Evidencia de la selección positiva que actúa en el locus del gen del receptor humano de la dopamina D4

Resultados y discusión

Se eligieron conjuntos de primers para amplificar los cuatro exones del gen DRD4 altamente rico en GC (1), así como la región promotora adyacente y las uniones de empalme (Fig. 1). La resecuenciación inicial de todo el promotor y de la región codificante del gen DRD4 de 20 probandos con TDAH (datos no mostrados) descubrió una serie de polimorfismos de los que se había informado anteriormente. Estos polimorfismos incluían dos polimorfismos de inserción/deleción, uno en la región del promotor (4,3 kb aguas arriba del VNTR; refs. 18 y 19) y otro en el exón 1 (2,7 kb aguas arriba del VNTR; ref. 20; véase la Fig. 1). Además, se descubrió una serie de nuevos SNPs codificantes en el exón 3 del VNTR (2), así como dos SNPs no reportados previamente en el intrón 3, separados por 20 nt y ≈350 bp aguas abajo del centro del VNTR (Fig. 1). Dado el alto nivel de polimorfismo VNTR identificado en esta muestra inicial, se llevó a cabo una resecuenciación por PCR más extensa de 600 alelos VNTR del exón 3, obtenidos de una muestra de población mundial (refs. 3 y 17; Tabla 1; Fig. 2). Esta muestra contenía individuos que representaban la mayoría de los principales orígenes geográficos (ver Métodos). La mayoría de los individuos eran heterocigotos, y los dos productos alélicos de la PCR pudieron ser separados por electroforesis en gel antes de la secuenciación, proporcionando haplotipos inequívocos. En total, analizamos más de 450.000 pb de ADN genómico y 2.968 repeticiones de 48 pb.

En los 600 cromosomas secuenciados, se encontraron 56 haplotipos diferentes (Tabla 1). Estos haplotipos estaban compuestos por 35 motivos variantes distintos de 48 pb (Fig. 2), 19 de los cuales fueron reportados previamente (designados α-ξ en la Fig. 2; ref. 2). Proponemos que a estos motivos variantes de 48 pb de DRD4 se les den números como se muestra en lugar de las letras utilizadas anteriormente (2), porque no hay suficientes caracteres en el alfabeto griego. Proponemos que las variantes del exón 3 de DRD4 se designen en el formato mostrado, es decir, que el alelo 4R más común se designe como 4R(1-2-3-4), etc.

Intencionadamente sobremuestreamos los alelos no 4R aproximadamente 2 veces, porque se descubrió poca variación de la secuencia en el alelo 4R común (Tabla 1) aunque representa el 65% de la frecuencia de la población mundial (3, 17). La mayoría de los haplotipos de esta muestra (85,7%) se encontraron con frecuencias inferiores al 1% (Tabla 1). Si se observa la diversidad de nucleótidos entre las variantes definidas por su número VNTR, los alelos comunes 2R, 4R y 7R presentan la menor diversidad, con un 78,2, 95,2 y 88,9% de los alelos respectivamente representados por los haplotipos más comunes 2R(1-4), 4R(1-2-3-4) y 7R(1-2-6-5-2-5-4) (Tabla 1). En cambio, aunque los alelos 3R, 5R, 6R y 8R son más raros, tienen proporcionalmente más variantes (Tabla 1). Este patrón inusual de diversidad alélica no es claramente un simple efecto de longitud, es decir, los alelos más largos tienen mayor diversidad. Se observaron muchos haplotipos raros específicos de la población. Los ejemplos incluyen el haplotipo 2R(30-4) encontrado sólo en la muestra Surui (América del Sur) y el haplotipo 5R(1-3-2-3-4) encontrado sólo en la muestra de China Han (Asia) (Tabla 1 y Fig. 2).

