Líneas de Drosophila
Varias líneas (GMR57C10-Gal4, elav-Gal4, UAS-GCaMP6s, UAS-GCaMP6f, UAS-CD4:tdGFP, y UAS-tdTomato) se obtuvieron del Bloomington Stock Center. MAN-Gal4 (VT50660-AD; VT14014-DBD) y MDN-1-Gal4 (VT44845-DBD; VT50660-AD) fueron proporcionados por B. Dickson (Janelia Research Campus). DNa01-Gal4 (SS00731: GMR22C05-AD; GMR56G08-DBD), DNb06-Gal4 (SS02631: GMR20C04-AD; BJD113E03-DBD), DNg13-Gal4 (SS02538: BJD118A10-AD; BJD123E03-DBD), y DNg16-Gal4 (SS01543: BJD104A07-AD; BJD107F12-DBD) fueron proporcionados por G. Rubin (Janelia Research Campus).
Generación de la construcción Act88F:Rpr y las moscas
Las cepas Actin88F:Rpr (moscas Act88F:Rpr) se generaron utilizando una construcción Actin88F:eGFP29. La línea Act88F:GFP, que alberga un constructo eGFP dirigido por una región de 2053 pb del promotor actin88F, se obtuvo de R. Benton (Universidad de Lausana). Se generó una construcción Act88F:Rpr utilizando primero el siguiente par de cebadores, para añadir un sitio de restricción KpnI al extremo 5′ de un clon de ADNc de rpr (IP02530, Drosophila Genomics Resource Center, Bloomington, IN) y un sitio XbaI al extremo 3′ del marco de lectura abierto, mediante un kit de mutagénesis dirigida al sitio QuikChange (Agilent Technologies):
Primer delantero 5′ AGACGGTACCATGCAGTGGCATTC 3′
Primer inverso 5′ GCCGCGTCTAGATCATTGCGATGCTT 3′
El constructo Rpr se empalmó en el constructo Act88F:eGFP detrás del promotor Act88F en lugar de la secuencia eGFP. El constructo Act88F:Rpr se inyectó en embriones de Drosophila attp18 para la transgénesis específica mediada por la integrasa PhiC3135 (citolocalización del sitio de aterrizaje del transgén 6C12) por BestGene Inc. (Chino Hills, CA). Para algunos experimentos, este transgén se combinó con UAS-GCaMP6s-p2A-tdTomato (generado en el laboratorio de M.H.D.).
Se realizaron imágenes de fluorescencia de los músculos de vuelo indirecto
Se realizó una microscopía de fluorescencia de los hemitórax36,37. Brevemente, las moscas fueron anestesiadas y se les retiró la cabeza y el abdomen. Los torácicos se fijaron durante la noche en paraformaldehído al 4% a 4 °C y se enjuagaron en solución salina tamponada con fosfato 1× (PBS) al día siguiente. Los especímenes se colocaron en un portaobjetos de vidrio, se congelaron en nitrógeno líquido y se dividieron en dos por el plano medio sagital con una cuchilla de afeitar. Las MFI se tiñeron con Alexa-Fluor 568 Phalloidin (1:100 en PBS con 0,1% de Triton-X (PBST)) durante la noche a 4 °C, se enjuagaron con PBS y se visualizaron utilizando el sistema EVOS® FL Cell Imaging System (Life Technologies) con un aumento de 4. Para la obtención de imágenes de las miofibrillas de la MFI, se prepararon las moscas y se bisecaron los tórax como se ha descrito anteriormente. Los toracos se tiñeron con Alexa-Fluor 568 Phalloidin (1:100 en PBST) durante la noche a 4 °C. Las muestras se enjuagaron en PBS, se montaron con Vectashield (Vector Laboratories) y se visualizaron con un microscopio confocal Leica TCS SPE RGBV (Leica Microsystems) a 100 aumentos.
