Introducción
Las proteínas fluorescentes (PF) se han utilizado como etiquetas de proteínas desde mediados de la década de 1990, principalmente para la biología celular y la microscopía de fluorescencia. Estas etiquetas no sólo han revolucionado la biología celular al permitir la obtención de imágenes de casi cualquier proteína, sino que también se utilizan en aplicaciones bioquímicas. Un ejemplo importante es la inmunoprecipitación y la purificación por afinidad de proteínas marcadas con FP, lo que ha sido posible gracias al desarrollo de resinas de afinidad con alto rendimiento, pureza y afinidad, como las Nano-Traps de ChromoTek (https://www.chromotek.com/products/detail/product-detail/nano-traps/).
En este blog ofrecemos una revisión de
- proteínas fluorescentes verdes
- proteínas fluorescentes rojas
- autoetiquetadas, que requieren el acoplamiento covalente de una molécula fluorescente
Tipos de proteínas fluorescentes
La mayoría de los investigadores utilizan proteínas intrínsecamente fluorescentes GFP, mNeonGreen, TurboGFP, RFP o mCherry. Como alternativa, se han introducido proteínas extrínsecamente fluorescentes o autoetiquetadas que requieren el acoplamiento covalente de una molécula fluorescente a la proteína no fluorescente, por ejemplo, las etiquetas proteicas SNAP, CLIP y Halo. Estas proteínas fluorescentes autoetiquetadas tienen ciertas ventajas de rendimiento sobre las PF intrínsecas debido a las propiedades de sus tintes fluorescentes.
Figura 1: Estructuras de proteínas fluorescentes.
(A) Las proteínas intrínsecamente fluorescentes (FPs) como EGFP, GFP, RFP, mNeonGreen, turboGFP etc. comparten sólo un pequeño número de residuos comunes, pero se pliegan todas en una estructura de barril β conservada. Su fluorescencia se debe a la ciclación y oxidación de tres residuos de aminoácidos en el centro de este barril (resaltado a la derecha), lo que da lugar a un cromóforo de dos anillos. Este proceso químico se describe como maduración del cromóforo, es inherente al pliegue de la proteína y sólo depende de variables ambientales como la temperatura y la concentración de oxígeno, pero no de enzimas adicionales. El color, la fotoestabilidad, el rendimiento cuántico y otras propiedades espectrales de las proteínas intrínsecamente fluorescentes son el resultado de mutaciones en los aminoácidos que componen el cromóforo o que se encuentran en las proximidades del mismo.
(B) Las proteínas extrínsecamente fluorescentes, como HaloTag, no son fluorescentes en su forma apo basal. Sólo si se añade un fluoróforo activado adecuado a la proteína HaloTag, este fluoróforo será capturado y unido covalentemente por el residuo D106 de HaloTag, convirtiendo a HaloTag en fluorescente. (PDB IDs para las estructuras: EGFP, 2y0g; apo-HaloTag, 5uy1; holo-HaloTag, 5uxz.)
La proteína verde fluorescente de medusa (GFP) y sus derivados siguen siendo las proteínas fluorescentes más utilizadas en la investigación biomédica. Recientemente, se han introducido otras proteínas verdes fluorescentes derivadas de otros organismos. Estas PFs poseen el mismo pliegue básico que la GFP, pero divergen mucho a nivel de secuencia. Por lo tanto, requieren herramientas de investigación novedosas y específicas, como los anticuerpos.
El original: GFP
La proteína verde fluorescente fue aislada por primera vez de la medusa Aequorea victoria en 1962 por Osamu Shimomura. Tiene una fluorescencia verde de largo desplazamiento de Stokes (ex 395 nm; em 509 nm). 30 años después, Douglas Prasher consiguió clonar la secuencia de la GFP y Martin Chalfie expresó esta secuencia in vivo. Más tarde, el laboratorio de Roger Tsien desarrolló la GFP hasta convertirla en un conjunto de verdaderas herramientas de investigación. Shimomura, Chalfie y Tsien recibieron el Premio Nobel en 2008. Vea la conferencia de Roger Tsien sobre el Premio Nobel aquí: https://www.nobelprize.org/prizes/chemistry/2008/tsien/lecture/.
Los científicos desarrollaron una plétora de variantes de GFP con distintas propiedades. Estas PFs tienen diferentes propiedades funcionales y espectrales. La primera mejora significativa de la GFP fue una mutación (S65T) que aumentó la intensidad y la estabilidad de la señal de fluorescencia. El pico de excitación principal se desplazó a 488 nm (Heim et al., 1995). La variante común EGFP es una versión modificada de la GFP, que facilita el uso práctico de la GFP en una variedad de organismos y células diferentes.