El patrón de variación de nucleótidos observado en los haplotipos VNTR no es aleatorio (Fig. 2). La mayoría de las variantes de la secuencia de ADN cambian la secuencia de aminoácidos, a veces de forma bastante dramática (por ejemplo, de Gln a Pro; Fig. 2). Aunque muchas de estas variantes son eventos mutacionales relacionados (más adelante), se pueden tener en cuenta estas relaciones al calcular Ka/Ks (la relación del número de sustituciones de aminoácidos por sitio dividida por la estimación del número de cambios sinónimos). Los valores de Ka/Ks superiores a 1 suelen considerarse un indicador estricto de selección positiva en el segmento de ADN observado (22, 23). Para una secuencia de repetición en tándem, se pueden inferir muchas relaciones asumidas y, por lo tanto, se pueden calcular diferentes ratios Ka/Ks. Sin embargo, para todas las relaciones asumidas de las variantes de DRD4, Ka/Ks > 1. Por ejemplo, asumiendo que los motivos más abundantes de 1-6 variantes (Fig. 2) tienen todos un origen común y que la diversidad fue generada tanto por mutación como por recombinación (abajo), se obtiene un valor de Ka/Ks de 3. Ampliar este análisis para incluir la divergencia entre especies (un potente método para mejorar estos cálculos) no es posible debido a la rápida generación de novo de la variación en este VNTR en los linajes de primates (28).

Los enfoques estándar para definir las relaciones evolutivas entre estos haplotipos no son aplicables debido a la naturaleza repetitiva de la secuencia de ADN (23). Sin embargo, basándose en las secuencias de ADN observadas y en sus variaciones nucleotídicas, es sencillo proponer un origen simple para la mayoría de estos haplotipos (Fig. 3; Tabla 1). Los eventos de recombinación/mutación de un solo paso entre los alelos más comunes pueden explicar casi toda la variación observada de los alelos 2R-6R. La Fig. 3 es un diagrama simplificado de los eventos de recombinación más comunes propuestos. Aunque no se puede determinar la secuencia de nucleótidos inferida de un DRD4 ancestral, todos los alelos en una especie particular de primates parecen derivar de un ancestro común relativamente reciente (28). El alelo 4R más prevalente se propone como el alelo progenitor humano, basándose en (i) los limitados datos de secuencia reportados para los alelos DRD4 4R de primates (28), (ii) el menor nivel de LD para los polimorfismos que rodean a este alelo (como se discute más adelante), y (iii) los arreglos del motivo de secuencia de los alelos no 4R. La recombinación desigual entre dos alelos 4R(1-2-3-4) produciría los alelos comunes 2R-6R observados (Fig. 3). La posición del cruce determina la secuencia resultante. Por ejemplo, los alelos más comunes 3R(1-7-4) y 3R(1-2-4) sólo difieren en la posición del cruce, ya sea dentro o después de la segunda repetición (Fig. 3; Tabla 1). Así, la conocida alta frecuencia de recombinación desigual entre las repeticiones en tándem (29) puede explicar la mayor parte de la diversidad observada en el gen DRD4.

Además de los cruces desiguales, las mutaciones de punto único son evidentes en esta muestra de población (Tabla 1 y Fig. 2). Por ejemplo, con una excepción, todos los alelos 2R del mundo tienen la secuencia 2R(1-4) (Tabla 1). Todos los 12 alelos 2R resecuenciados del ADN Surui (Sudamérica) contenían una única mutación puntual, el alelo 2R(30-4) (Tabla 1 y Fig. 2). Esta mutación, un cambio de C a T en la primera repetición, no altera la secuencia de aminoácidos y probablemente tiene un origen reciente (menos de 10.000-20.000 años) (24).