Imagen de inmunofluorescencia de cerebros y cordones nerviosos ventrales
Los cerebros y los cordones nerviosos ventrales se diseccionaron de moscas hembra de 2-3 dpe en PBS. A continuación, los tejidos se fijaron durante 20 minutos en paraformaldehído al 4% en PBS a temperatura ambiente. Después de la fijación, los cerebros y VNCs se lavaron 2-3 veces en PBS con 1% de Triton-X-100 (PBST) durante 10 min cada uno y luego se incubaron a 4 °C durante la noche en PBST. A continuación, las muestras se colocaron en PBST con suero normal de cabra al 5% (PBSTS) durante 20 minutos a temperatura ambiente. A continuación se incubaron con anticuerpos primarios (conejo anti-GFP a 1:500, Thermofisher RRID: AB_2536526; ratón anti-Bruchpilot/nc82 a 1:20, Developmental Studies Hybridoma Bank RRID: AB_2314866) diluidos en PBSTS durante 48 h a 4 °C. Los cerebros y las CNV se lavaron 2-3 veces en PBST durante 10 minutos cada una antes de la incubación con anticuerpos secundarios (anticuerpo secundario de cabra anti-conejo conjugado con Alexa 488 a 1:500; Thermofisher; anticuerpo secundario de cabra anti-ratón conjugado con Alexa 633 a 1:500; Thermofisher) diluidos en PBSTS durante 48 h a 4 °C. Por último, los cerebros y los VNC se lavaron 2-3 veces durante 10 minutos cada uno en PBST y se montaron en portaobjetos con cubreobjetos de puente en medio de montaje Slowfade (Thermofisher).
Las muestras se fotografiaron utilizando un microscopio confocal de barrido láser Carl Zeiss LSM 700 con los siguientes ajustes: Aumento de ×20, rango dinámico de 8 bits, promedio de imágenes de 2×, tamaño de píxel de 0,52 × 0,52 μm, intervalo de paso z de 0,57 μm. La desviación estándar de las proyecciones z de los volúmenes de imágenes se realizó con Fiji38. Para comparar la expresión de GFP en el sistema nervioso central, la intensidad del láser y las ganancias de PMT para el canal verde se mantuvieron constantes en las muestras de tipo salvaje, A1 > GFP y Act88F:GFP.
Imagen de la expresión de GFP en los músculos de las piernas
Las piernas se diseccionaron manualmente en la articulación cuerpo-coxa y se montaron en portaobjetos de vidrio utilizando cinta de doble cara. A continuación, se añadió medio de montaje Slowfade (Thermofisher) al espacio entre el cubreobjetos y el portaobjetos. A continuación se registró la fluorescencia de la GFP en el canal verde utilizando un microscopio confocal de barrido láser LSM 700 (Zeiss). La intensidad del láser, las ganancias del PMT y los parámetros de escaneo se mantuvieron constantes en los animales de tipo salvaje, MHC > GFP y Act88F:GFP: Aumento de ×20, rango dinámico de 8 bits, promedio de imágenes de ×8, tamaño de píxel de 0,63 × 0,63 µm e intervalo de paso z de 10 µm. También se registró la autofluorescencia cuticular en el canal rojo.
Disección torácica para la obtención de imágenes VNC
Los soportes personalizados utilizados para montar las moscas durante la obtención de imágenes se fabricaron como se ha descrito anteriormente39. Para la obtención de imágenes VNC, estas etapas se modificaron para que tuvieran (i) calzas de acero planas en lugar de dobladas, y (ii) vértices biselados para que la cinta esférica fuera visible para los sensores de flujo óptico (Shapeways, ‘file’). Las calas de acero se fabricaron con acero inoxidable de 0,001″, tipo 316 recocido blando (McMaster-Carr, pieza nº 2317K11). Las calas fueron grabadas (Etchit, Buffalo, MN) para generar agujeros rectangulares como se explica ‘aquí’. El archivo de diseño de las cuñas puede encontrarse «aquí».