La proteína fluorescente verde GFP también se conoce como avGFP, wtGFP y gfp10; EGFP como GFP mejorada y GFPmut1.
https://www.fpbase.org/protein/avgfp/
https://www.fpbase.org/protein/egfp/
TurboGFP
Informada en 2004, la TurboGFP es una proteína verde fluorescente dimérica de maduración rápida y brillante derivada de la CopGFP del copépodo Pontellina plumata. La TurboGFP del copépodo es evolutivamente distante de las proteínas fluorescentes derivadas de las medusas, como la EGFP, y sólo comparte un 20% de identidad de secuencia con las variantes de la GFP comúnmente utilizadas. Por lo tanto, la mayoría de los anticuerpos anti-GFP, incluido el GFP-Nanobody utilizado en GFP-Trap, no se unen a TurboGFP.
https://www.fpbase.org/protein/turbogfp/
mNeonGreen
mNeonGreen se deriva de una proteína multimérica de fluorescencia amarilla del lanceta Branchiostoma lanceolatum. Por lo tanto, mNeonGreen es evolutivamente distante de las PFs derivadas de medusas. mNeonGreen y los derivados comunes de la GFP comparten apenas un 20% de identidad de secuencia. Debido a la baja similitud de secuencia, se espera que las herramientas de afinidad (es decir, los anticuerpos) para las variantes de GFP no se unan a mNeonGreen. Ciertamente, esto se ha demostrado para los reactivos de afinidad de ChromoTek (Nanobodies/ VHHs y anticuerpos anti-GFP).
Publicado por primera vez en 2013, el mNeonGreen es hasta tres veces más brillante que la GFP. Se trata de una proteína fluorescente verde/amarilla monomérica emergente y versátil para aplicaciones de obtención de imágenes, incluida la microscopía de superresolución. Además, mNeonGreen actúa como aceptor de proteínas fluorescentes cian en aplicaciones de transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET). Parece ser la proteína verde fluorescente monomérica más brillante conocida hasta ahora y tiene una tasa de maduración rápida.
https://www.fpbase.org/protein/mneongreen/
Comparación de GFP, TurboGFP, y mNeonGreen
Propiedad |
EGFP (el derivado de GFP más utilizado) |
turboGFP |
mNeonGreen |
|---|---|---|---|
|
Descubrimiento/ primera publicación |
|||
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Origen |
GFP de la medusa |
CopGFP del copépodo Pontellina plumata |
Proteína fluorescente amarilla multimérica del lanceta Branchiostoma lanceolatum |
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Tasa de maduración (a 37°C) |
25 min |
25 min |
10 min |
|
Identidad de secuencia con EGFP |
(100%) |
~20% |
~20% |
|
¿Derivado de GFP? |
Sí |
No |
No |
|
Estructura |
Débil dímero |
Dímero |
Monómero |
|
Variantes comunes |
AcGFP, Clover, eGFP, Emerald, GFP, GFP5, GFP Envy, GFP S65T, mGFP, mPhluorin, PA-GFP, Superfolder GFP, TagGFP, TagGFP2, eGFP monomérica A206K, CFP, eCFP, mCerulean, YFP, Citrine, eCitrine, eYFP, Venus, Ypet, BFP |
TurboGFP, CopGFP |
mNeonGreen |
|
Máximo de excitación/emisión |
488 nm/ 509 nm |
482 nm/ 502 nm |
506 nm/ 517 nm |
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Longitud/peso molecular (MW) |
239 aminoácidos, |
2x 232 aminoácidos, |
237 aminoácidos, |
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Herramientas de investigación ofrecidas por ChromoTek |
Immunoprecipitación: GFP-Trap Western blot: Anticuerpo anti-GFP de rata Control: proteína EGFP purificada |
Immunoprecipitación: TurboGFP-Trap |
Immunoprecipitación: mNeonGreen-Trap Western blot: Anticuerpo de ratón anti-mNeonGreen |
Las proteínas fluorescentes rojas (RFP) son PFs que emiten luz fluorescente roja-naranja. La primera RFP que se comercializó fue la DsRed. Se derivó de las anémonas de mar Discosoma sp. en 1999.
DsRed tiene algunos problemas prácticos inmanentes: (i) Tiene un tiempo de maduración de unas 24 horas, lo que lo hace inutilizable para experimentos de corta duración. (ii) La forma tetramérica de DsRed puede comprometer la función de las proteínas a las que se une. (iii) Su fotoestabilidad es bastante baja.
