Aquí se describe cómo se configura y ejecuta un ensayo colorimétrico para determinar la concentración de una sustancia que está en solución.
Enfoque general
No podemos poner el material bajo un microscopio y contar el número de moléculas por unidad de volumen de la forma en que podemos contar el número de células por unidad de volumen. Debemos encontrar algo que podamos medir y que sea proporcional a la concentración de la sustancia de interés. La medida más utilizada en los ensayos es la absorbancia de la luz. La Ley de Beer nos dice que si un soluto absorbe la luz de una determinada longitud de onda, la absorbancia es directamente proporcional a la concentración de la sustancia en la solución. Para medir y mostrar y/o registrar la absorbancia en unidades cuantificables se utiliza un aparato llamado espectrofotómetro. A menudo, la sustancia por sí misma no absorbe la luz como para permitir un ensayo práctico. Podemos tener que emplear uno o más reactivos para producir compuestos coloreados en proporción a la concentración de la incógnita.
La medición de la absorbencia de la luz por una muestra nos dice muy poco a menos que tengamos un estándar para comparar. Por ejemplo, si la muestra X muestra una absorbancia de 0,5, ¿cuál es la concentración real de X? Si tenemos una muestra de concentración conocida, y esa muestra también da una absorbancia de 0,5, entonces estamos razonablemente seguros de que la sustancia tiene esa misma concentración. Supongamos que tenemos varias muestras y que sus concentraciones varían. Sería útil tener una serie de estándares que abarquen todo el rango de concentraciones probables de nuestra incógnita. Ahí es donde entra en juego una curva estándar. Preparamos una serie de estándares de concentración conocida de X, que van de baja a alta concentración. Realizamos el ensayo y trazamos la absorbencia frente a la concentración de cada estándar. Usando esta curva estándar podemos leer la concentración de una incógnita dada su lectura de absorbancia.
Controles
Cuando ejecutamos un ensayo debemos asegurarnos de que sólo la sustancia que estamos ensayando es responsable de la absorbancia de la luz en el rango de longitud de onda de interés. Todas las condiciones en las que se preparan los estándares y las incógnitas deben ser idénticas. Si los solutos de los tampones de las muestras afectan a la absorbancia, entonces tenemos un problema. No obtendremos resultados precisos si variamos los volúmenes en los que preparamos y ensayamos los estándares y las incógnitas. El momento de la lectura de la absorbancia, la temperatura a la que mantenemos los materiales y todos los demás factores físicos deben mantenerse iguales. Como no siempre es práctico utilizar tampones idénticos para todas las incógnitas y estándares, sólo debemos asegurarnos de que ninguno de los componentes de cualquiera de los tampones tenga un efecto significativo sobre la absorbancia.
Cuando utilizamos el mismo volumen para todos los estándares e incógnitas simplificamos considerablemente el análisis. La curva estándar puede trazar la absorbancia frente a la cantidad de sustancia en lugar de la concentración. Puede ser menos confuso trabajar con cantidades mientras se hace un ensayo, especialmente si se requieren diluciones. Siempre que se conozca el volumen original de la muestra que se utilizó en un ensayo, la determinación de la concentración es fácil.
Complicación
Todos los ensayos tienen límites. Las cantidades de sustancia por debajo de algún mínimo serán indetectables. Más allá de una cantidad o concentración máxima, un ensayo se satura, es decir, los aumentos de cantidad o concentración no afectan a la absorbancia. Por lo general, intentamos trabajar dentro del rango lineal de un ensayo, es decir, cuando la absorbancia es directamente proporcional a la concentración. Lo ideal es establecer estándares que abarquen todo el rango útil de un ensayo. Es decir, optimizamos el rango del ensayo.
A menudo una muestra está tan concentrada que cuando se ensaya el volumen prescrito de la muestra el resultado está fuera de escala – el reactivo del ensayo está saturado. La solución entonces es diluir la muestra. Por ejemplo, si el volumen de cada estándar o muestra es de 1 ml, y 1 ml de su incógnita da un resultado fuera de escala, puede añadir 0,1 ml de muestra a un tubo de ensayo junto con 0,9 ml de tampón. Si lee una concentración de la curva estándar, multiplique el resultado por 10 para obtener la concentración real en la muestra. Si lee una cantidad de la curva estándar, entonces simplemente divida esa cantidad por 0,1 ml para obtener su concentración.
Cuando las muestras están tan concentradas que no puede pipetear una cantidad lo suficientemente pequeña con precisión, es posible que tenga que realizar diluciones en serie.