Todos los experimentos se realizaron con moscas hembra de 1-3 dpe criadas a 25 °C con comida estándar de harina de maíz en un ciclo de 12 h de luz:12 h de oscuridad. Las moscas fueron anestesiadas a 4 °C. Se seleccionó una mosca hembra y, en algunos casos, se le cortaron las alas para simplificar el proceso de montaje. A continuación, se introdujo el tórax dorsal de la mosca a través de un orificio en la cuña de acero de la platina para la obtención de imágenes. A continuación se dio la vuelta a la platina, se aplicó cuidadosamente pegamento de curado UV (Bondic, Aurora, ON Canadá) alrededor del perímetro del tórax y se curó con iluminación UV (LED-200, Electro-Lite Co. Bethel, CT USA). A continuación se utilizó pegamento UV para fijar la cabeza y el abdomen a la parte inferior de la platina. A continuación se llenó la platina con solución salina extracelular18. Bajo un microscopio de disección de gran aumento (Leica M165C), se utilizó una aguja hipodérmica (30 G, BD PrecisionGlide, Franklin Lakes, NJ USA) para cortar y levantar la cutícula del tórax dorsal40, teniendo cuidado de no cortar el conectivo del cuello. Posteriormente, en los animales sin Act88F:Rpr, se utilizó un par de pinzas sin filo para retirar los MFI, predominantemente de la región anterior-medial del tórax que cubre el intestino (este paso es innecesario en los animales con Act88F:Rpr). Este proceso expone la superficie dorsal del proventrículo, una gran estructura intestinal bulbosa. Con mucho cuidado, se utilizó un par de pinzas superfinas para agarrar y levantar el proventrículo y desplazar gran parte del intestino (incluyendo el buche y las glándulas salivales) del tejido nervioso situado más ventralmente. Con el intestino así elevado, se utilizaron unas tijeras ultrafinas (Fine Science Tools, Foster City, CA USA) para seccionarlo en su sección más anterior. A continuación, se peló el proventrículo y se realizó una incisión posterior para eliminar completamente estas partes del intestino, dejando al descubierto el tejido nervioso subyacente. Cabe destacar que esta disección también elimina la aorta, restringiendo el flujo de hemolinfa desde el vaso dorsal abdominal. No obstante, comprobamos que las moscas eran viables y se comportaban hasta 4 h. En algunos casos, observamos que el tejido intestinal o muscular empezaba a oscurecer el VNC durante la obtención de imágenes. Por lo tanto, el tejido suelto debe eliminarse en esta fase, teniendo mucho cuidado de no cortar el CNV. Después de cada disección, examinamos hasta qué punto el animal movía sus patas en respuesta a un soplo de aire o agarraba un objeto con cada una de sus patas. Esto demostró ser un indicador preciso del éxito de la preparación. Para evaluar la calidad de una disección, se examinaron los movimientos de cada pata en la cinta esférica. Si una mosca podía caminar de forma coordinada, la disección se consideraba exitosa. En caso contrario, el animal se clasificaba como con una deficiencia en el movimiento de las patas. Los animales con múltiples patas disfuncionales se clasificaron como incapacitados.
Microscopía de 2 fotones durante el comportamiento
Los experimentos se llevaron a cabo en el tiempo de Zeitgeber (Z.T.) de la tarde y los animales fueron típicamente fotografiados 30-60 min después de la disección. Los soportes de las moscas se fijaron a una plataforma elevada sobre la cinta de correr esférica (Fig. Suplementaria 3a). El VNC se localizó entonces utilizando los oculares del microscopio y se posicionó en el centro del campo de visión mediante imágenes de 2 fotones.
La cinta de correr esférica es una varilla de aluminio con un agujero en forma de bola fresado en un extremo22. Fabricamos bolas de espuma de 10 mm de diámetro (Last-A-Foam FR-7106, General Plastics, Burlington Way, WA EE.UU.) y las manchamos manualmente con un bolígrafo Rapidograph (Koh-I-Noor, Leeds, MA EE.UU.) para obtener características de alto contraste para las mediciones del flujo óptico. Se hizo pasar una corriente de 500-600 mL min-1 de aire filtrado y humidificado a través del soporte utilizando un controlador de flujo digital (Sierra Instruments, Monterey, CA USA). Los movimientos de la bola se midieron utilizando dos sensores ópticos de flujo (ADNS3080) equipados con lentes de zoom (Computar MLM3X-MP, Cary, NC USA). El balón y la mosca se iluminaron con un par de LEDs IR (850 nm de longitud de onda máxima) acoplados a fibras ópticas y lentes colimadoras (ThorLabs, Newton, NJ USA). Las mediciones del flujo óptico se pasaron a una placa de microcontrolador (Arduino Mega2560) para su registro mediante un código Python personalizado. Simultáneamente, se realizaron grabaciones de vídeo del comportamiento de los animales sobre el balón utilizando una cámara firewire sensible a los infrarrojos (Basler, Ahrensburg, Alemania) a aproximadamente 30 fps.