En consecuencia, el DsRed fue sometido a mutagénesis dirigida al sitio para llegar a ser comúnmente aplicable como etiqueta de fusión codificada genéticamente. Finalmente, se crearon derivados monoméricos de RFP con mejor rendimiento fluorescente (en términos de brillo y fotoestabilidad) y mayor eficiencia de maduración. Además, se generaron derivados con fluorescencia naranja, roja y rojo lejano. Estas versiones monomerizadas de RFP se convirtieron en las valiosas herramientas de investigación mCherry, mOrange, mRaspberry, mPlum (también conocidas como «mFruits»), mKO, mRFP (también conocida como mRFP1), mRFPruby, mRuby, tagRFP, mKate2, y DsRed-Express, etc.
Se identificaron RFP adicionales en otros antozoos (es decir, anémonas y corales), pero estas proteínas también eran en su mayoría tetrámeros. Por lo tanto, aún no se han optimizado para su uso en la investigación.
mRFP (también conocida como mRFP1)
La primera variante monomérica de dsRed, diseñada genéticamente en el laboratorio de Roger Tsien, se denominó simplemente mRFP (o mRFP1), es decir, proteína fluorescente roja monomérica. En comparación con la dsRed, la mRFP1 se caracteriza por unos niveles ligeramente inferiores de absorción, rendimiento cuántico y fotoestabilidad. Sin embargo, su velocidad de maduración es unas 10 veces más rápida que la de DsRed, lo que da lugar a un brillo efectivo similar cuando se expresa en células vivas.
https://www.fpbase.org/protein/mrfp1/
mCherry
mCherry es probablemente la variante de RFP más utilizada. Es una proteína fluorescente roja monomérica con amplia aplicabilidad como proteína de fusión en varios tipos de células. Al igual que otras RFP mFruit, mCherry se deriva de la variante dsRed mRFP1 a través de la evolución dirigida por el laboratorio de Roger Tsien. En comparación con otros mFruits, mCherry tiene la mayor fotoestabilidad, la tasa de maduración más rápida y una excelente resistencia al pH. Sin embargo, su rendimiento cuántico es menor que el de mRFP1.
https://www.fpbase.org/protein/mcherry/
mPlum
El laboratorio de Roger Tsien también ha generado un derivado monomérico rojo lejano de mRFP1/dsRed, denominado mPlum. Las RFP de color rojo lejano son beneficiosas para las aplicaciones de obtención de imágenes de todo el cuerpo porque los principales absorbentes de los tejidos, como el agua, los lípidos y la hemoglobina, son casi transparentes en el rango de emisión de 650-900 nm. Como la mayoría de las RFP con desplazamiento al rojo, mPlum presenta un desplazamiento de Stokes ampliado.
https://www.fpbase.org/protein/mplum/
Comparación de mCherry, mRFP (mRFP1) y mPlum
| Propiedad | mCherry | mRFP (mRFP1) | mPlum |
|---|---|---|---|
|
Descubrimiento/primera publicación |
|||
|
Origen |
DsRed de anémona de mar |
DsRojo de anémona de mar |
DsRojo de anémona de mar |
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Tasa de maduración (a 37°C) |
15 min |
60 min |
100 min |
|
Estructura |
Monomero |
Monomero |
Monomero |
|
Agregación |
no |
no |
no |
|
Máximo de excitación/emisión |
587 nm/ 610 nm |
584 nm/ 607 nm |
590 nm/ 649 nm |
|
Longitud/peso molecular (MW) |
236 aminoácidos, |
228 aminoácidos, |
229 aminoácidos, |
|
Herramientas de investigación proporcionadas por ChromoTek |
Inmunoprecipitación: RFP-Trap |
Inmunoprecipitación: RFP-Trap |
Inmunoprecipitación: RFP-Trap |
Las etiquetas de proteínas extrínsecamente fluorescentes Halo, SNAP, y CLIP requieren la captura covalente de un pequeño ligando fluorescente para convertirse en una proteína fluorescente. Para ello, estas etiquetas proteicas autoetiquetadas se derivan de enzimas que catalizan la formación de enlaces químicos: Las etiquetas SNAP y CLIP son variantes de la alquiltransferasa O6-alquilguanina-ADN que reaccionan con derivados de la bencilguanina y la bencilcitosina, respectivamente. La HaloTag se deriva de una haloalcano deshalogenasa y reacciona con alquilhaluros (Figura 1).