Ejemplo: preparación de una curva estándar
Vamos a configurar un ensayo hipotético para medir la sustancia X. Cuando X se mezcla con el reactivo del ensayo se forma un complejo que absorbe la luz a una longitud de onda de 400 nm. Nuestro espectrofotómetro requiere que pongamos 2 ml de volumen en cada cubeta. Una cubeta es un recipiente transparente que se coloca en la trayectoria de la luz para medir la absorbancia. Para obtener la proporción correcta de reactivo de ensayo con respecto a la muestra, hacemos que nuestro volumen de muestra sea de 0,5 ml y añadimos 1,5 ml de reactivo de color a cada tubo. Configurado de esta manera, el ensayo puede detectar cantidades de X desde 10 microgramos (µg) hasta 2 miligramos (mg).
Referencia
Para calibrar el espectrofotómetro necesitamos un tubo de referencia que sea idéntico en todos los aspectos a los estándares y a las muestras, excepto que no contenga ninguna sustancia X. Con la trayectoria de la luz bloqueada, el espectrofotómetro estará configurado para leer una absorbancia infinita (ninguna transmitancia de luz). Con el tubo de referencia en el recorrido de la luz, ajustaremos el espectrofotómetro para que lea una absorbancia nula. De este modo, una muestra que contenga X dará una absorbancia dentro de ese rango. El tubo de referencia se utiliza para darnos el máximo rango dinámico.
Para este ejemplo hipotético la referencia contendrá 0,5 ml de tampón de muestra y 1,5 ml de reactivo de color.
Estándares
Este ejemplo describe un ensayo hipotético sólo con fines ilustrativos.
Queremos la mejor precisión que podamos obtener, y nuestro rango abarca dos órdenes de magnitud, por lo que una forma de establecer la curva estándar es con una progresión logarítmica de estándares. Necesitamos estándares de 0,01 mg a 2 mg. Probemos con cantidades de 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,2, 0,5, 1 y 2 mg. La última brecha es bastante amplia, así que vamos a poner un estándar de, digamos, 1,5 mg. Para preparar los estándares es conveniente empezar con una solución madre concentrada de la sustancia. La mayor cantidad que necesitamos es de 2 mg, en un volumen de 0,5 ml. Para darnos un poco de «margen de maniobra» hagamos una solución madre de 5 mg/ml de la sustancia X. La siguiente tabla presenta los cálculos.
Tabla 1. Ejemplo de cómo planificar una curva estándar. La concentración de proteína en la solución madre era de 5 mg/ml. Este ejemplo es sólo para fines ilustrativos.
| cantidad de sustancia X (mg) | volumen de solución madre (µl) | volumen de tampón (µl) |
|
0 (referencia) |
0 | 500 |
| 0.01 | 2 | 498* |
| 0.02 | 4 | 496* |
| 0.05 | 490 | |
| 0.1 | 20 | 480 |
| 0.2 | 40 | 460 |
| 0.5 | 100 | 400 |
| 1 | 200 | 300 |
| 1.5 | 300 | 200 |
| 2 | 400 | 100 |
*Es habitual utilizar pipetas que nos dan volúmenes con una precisión de no más de 2 cifras significativas.
El volumen de tampón no es tan crítico como el volumen de solución madre. Los errores en el pipeteo del tampón afectan al volumen total y, por tanto, a la concentración del reactivo de color. Los errores de menos del 1% no tendrán un efecto significativo en los resultados. De hecho, si el volumen del reactivo de color supera con creces el volumen de la muestra (no en este caso) ni siquiera necesitaríamos igualar los volúmenes añadiendo tampón.
Algunos laboratorios no están equipados con pipetas que bajen de 5 µl con precisión. Puede ser necesario realizar una dilución en serie para obtener, por ejemplo, 2 o 4 µl de solución madre en un tubo de ensayo.
Preparación de la muestra
Ayuda tener una estimación razonable de los rangos de concentraciones de la muestra que uno puede esperar. Incluso con dicha estimación es bueno preparar muestras con un rango de diluciones, en caso de que una muestra esté tan concentrada que sus lecturas de absorbancia estén fuera de rango.