Realizamos microscopía de 2 fotones utilizando un microscopio Bergamo II (ThorLabs) equipado con dos detectores PMT de GaAsP para imágenes de GCaMP6 y tdTomato y acoplado a un láser de Ti:Sapphire (MaiTai DeepSee, Newport Spectra-Physics, Santa Clara, CA USA) sintonizado a 930 nm. Se utilizó un objetivo Olympus de 20× con inmersión en agua y 1,0 NA (Olympus, Center Valley, PA USA). El microscopio se controló con el software ThorImage (ThorLabs). Los experimentos de obtención de imágenes de la sección coronal se realizaron en el modo de obtención de imágenes Galvo-Galvo a 6-9 Hz. Esta frecuencia de cuadro varió con el tamaño de la imagen, que osciló entre 26,58 × 26,58 µm y 53,15 × 53,15 µm. La potencia del láser osciló entre 3 mW y 5,7 mW. La obtención de imágenes volumétricas también es posible con el hardware adecuado (por ejemplo, un escáner de galvo-resonancia y un collar de objetivos piezoeléctricos).
Ocasionalmente, se utilizó una bocanada de aire para provocar comportamientos de marcha. Estas bocanadas se codificaron digitalmente (Honeywell AWM 3300 V, Morris Plains, NJ USA). Se utilizó un software ROS personalizado interconectado a través de un dispositivo de salida analógico (Phidgets, Calgary, Canadá) con el software ThorSync (ThorLabs) para sincronizar las mediciones del flujo óptico, la videografía del comportamiento, las mediciones de las bocanadas de aire y la adquisición de imágenes de 2 fotones. Para la obtención de imágenes de la sección coronal, se utilizó un collar piezoeléctrico (Physik Instrumente, Karlsruhe, Alemania) para controlar los movimientos rápidos del eje z de la lente del objetivo del microscopio.
Para comparar la actividad neural entre los animales de control y los de Act88F:Rpr, adquirimos imágenes de 512 × 512 píxeles a 1,7 fps utilizando una intensidad de láser y una ganancia de PMT constantes. Las regiones seleccionadas para la obtención de imágenes se eligieron empíricamente como secciones horizontales consistentes en puntos de referencia observados a una profundidad de ~61-65 µm en la Película Suplementaria 1.
Comparación de la marcha con o sin disección
Para evaluar los efectos de la disección en la locomoción, los animales de tipo salvaje fueron sometidos al siguiente procedimiento. Los animales se montaron en etapas de imagen y se añadió solución salina a cada etapa. Sólo se diseccionó un subconjunto aleatorio de animales. Cada mosca montada se colocó en el tapiz rodante esférico y se registraron sus comportamientos de marcha durante 30 minutos. El flujo óptico se registró como se ha descrito anteriormente. Para aumentar la probabilidad de locomoción, se dirigió un pulso de 500 ms de CO2 al 100% a las antenas de la mosca con un intervalo de un minuto entre los pulsos (0,05 ln min-1 utilizando un controlador de flujo másico; Vögtlin Instruments, Suiza).
Estimulación antenal con láser infrarrojo
Para comparar los comportamientos de marcha entre Act88F:Rpr y los animales de control, estimulamos sus antenas con un láser infrarrojo cercano de 830 nm (Schäfter + Kirchhoff, Alemania). Primero anestesiamos a las hembras de 7-8 dpe a 4 °C y las montamos en platós de imagen. A continuación se aclimataron las moscas durante 10 minutos. Para cada experimento, un animal recibió diez pulsos de estimulación láser de 2 s (18,1 mW) en su antena derecha con un intervalo de 60 s entre pulsos. Los animales de control y Act88F:Rpr se probaron en alternancia para minimizar los efectos del tiempo circadiano en las comparaciones conductuales.