En cambio, la formación de los alelos 7R y superiores observados no puede explicarse por simples eventos de recombinación/mutación de un solo paso a partir del haplotipo 4R(1-2-3-4) (Fig. 3). La generación de un alelo 7R a partir del alelo 4R más prevalente requeriría al menos una recombinación y seis mutaciones para surgir. Incluso permitiendo eventos de conversión genética más complicados, se necesitan múltiples pasos de baja probabilidad para convertir un alelo 4R en un alelo 7R (Fig. 3). Por ejemplo, el motivo central de cinco variantes que se encuentra en el haplotipo común 7R(1-2-6-5-2-5-4) podría producirse por una recombinación entre dos alelos 4R. La recombinación entre el motivo terminal de cuatro variantes de un alelo 4R y el motivo inicial de una variante del segundo alelo 4R produciría un haplotipo 7R(1-2-3-5-2-3-4) (Fig. 2). Se requieren entonces tres mutaciones adicionales de cada uno de los dos motivos de tres variantes en este haplotipo putativo 7R para producir el haplotipo actual 7R(1-2-6-5-2-5-4). Cuatro de estos seis cambios de nucleótidos no son sinónimos y alteran la secuencia de aminoácidos (Ser a Gly, Gln a Pro, Ala a Pro y Ser a Gly; Fig. 2). Aunque podría proponerse la conversión génica en lugar de la mutación como el mecanismo para «insertar» estos cambios de nucleótidos en un hipotético alelo 7R(1-2-3-5-2-3-4), serían necesarios dos eventos poco probables, uno de los cuales implicaría la conversión génica del alelo 7R-7R (Figs. 2 y 3).

No se observó ninguno de estos putativos haplotipos «intermedios» 7R en esta muestra de población mundial. Nuestra muestra incluyó 47 alelos 7R secuenciados de individuos de origen africano que se cree que contienen poblaciones con la mayor diversidad genética y edad (24). Es poco probable, por tanto, que existan haplotipos 7R intermedios de alta frecuencia. No es nuestra intención, sin embargo, proponer un origen específico del alelo 7R del DRD4. Más bien, deseamos enfatizar que, basándonos en el análisis de la secuencia de ADN, el alelo 7R de DRD4 parece bastante distinto de los alelos comunes 2R-6R. Es imposible determinar si el origen del alelo DRD4 7R fue un evento único y altamente improbable o una serie de eventos improbables (Fig. 3).

Independientemente del mecanismo de origen del alelo DRD4 7R, es claramente capaz de participar en eventos de recombinación con los otros alelos. La mayoría de los raros haplotipos 7R observados parecen ser eventos de recombinación, principalmente con el alelo común 4R(1-2-3-4) (Tabla 1). Por ejemplo, el haplotipo 7R(1-2-6-5-2-3-4) parece ser una recombinación entre un alelo 4R(1-2-3-4) y un alelo 7R(1-2-6-5-2-5-4) (Tabla 1 y Fig. 2). Este origen se confirmó analizando los SNP fuera de la región de recombinación (véase más adelante). Además, el origen de algunos de los raros alelos 5R y 6R y de todos los alelos 8R y superiores puede explicarse por recombinaciones en las que participa un alelo 7R, ya que contienen el motivo de seis variantes exclusivo del alelo 7R (Fig. 2 y Tabla 1). Sin embargo, muchos de estos alelos 8R y superiores parecen tener orígenes más complicados según el análisis de la secuencia de ADN (Tabla 1 y Fig. 2).

Este modelo (Fig. 3) explica la aparente anomalía en la diversidad de haplotipos observada anteriormente (Tabla 1), donde el alelo 4R más abundante (y antiguo, véase más adelante) tiene la menor diversidad de nucleótidos. Si la recombinación es el generador predominante de diversidad, entonces se predice que la mayoría de los eventos de recombinación 4R-4R tienen una secuencia de nucleótidos sin cambios. Dichos eventos sólo pueden inferirse mediante la recombinación de marcadores externos. Sólo cuando se produzca una recombinación fuera de registro se generarán nuevas variantes de secuencia (y longitud) de nucleótidos (Fig. 3). El patrón observado de diversidad de haplotipos es consistente con un sistema predominantemente de «2 alelos» (4R y 7R), con la mayoría de las variantes más raras generadas por recombinación a partir de estos dos haplotipos (Fig. 3).