En general, tanto las proteínas intrínseca como extrínsecamente fluorescentes se fusionan a una proteína de interés para permitir su imagen y detección celular. Sin embargo, las proteínas extrínsecamente fluorescentes requieren la adición de un fluoróforo reactivo, lo que tiene varias ventajas:
- Mayor rendimiento cuántico y fotoestabilidad
- Fluorescencia intensa tanto en células vivas como fijadas
- Una selección más amplia de colorantes fluorescentes
- Una única construcción genética permite la elección de distintos fluoróforos para la La fluorescencia sólo se inicia al añadir la etiqueta
La disponibilidad de tres proteínas extrínsecamente fluorescentes con diferentes especificidades de sustrato/ligando permite su uso ortogonal en experimentos multiplexados, también en combinación con FPs intrínsecas.
Dependiendo de las necesidades experimentales, se pueden utilizar ligandos permeantes de la célula basados en la tetrametilrhodamina (TMR), el verde de Oregón, la diAcFAM o la cumarina, que atraviesan fácilmente la membrana celular para el etiquetado de proteínas intracelulares. Alternativamente, pueden aplicarse ligandos impermeables a la célula basados en fluoróforos impermeables como Alexa Fluor® 488 y 660 para el etiquetado rápido de la superficie celular.
Comparación de HaloTag, SNAP-Tag, y CLIP-Tag
| Propiedad | HaloTag | SNAP-Tag | CLIP-Tag |
|---|---|---|---|
|
Descubrimiento/primera publicación |
|||
|
Origen |
Haloalcano deshalogenasa de Rhodococcus rhodochrous |
Humano O6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa |
Humana O6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa |
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Estructura |
Monómero |
Monómero |
Monómero |
|
Reactividad |
Derivados del cloroalcano |
O6-derivados de la bencilguanina |
Derivados de la bencilcitosina |
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Ligandos |
Colorantes permeables o no permeables a las células, fluoróforos, biotina y perlas |
Colorantes permeables o no permeables a las células, fluoróforos, biotina y perlas |
Colorantes permeables o no permeables a las células, fluoróforos, biotina y perlas |
|
Máximo de excitación/emisión |
Depende del fluoróforo acoplado |
Depende del fluoróforo acoplado fluoróforo |
Depende del fluoróforo acoplado |
|
Longitud/peso molecular (MW) |
297 aminoácidos, |
182 aminoácidos, |
182 aminoácidos, |
|
Herramientas de investigación ofrecidas por ChromoTek |
Immunoprecipitación: Halo-Trap |
Inmunoprecipitación: SNAP/CLIP-tag-Trap |
Inmunoprecipitación: SNAP/CLIP-tag-Trap |
HaloTag
El autoetiquetado HaloTag se ha derivado de la enzima haloalcano deshalogenasa DhaA de Rhodococcus rhodochrous. Su sitio activo ha sido modificado genéticamente para unirse de forma irreversible a sustratos con enlaces de cloroalcanos. Debido a este tipo de inhibición suicida, ya no es posible la regeneración de su sitio catalítico para una mayor deshalogenación. Dependiendo del sustrato elegido, el HaloTag se convierte en una etiqueta de proteína fluorescente o puede inmovilizarse en perlas de agarosa, por ejemplo.
Como las haloalcanos deshalogenasas están ausentes en las células eucariotas y en la mayoría de procariotas, incluida E. coli, no habrá etiquetado de fondo.
SNAP-tag
La etiqueta proteica de autoetiquetado SNAP-tag se deriva de la O6-alquilguanina-ADN-transferasa humana (hATG), que, como proteína de tipo salvaje, elimina el daño por alquilación del ADN. La variante resultante de la hAGT, utilizada como etiqueta SNAP, reacciona covalentemente con derivados de O6-bencilguanina (es decir, una etiqueta fluorescente conjugada con grupos salientes de guanina o cloropirimidina a través de un enlazador bencílico) de forma irreversible y altamente específica. En la reacción de etiquetado, el grupo bencílico sustituido del sustrato se une covalentemente a la etiqueta SNAP.
CLIP-tag
CLIP-tag es una versión modificada de SNAP-tag, diseñada para reaccionar con derivados de bencilcitosina en lugar de bencilguanina. Cuando se utiliza junto con SNAP-tag, CLIP-tag permite el etiquetado ortogonal y complementario de dos proteínas simultáneamente en la misma célula.