Estadística
El tamaño de las muestras para los experimentos con animales se eligió de la siguiente manera: realizamos al menos tres experimentos para ilustrar los registros neuronales poblacionales y dispersos y realizamos más de diez experimentos por grupo al realizar comparaciones estadísticas. Un criterio preestablecido de señales de fluorescencia de baja relación señal-ruido dio lugar a la eliminación de dos experimentos MDN de nuestro conjunto de datos. No se utilizó la aleatorización ni el cegamiento. En el caso de la estimulación láser antenal, los datos no tenían una distribución normal, por lo que se realizaron las pruebas U de Friedman y Mann-Whitney. Las estimaciones de la variación se presentan como media e intervalos de confianza del 95 % con bootstrap.
Análisis de datos
Analizamos todos los datos utilizando scripts personalizados de Python. Debido a que la frecuencia de adquisición de datos difería para el flujo óptico, la videografía del comportamiento y las imágenes de 2 fotones, interpolamos las señales para que coincidieran con las de mayor frecuencia. Posteriormente, los datos de flujo óptico se suavizaron utilizando un promedio de funcionamiento (ventana = 200 ms) y luego se tradujeron en rotaciones s-1 para los ejes anterior-posterior, medial-lateral y de guiñada22. Para que estas mediciones sean más intuitivas, las rotaciones s-1 se convirtieron en mm s-1 (1 rot s-1 = 31,42 mm s-1) para los movimientos anteroposterior (vforward) y medial-lateral (vside) y en grados s-1 (1 rot s-1 = 360° s-1) para los movimientos de guiñada (vrotation)22.
El análisis de la locomoción en los animales disecados (Supplementary Fig. 2) se realizó de la siguiente manera. Los datos de flujo óptico hacia adelante de 20 moscas disecadas y 20 no disecadas se redujeron a 1500 puntos s-1 y se suavizaron utilizando un promedio de duración de 0,2 s. Para calcular el porcentaje de tiempo caminando hacia adelante/hacia atrás, o caminando de lado, se definieron empíricamente dos umbrales, -0,31 mm s-1 y +0,31 mm s-1, para diferenciar entre estar quieto y caminar hacia adelante (hacia la derecha) o hacia atrás (hacia la izquierda), respectivamente. Los valores superiores a 0,31 mm s-1 se consideraron momentos de marcha hacia delante (hacia la derecha) y los valores inferiores a -0,31 mm s-1 se consideraron momentos de marcha hacia atrás (hacia la izquierda). Los valores de flujo óptico situados entre estos umbrales se consideraron momentos de parada. El porcentaje de tiempo caminando se calculó como la proporción de puntos de datos en los que un animal no se consideraba parado. Del mismo modo, se utilizaron umbrales de 10,8 y -10,8 grados s-1 para definir los momentos de giro. Se definió un episodio como un periodo continuo de caminar o girar.
Pueden producirse grandes deformaciones del tejido durante el comportamiento. Por lo tanto, realizamos un registro de imágenes pan-neuronales post-hoc (Fig. 2). Registramos todos los fotogramas de un experimento de imagen a una imagen de referencia. Debido a que la complejidad de las deformaciones no puede ser capturada utilizando modelos de movimiento paramétricos simples (por ejemplo, transformaciones afines), utilizamos un enfoque variacional no paramétrico, diseñado para modelar deformaciones arbitrariamente complejas. Calculamos el campo de movimiento w entre la imagen de referencia, denominada Ir, y la imagen en el momento t, denominada It, resolviendo el problema de minimización
donde D(w) es un término de ajuste de datos, el segundo término es una regularización que promueve la suavidad de w penalizando su gradiente ∇w41, Ω es el dominio discreto de la imagen, y el parámetro λ equilibra las contribuciones de los dos términos.