La naturaleza inusual de la organización de la secuencia del alelo DRD4 7R, que sugiere que surgió como un evento mutacional raro, nos llevó a determinar si existen diferencias en LD entre los alelos 4R y 7R. El haplotipo de dos SNPs intrónicos adyacentes (G/A-G/C; Fig. 1) pudo determinarse directamente, porque estaban presentes en el mismo producto de PCR utilizado para amplificar el VNTR de 48 pb. Se encontró una fuerte LD entre el par SNP A-C y el alelo 7R (Fig. 3). El 97% de los alelos 7R estaban asociados al par SNP A-C (66 de 68 examinados). Los dos alelos 7R asociados a los SNP G-G eran haplotipos recombinantes 7R-4R, como se determinó originalmente a partir del análisis de la secuencia de ADN (arriba). Por el contrario, tanto los pares de SNP G-G como A-C están asociados a los alelos DRD4 4R (487 alelos examinados). Sin embargo, el par G-G es el más frecuente, representando el 86,1% de la muestra africana pero hasta el 98,6% de nuestra muestra asiática.

Todos los alelos 7R africanos estaban asociados con los haplotipos A-C, mientras que sólo el 13,9% de los alelos 4R africanos estaban asociados con el haplotipo A-C. El análisis de la secuencia de ADN de varias muestras de chimpancés y bonobos (datos no mostrados) indica que el par G-G SNP es probablemente la secuencia ancestral (Fig. 3). Por lo tanto, parece que el alelo original DRD4 7R surgió en este fondo de SNP A-C más raro. Una muestra de 73 alelos 2R, 3R, 5R y 6R mostraron aproximadamente la misma asociación con los SNPs G-G y A-C, lo que es consistente con su propuesto origen recombinacional de los alelos 4R y 7R (Fig. 3). Curiosamente, todas las 26 muestras asiáticas con alelos 2R examinadas mostraron asociación con los SNPs A-C, lo que sugiere su origen a partir de recombinaciones que implican a los alelos 7R (Fig. 3).

Se obtuvieron resultados similares para polimorfismos de inserción/deleción del promotor y del exón 1 más distantes (Fig. 1). En este caso, la asociación se dedujo indirectamente a partir de los datos obtenidos para nuestros estudios poblacionales anteriores (3, 17) y del análisis por PCR de un subconjunto de los individuos utilizados en este estudio. En el caso de 40 muestras en las que también se disponía de ADN paterno y se podía genotipar para estos marcadores, la fase se pudo inferir directamente. Se observó una fuerte asociación entre el polimorfismo del promotor L1 largo (duplicado) (Fig. 1) y el alelo 7R (Fig. 3), con el 90,8% de los alelos 7R asociados a L1 (607 alelos analizados). Por el contrario, el polimorfismo L1 está acoplado con sólo el 61,9% de los alelos 4R (2.102 alelos analizados). Aunque se observó una variación específica de la población (por ejemplo, más acoplamiento L1-4R en las poblaciones chinas que en las africanas), se detectó poco acoplamiento global L1-4R (Fig. 3). El polimorfismo L2 más cercano en el exón 1 (Fig. 1) se asoció al 93,4% de los alelos 7R y al 86,4% de los alelos 4R, una diferencia relativa similar a la observada para la asociación L1-7R y L1-4R. Sin embargo, el polimorfismo L2/S2 se encuentra en una región codificante y las limitaciones selectivas pueden estar influyendo también en la frecuencia alélica (30).

Los métodos estándar para estimar el tiempo de coalescencia de estos alelos no son aplicables, dada la naturaleza repetitiva de la región y la alta frecuencia de recombinación. Sin embargo, los cálculos de la edad de los alelos basados en la relativamente alta frecuencia poblacional mundial de los alelos DRD4 4R y 7R sugieren que estos alelos son antiguos (>300.000 años; refs. 25 y 26; ver Métodos). Por otro lado, los cálculos de la edad de los alelos basados en la variabilidad intraalélica observada (refs. 26 y 27; ver Métodos) sugieren que el alelo 7R es 5-10 veces «más joven» (30.000-50.000 años). Estas grandes discrepancias entre las edades de los alelos calculadas por estos dos métodos suelen tomarse como evidencia de que la selección ha aumentado la frecuencia del alelo a niveles más altos de lo esperado por la deriva genética aleatoria (26). Los valores absolutos de estas estimaciones se ven muy afectados por los supuestos utilizados en sus cálculos, por ejemplo la frecuencia de recombinación asumida (26). Hemos utilizado estimaciones conservadoras de la frecuencia de recombinación basadas en la media observada para las 20 megabases terminales de 11p (31). Dada la alta recombinación observada en este locus (Tabla 1 y Fig. 3), es probable que la edad real del alelo 7R sea aún más joven, y nuevos análisis de LD refinarán estas estimaciones. La conclusión importante, sin embargo, es que independientemente de los parámetros asumidos, las diferencias de edad relativa para los alelos 4R y 7R calculadas a partir de la variabilidad intraalélica siguen siendo grandes, mientras que su frecuencia poblacional sugiere que ambos son antiguos.