Una guía para elegir proteínas fluorescentes
Shaner N.C., Steinbach P.A. y Tsien R.Y. (2005)
Nature Methods 2(12), 905-909 doi: 10.1038/nmeth819
http://www.tsienlab.ucsd.edu/Publications/Shaner%202005%20Nature%20Methods%20-%20Choosing%20fluorescent%20proteins.pdf
Proteínas fluorescentes verdes:
La proteína verde fluorescente
Tsien R.Y. (1998)
Annual Review of Biochemistry, 67(1), 509-544. doi: 10.1146/annurev.biochem.67.1.509.
Fluorescencia verde mejorada
Heim, R., Cubitt A.B. y Tsien R.Y. (1995)
Nature, 373, 663-664. doi: 10.1038/373663b0
Base estructural para la rápida maduración de la proteína verde fluorescente de Arthropoda
Evdokimov A.G., Pokross M.E., Egorov N.S., Zaraisky A.G., Yampolsky I.V., Merzlyak E.M., Shkoporov A.N., Sander I, Lukyanov K.A y Chudakov D.M. (2006)
EMBO reports, 7(10), 1006-1012. doi: 10.1038/sj.embor.7400787.
Una proteína fluorescente verde monomérica brillante derivada de Branchiostoma lanceolatum
Shaner N.C., Lambert G.G., Chammas A., Ni Y., Cranfill P.J. Baird M.A., Sell B.R., Allen J.R., Day R.N., Israelsson M, Davidson M.W. y Wang J. (2013)
Nature Methods, 10(5), 407-409. doi: 10.1038/nmeth.2413
Proteínas fluorescentes rojas:
Proteínas fluorescentes monoméricas rojas, naranjas y amarillas mejoradas derivadas de la proteína fluorescente roja de Discosoma sp.
Shaner N.C., Campbell R.E., Steinbach P.A., Giepmans B.N.G., Palmer A.E. y Tsien R.Y. (2004)
Nature Biotechnology, 22(12), 1567-1572. doi: 10.1038/nbt1037
Una proteína fluorescente roja monomérica
Campbell R.E., Tour O., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. and Tsien R.Y. (2002)
PNAS, 99(12), 7877-7882. doi: 10.1073/pnas.082243699
Evolución de nuevas proteínas no anticuerpos mediante hipermutación somática iterativa
Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. y Tsien R.Y. (2004)
PNAS, 101(48), 16745-16749. doi: 10.1073/pnas.0407752101.
Recuperación de la deficiencia de maduración del cromóforo de la proteína roja fluorescente mediante el diseño racional
Moore M.M., Oteng-Pabi S.K., Pandelieva A.T., Mayo S.L. y Chica R.A. (2012)
Plos ONE, 7(12), e52463. doi: 10.1371/journal.pone.0052463.
Halo, SNAP y CLIP:
Sondas liberables con etiquetas SNAP para estudiar la endocitosis y el reciclaje
Cole N.B. y Donaldson J.G. (2012)
ACS Chemical Biology,7(3): 464-469, doi: 10.1021/cb2004252
Etiquetado de proteínas de sitio específico con SNAP-Tags
Cole N.B. (2013)
Protocolos actuales en la ciencia de las proteínas / consejo editorial, Coligan J.E. et al, 73: 30.1.1-30.1.16., doi: 10.1002/0471140864.ps3001s73
Una etiqueta proteica de ingeniería para el etiquetado multiproteico en células vivas
Gautier A., Juillerat A., Heinis C., Corrêa I.R., Kindermann M., Beaufils F. y Johnsson K. (2008)
Chemistry and Biology 15 (2): 128-136, doi: 10.1016/j.chembiol.2008.01.007
HaloTag: A Novel Protein Labeling Technology for Cell Imaging and Protein Analysis
Los G.V., Encell L.P., McDougall M.G., Hartzell D.D., Karassina N., Zimprich C, Wood M.G., Learish R, Friedman-Ohana R, Urh M., Simpson D., Mendez J., Zimmerman K., Otto P., Vidugiris G., Zhu J., Darzins A., Klaubert D.H., Bulleit R.F. y Wood K.V. (2008)
ACS Chem. Biol. 3(6): 373-382 doi: 10.1021/cb800025k
Un método general para el etiquetado covalente de proteínas de fusión con pequeñas moléculas in vivo.
Keppler A., Gendreizig S., Gronemeyer T., Pick H., Vogel H. y Johnsson K (2003)
Nat. Biotechnol. 21: 86-89, doi: 10.1038/nbt765
Etiquetado fluorescente de COS-7 que expresa proteínas de fusión SNAP-tag para la obtención de imágenes de células vivas
Provost C.R. y Sun L. (2010)
Visualized Exp. 39: 1876, doi: 10.3791/1876
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