Las imágenes de GCaMP6s presentan un reto para la estimación del movimiento porque la actividad neuronal produce grandes cambios locales de intensidad. Por lo tanto, utilizamos un fluoróforo adicional independiente de la actividad, tdTomato, y definimos un término de datos de la forma
El primer término modela la suposición estándar de conservación de la intensidad a lo largo de la trayectoria de cada píxel. Se define por
donde utilizamos una norma \(\ell _1\) para ganar robustez parcial a los cambios de intensidad42. El segundo término de la ecuación (2) es una restricción de coincidencia de características inspirada por Revaud y colaboradores43, escrita como
En las Ecs. (2)-(4), Ir e It son del canal tdTomato. La minimización de la función ϕ favorece que los vectores de movimiento w(x) se acerquen a las correspondencias de características m(x, Ir, It), calculadas sobre un conjunto disperso de puntos clave relevantes. Obtenemos m con el algoritmo de correspondencia de características propuesto por Revaud y colaboradores43, que está específicamente diseñado para manejar grandes deformaciones de la imagen. Calculamos m utilizando el canal de imagen tdTomato, de manera que las correspondencias también son insensibles a los cambios de intensidad entre Ir e It. Como resultado, la estimación se guía por correspondencias de características fiables. El parámetro γ equilibra los dos términos de la Ec. (2).
Para cada experimento, optimizamos los valores de λ y γ utilizando una búsqueda en cuadrícula para registrar imágenes de sección horizontal del VNC (Fig. Suplementaria 4). Como función objetivo para la optimización, utilizamos el gradiente de la imagen media temporal44. Los valores pequeños de λ (es decir, λ < 1000), ocasionalmente condujeron a artefactos en las imágenes registradas. Estos artefactos estaban asociados a una fuerte convergencia en el campo vectorial w(x) (Fig. Suplementaria 4c). Por lo tanto, definimos empíricamente los artefactos como agrupaciones de píxeles con \ {\mathrm{div}},{\mathbf{w}}left( {\mathbf{x} \right) < – 1,2\) y cardinalidad >20 (obtuvimos resultados similares con cardinalidad >5). Por último, seleccionamos los valores λ y γ como los que no presentan artefactos y el mayor gradiente de la imagen media. Las imágenes no registradas, los campos de vectores de transformación y las imágenes registradas de los tres ejemplos optimizados se muestran en la Película Suplementaria 5.
Resolvimos el problema de optimización de la Ec. (1) con un algoritmo de método de dirección alternada del multiplicador (ADMM)45. Introducimos dos variables de división, asociadas a los términos de regularización y de coincidencia de características, respectivamente. Cada subproblema del algoritmo se resolvió analíticamente. Utilizamos partes de la biblioteca de problemas inversos descrita en la ref. 46. Se aplicó un posprocesamiento basado en el filtrado de la mediana ponderada utilizando el método de47.
En la Fig. 2, los comportamientos fueron anotados semiautomáticamente, utilizando un módulo personalizado de Python. Este módulo permite al usuario seleccionar dos regiones de interés (ROI) en el primer fotograma del vídeo. La primera ROI se utiliza para detectar la marcha y debe situarse sobre las patas metatorácicas y mesotorácicas. El segundo ROI se encarga de detectar el acicalamiento de las patas protorácicas y debe situarse delante de la mosca. Para detectar el movimiento en esas regiones, se restan los fotogramas consecutivos. Las imágenes diferenciales resultantes se difuminan con la mediana (radio = 5 píxeles) para reducir el ruido. Sobre la base de esta imagen borrosa, se aplica un umbral sobre el número de píxeles no ceros en cada una de las dos ROI para extraer secuencias binarias de aseo y caminata. Obsérvese que se ignoran los movimientos de las patas protorácicas observados durante el paseo (es decir, la clasificación del acicalamiento está supeditada a la clasificación del paseo). A continuación, se aplicó un filtro de histéresis para filtrar las secuencias binarias de comportamiento y eliminar las transiciones que se producen en muy pocos fotogramas para ser biológicamente plausibles. Ejemplos de ROIs y anotaciones de comportamiento se ilustran en la Película Suplementaria 6. Estos datos de comportamiento se utilizaron en la Fig. 2 como se muestra en la Película Suplementaria 2. Se anotó utilizando los siguientes parámetros: umbral para caminar = 400, umbral para el aseo = 5, longitud de histéresis para caminar = 8, longitud de histéresis para el aseo = 10.