La hipótesis más sencilla para explicar (i) el sesgo observado en los cambios de nucleótidos (Ka/Ks), (ii) la inusual organización de la secuencia del alelo 7R del DRD4, y (iii) el fuerte LD que rodea a este alelo es que el alelo 7R surgió como un evento (o eventos) mutacional raro que, sin embargo, aumentó a una alta frecuencia por selección positiva. Los alelos ventajosos suelen tardar mucho tiempo en alcanzar una frecuencia de 0,1, y luego aumentan rápidamente hasta alcanzar frecuencias altas (>0,9). Aunque es posible que estemos observando la reciente expansión de un alelo 7R altamente ventajoso, sugerimos que es más probable que este sistema DRD4 de dos alelos (Fig. 3) sea un ejemplo de selección equilibrada. Este tipo de selección puede estar más extendida en el genoma humano de lo que generalmente se piensa (24). Un modelo de selección equilibrada propone que tanto los alelos 4R como 7R se mantienen en altas frecuencias en las poblaciones humanas. Se podría proponer una variedad de mecanismos para dicha selección equilibrada, desde la ventaja de los heterocigotos hasta la selección dependiente de la frecuencia (24). Según la teoría evolutiva de los juegos (32), la recompensa evolutiva de un determinado tipo de personalidad dependerá de la distribución existente de los tipos de personalidad. Por ejemplo, una alta agresividad puede conducir a una alta aptitud si casi todo el mundo es manso, pero podría resultar en una baja aptitud cuando es muy común, porque los individuos agresivos sufrirían las penalizaciones de los conflictos frecuentes. Este tipo de selección dependiente de la frecuencia podría esperarse que se aplicara a muchos tipos de variación psicológica, incluidos los asociados a este receptor neurotransmisor en particular (4-9).

Las explicaciones alternativas a la selección positiva propuesta, como los cuellos de botella aleatorios recientes, la expansión de la población y/o la mezcla de la población (24) son menos probables para explicar los resultados observados. Los cuellos de botella se han producido ciertamente durante la migración y la evolución humanas (33-35) y sin duda han influido en la actual frecuencia alélica del DRD4 en todo el mundo. Numerosos estudios poblacionales sobre otros genes (24, 33, 35) han demostrado que probablemente se produjo una constricción de la diversidad alélica «fuera de África» (y un aumento de la LD). En el presente estudio, se encontró una mayor diversidad (y menor LD) para los alelos africanos DRD4 4R en comparación con el resto de nuestra muestra poblacional, lo cual es consistente con la hipótesis de fuera de África (24). Aunque se podría argumentar que la frecuencia del alelo 7R aumentó por casualidad durante la expansión fuera de África, esta teoría no explica la inusual falta de diversidad en los alelos 7R africanos. El haplotipo más común L1L2-7R(1-2-6-5-2-5-4)-A-C (Fig. 3) se encuentra en frecuencias comparables a las encontradas en todo el mundo (>85%). Es difícil imaginar qué tipo de cuello de botella podría producir tales resultados, es decir, una fuerte LD mundial para un solo alelo (DRD4 7R), pero poca LD para los alelos restantes. Un modelo que concuerda con los resultados observados es la hipótesis del «débil Jardín del Edén» (24), en la que el alelo DRD4 4R se supondría antiguo y presente en las poblaciones autóctonas, mientras que el alelo 7R se propagó por la expansión fuera (y dentro) de África. En una hipótesis tan débil del Jardín del Edén, la selección positiva para el alelo DRD4 7R todavía debe ser propuesta.