Para el ensayo del ejemplo, si utilizamos 500 µl de muestra en un tubo de ensayo (el volumen máximo), su concentración tendría que ser inferior a 4 mg/ml para dar una absorbancia legible. En cambio, querríamos esa cantidad si la muestra estuviera, digamos, diez veces menos concentrada. Sin saber nada de la concentración de una muestra concreta, cargaríamos un tubo con 500 µl para cubrir ese rango. Como el ensayo abarca un amplio rango de concentraciones, podemos utilizar 50 µl en un segundo tubo de ensayo. Ahora la muestra puede estar tan concentrada como 40 mg/ml y todavía tendremos 4 mg o menos en el tubo de ensayo, dando un resultado legible. Para cubrir todas las bases, podemos ensayar un tercer tubo con sólo 5 µl de muestra.
Ejecutar el ensayo
Cuando todos los estándares e incógnitas estén listos tendremos:
- 1 tubo de referencia
- algún número de estándares que abarquen todo el rango del ensayo
- dos o tres tubos de ensayo por muestra que representen una serie de diluciones
Es el momento de llevar a cabo el procedimiento para el desarrollo del color, que puede ser tan sencillo como añadir un reactivo de color y dejar reposar las muestras durante unos minutos. Cuando sea práctico, el tratamiento de cada estándar y de cada muestra debe ser cronometrado para que la absorbancia se lea siguiendo el mismo intervalo de tiempo para cada tubo. Se debe calibrar el instrumento y luego tomar las absorbancias de cada tubo en orden. Una curva estándar se obtiene trazando la absorbancia frente a la cantidad de sustancia X. Si la relación es claramente lineal, ni siquiera es necesaria una curva estándar. Las cantidades pueden determinarse mediante interpolación. Debe construirse una curva la primera vez que se utilice un ensayo, para comprobar la exactitud y la linealidad.
Ejemplo de una curva estándar
Aquí se muestra el aspecto que podría tener el gráfico en un cuaderno de laboratorio (el estudiante, obviamente, tiene una excelente caligrafía). La relación no es perfectamente lineal, más bien muestra un patrón de extinción típico.
Dado que el rango es tan amplio, para las muestras que dan lecturas de absorbancia muy bajas un estudiante podría querer un segundo gráfico de mayor resolución.
Determinar la concentración de una muestra
Una concentración es una cantidad de algo por unidad de volumen. Normalmente informamos de las concentraciones de proteínas en miligramos por mililitro (mg/ml), aunque a veces es conveniente utilizar microgramos/microlitro (µg/µl) o incluso µg/ml (para concentraciones muy pequeñas). Para una incógnita, dividimos la cantidad de sustancia (de la curva estándar) por el volumen de muestra utilizado en el ensayo. Tenga en cuenta que este volumen no es el del ensayo, ni el de la muestra diluida. Divida por el volumen de muestra sin diluir que colocó en el tubo de ensayo.
Supongamos que ha preparado tres tubos de ensayo para la muestra nº 1, que contienen 500 µl, 50 µl y 5 µl de muestra, respectivamente. Supongamos que dan lecturas de absorbancia de 0,86, 0,12 y 0,01, respectivamente. La última absorbancia está fuera de escala, por supuesto. El intercepto debería ser cero, pero no podemos contar con que las absorbancias muy bajas nos den lecturas suficientemente precisas.\N
Una absorbancia de 0,86 corresponde a 1,7 mg de sustancia X. El volumen era de 500 µl (0,5 ml), por lo que obtenemos una concentración de 3,4 mg/ml. Suena bien. Al comprobar el otro tubo legible, la absorbancia de 0,12 indica que el tubo contenía 0,20 mg de sustancia X. El volumen era de 50 µl (0,050 ml). La concentración debería ser de 0,20 mg/0,050 ml = 4,0 mg/ml. ¿Qué resultado utilizamos o tomamos una media?
He comprobado que utilizar la lectura de absorbancia que más se acerca al centro del rango sensible da los resultados más precisos. En el ejemplo anterior, el centro es una asorbancia de 0,5, que corresponde a 0,1 mg de sustancia. La escala de absorbancia es logarítmica, por lo que incluso desde una pantalla digital las lecturas son más fiables en el extremo inferior de la escala. Sin embargo, en las absorbancias muy bajas, uno o varios factores desconocidos, como un defecto en el tubo de muestra o en la cubeta, tendrán un efecto más profundo en el valor de la absorbancia que en las absorbancias más altas. En el extremo superior del rango, el reactivo de color se acerca a la saturación, por lo que no sólo se tiene menos resolución entre las lecturas de absorbancia, sino que el reactivo es menos sensible a las diferencias en la concentración de proteínas.