Para la Fig. 2b, c, se utilizó la regresión lineal para encontrar regiones en el VNC asociados con cualquiera de caminar o aseo. Los regresores Xw y Xg (para caminar y acicalarse, respectivamente) se construyeron a partir de las dos secuencias de comportamiento, Sw y Sg, utilizando la Ecuación (5) mediante la convolución con una respuesta al impulso de la señal de calcio que decae exponencialmente (CIR) derivada de la constante de tiempo medida para GCaMP6s (t½ = 1,1448 s)19.
Las funciones objetivo fueron trazos ∆F/F de píxel a píxel, donde ∆F = Ft – F. Ft es la fluorescencia en el momento, t. F es una señal de fluorescencia de línea de base medida como el valor promedio de píxel para las primeras diez imágenes secuenciales de GCaMP6s en las que no se observó actividad celular (es decir, fluorescencia GCaMP6s mínima e invariable).
Los pesos del regresor se calcularon utilizando la Ec. (6).
donde y es la traza ∆F/F a nivel de píxel.
La figura 2b, c muestra mapas de calor de los pesos del regresor, ww para caminar y wg para acicalarse, normalizados a sus respectivos máximos. El ROI 1 fue elegido como una región del mapa de calor con un alto peso para el acicalamiento pero un bajo peso para el caminar. El ROI 2 se eligió como la ubicación espacial con el valor más alto de ww. Cada ROI abarca una región con un radio de 15 píxeles.
Para identificar los datos de imágenes neuronales escasas del proceso (Figs. 3-5), primero se seleccionaron los ROIs utilizando scripts personalizados de Python que dependían de las bibliotecas OpenCV y Numpy. Para ello, se seleccionó un marco de referencia para el que el software identificó todos los ROI potenciales. Para ello, se suavizó la imagen de GCaMP6s para reducir el ruido de fondo y luego se aplicó a la imagen un umbral de filtro Otsu. A continuación se aplicó un factor de erosión a todos los objetos detectados en la imagen. A continuación, se presentaron al usuario los contornos de todos los objetos detectados para su selección manual. Una vez seleccionados estos ROI de referencia para las neuronas izquierda y derecha, utilizamos un algoritmo de registro de imágenes basado en la correlación cruzada48 para identificar los ROI izquierdos y derechos más probables para cada fotograma de la imagen basándonos en los seleccionados manualmente en el fotograma de referencia. Se utilizó una segunda secuencia de comandos para verificar manualmente las ROI seleccionadas automáticamente y, si eran incorrectas, para mostrar todas las ROI potenciales dentro del fotograma para su selección manual. Si los valores de erosión daban lugar a ROIs mal formados, se utilizaba otro script para posicionar manualmente ROIs elípticos de orientación arbitraria en cualquier fotograma. Por último, las imágenes binarias de ROI se utilizaron como máscara de imagen para extraer las señales medias de fluorescencia de las imágenes originales de GCaMP6s o tdTomato. Estas señales fueron reportadas como %∆R/R como en la ref. 49 para reducir los efectos del movimiento en nuestras mediciones. Debido a la ausencia de estímulos, la línea de base R se calculó como la relación mínima de GCaMP6s/tdTomato dentro de un bin de 2,5 s.
Para detectar aumentos transitorios de la actividad, desarrollamos un algoritmo basado en parte en la ref. 50. Primero determinamos cuándo la primera derivada de la señal %∆R/R cruzaba un umbral, que se determinó examinando todos los valores de la derivada para una clase de neurona dada (MDN, MAN o A1). Razonamos que los valores del umbral deberían ser característicos y potencialmente diferentes para cada tipo de neurona porque la dinámica de la fluorescencia está relacionada con propiedades fisiológicas intrínsecas que pueden diferir entre las clases de neuronas pero no entre los experimentos para una sola clase. Establecimos este umbral como el percentil 97,5 para las MDN y las dMAN y el percentil 90 para las neuronas A1. Se seleccionó un valor de umbral más bajo para las neuronas A1 porque se observaron muchos más transitorios de fluorescencia en las trazas A1. Estos transitorios se habrían pasado por alto utilizando un umbral del percentil 97,5. Para identificar el inicio de los aumentos de fluorescencia, encontramos el punto de tiempo precedente más cercano en el que la derivada cruzaba el cero. Este cruce de cero se considera el punto de tiempo de un «evento» asociado con el aumento de fluorescencia identificado. Los eventos detectados cerca unos de otros sin cruce de la derivada en cero se comprimieron en un evento asociado con el primer punto de tiempo. Se realizaron unos 10 experimentos distintos por animal. No se consideraron los eventos en los primeros y últimos 10 s de cada experimento, ya que la ventana de presentación de datos abarcaba 10 s antes y 10 s después de cada evento.