Aunque sugerimos que un origen mutacional reciente y la selección positiva explican mejor los datos del alelo DRD4 7R, otra posibilidad no puede ser descartada. Dados los altamente improbables eventos de recombinación/mutación requeridos para generar el alelo 7R a partir del alelo 4R, una posibilidad que vale la pena considerar es la importación de este alelo desde un linaje de homínidos estrechamente relacionado. Sólo se puede especular sobre qué linaje podría ser, pero las poblaciones neandertales estaban presentes en el momento aproximado en que se originó el alelo 7R. Según este modelo, el tiempo de coalescencia de los alelos 4R y 7R sería entonces antiguo, y la importación se produjo recientemente, según la medición de la LD. Obviamente, el trabajo experimental adicional puede aclarar estas especulaciones.

Para el locus DRD4, es poco probable que la selección de un gen adyacente pueda explicar la selección propuesta, dada la secuencia de ADN distinta e inusual del propio alelo DRD4 7R. Si el alelo DRD4 7R se originó hace ≈40.000 años, cabe preguntarse qué ocurría en ese momento de la historia humana. Es tentador especular que la gran expansión de los humanos que se produjo en esa época, la aparición de una nueva tecnología radical (el Paleolítico superior) y/o el desarrollo de la agricultura (24), podrían estar relacionados con el aumento de la frecuencia del alelo DRD4 7R. Tal vez los individuos con rasgos de personalidad como la búsqueda de novedades, la perseverancia, etc. impulsaron la expansión (y la sustitución parcial). Se ha propuesto la especulación de que la migración podría explicar la distribución actual de los alelos 7R (34). Además de esta selección fenotípica, también podría estar operando la selección sexual. Tal como lo definió originalmente Darwin (36), «cualquier ventaja que ciertos individuos tengan sobre otros del mismo sexo y de la misma especie únicamente con respecto a la reproducción» conducirá a un aumento de la descendencia. Si los individuos con un alelo DRD4 7R tienen rasgos de personalidad/cognitivos que les dan una ventaja (múltiples parejas sexuales, mayor probabilidad de selección de pareja, etc.) entonces la frecuencia de este alelo se expandirá rápidamente dependiendo del entorno cultural. Quizás las diferencias culturales puedan explicar algunas de las diferencias observadas en la frecuencia del alelo DRD4 7R (3). Obviamente, la determinación de la naturaleza exacta de la selección del DRD4 y su base bioquímica y conductual está pendiente de una mayor experimentación. Los experimentos recientes que indican que los individuos con TDAH y que poseen este inusual alelo DRD4 7R rinden normalmente en las pruebas neuropsicológicas críticas de atención en comparación con otros probandos de TDAH (6) apuntan a una de las muchas áreas de investigación futura.

Uno puede preguntarse por qué un alelo que parece haber sufrido una fuerte selección positiva en las poblaciones humanas, sin embargo, está ahora desproporcionadamente representado en los individuos diagnosticados con TDAH. La hipótesis de la variante común/trastorno común (16) propone que la variación genética común está relacionada con la enfermedad común, ya sea porque la enfermedad es un producto de un nuevo entorno (de manera que los genotipos asociados con el trastorno no fueron eliminados en el pasado) o porque el trastorno tiene pequeños efectos sobre la aptitud (porque es de aparición tardía). En el caso de los trastornos de aparición temprana (como el autismo, el TDAH, etc.) sugerimos que se contemple la posibilidad de que los alelos predisponentes estén de hecho sometidos a una selección positiva y sólo produzcan efectos deletéreos cuando se combinan con otros factores ambientales/genéticos. En este contexto, es posible que las restricciones selectivas anteriores ya no estén operando en este gen. Sin embargo, también es posible especular que los mismos rasgos que pueden ser seleccionados en los individuos que poseen un alelo DRD4 7R pueden predisponer comportamientos que se consideran inapropiados en el entorno típico de las aulas y, por lo tanto, diagnosticados como TDAH.