A (5μM) en combinación con cisplatino.

NCI-H2452. Las tasas de apoptosis más elevadas se encontraron para el agente único de Nutlin-3A de 20μM, así como para las concentraciones de Nutlin-3A de 10μM y 20μM en combinación con cisplatino, seguidas de las de cisplatino (p=0,1).

Los resultados relativos a la apoptosis se resumen en las figuras 4(a)-4(c).

3.2.3. Necrosis

La necrosis de las células no se vio influida por ninguno de los quimioterapéuticos en comparación con el control no tratado (datos no mostrados).

Todos los resultados de los experimentos de inhibición de la línea celular se resumen en la Tabla 3.