Debido a que las actividades de MDN y dMAN izquierda y derecha covariaban fuertemente (Fig. 5 suplementaria), se realizó un paso adicional para la detección de eventos: si se detectaban eventos en las neuronas izquierda y derecha con 2 s de diferencia, se retenían ambos eventos; de lo contrario, un evento identificado para la neurona A (p. ej, MDN izquierda) y no para la neurona B (por ejemplo, MDN derecha) también se añadió a la biblioteca de eventos de la neurona B.
Por el contrario, las actividades de la izquierda y la derecha de A1 no covariaron fuertemente. Por lo tanto, los eventos se asociaron con una y no con la otra neurona. Para ello, si se detectaba un evento tanto para las neuronas A1 izquierdas como para las derechas dentro de una ventana de tiempo de 0,25 s, no se utilizaba ninguno de los eventos para el análisis.
Las trazas de %∆R/R y de flujo óptico vinculadas a cada evento se alinearon estableciendo los puntos de tiempo de los eventos en 0 s. A continuación, se calculó la media y los intervalos de confianza del 95 % bootstrapados para estas trazas alineadas utilizando la biblioteca Seaborn de Python. Las mediciones de flujo óptico y %∆R/R se redujeron a 500 valores s-1 para este análisis. Para aumentar la claridad, las trazas de %∆R/R se sustrajeron a la línea base para hacerlas cero en el momento del evento en los paneles de resumen (Figs. 3d, 4d y 5d, e). Los datos de control barajados (trazos grises) se calcularon asignando puntos de tiempo aleatorios en lugar de los eventos reales identificados. Estos puntos de tiempo aleatorios se trataron como eventos reales y su media e intervalos de confianza del 95 % con bootstrap se calcularon y trazaron para su comparación.
El análisis de la covarianza (Fig. 5 suplementaria) se realizó utilizando un script de Python personalizado que dependía de las bibliotecas Matplotlib y Numpy. Se calcularon gráficos de dispersión para comparar los valores %∆R/R de la neurona izquierda y derecha de todos los experimentos para cada mosca por separado. Los valores de r de Pearson se presentan como media ± desviación estándar.
Los comportamientos relacionados con los eventos (películas suplementarias 8, 10, 12 y 13) se seleccionaron manualmente a partir de los eventos detectados automáticamente como se ha descrito anteriormente. Para los dMANs, los eventos se seleccionaron entre los que maximizaron la diferencia en las rotaciones anterior-posterior de la bola entre 1 s antes y 2 s después del evento. Para las MDN, los eventos se seleccionaron entre los que minimizaban las rotaciones anterior-posterior de la bola hasta 2 s después del evento. Para las neuronas A1, los eventos se seleccionaron entre los que maximizaban las rotaciones medias de la bola de guiñada (positivas para los ejemplos de neuronas A1 izquierdas y negativas para los ejemplos de neuronas A1 derechas) hasta 2 s después de los eventos.
En la Fig. Suplementaria 8, las respuestas a la estimulación láser de infrarrojo cercano se promediaron en 10 ensayos para cada animal. El flujo óptico se redujo a 500 valores s-1. La media y los intervalos de confianza del 95% de los trazos de flujo óptico se midieron y trazaron utilizando la biblioteca Python Seaborn. La biblioteca Python Scipy se utilizó para realizar las pruebas U de Friedman y Mann-Whitney.