El estilo de vida necrótrofo de Rhizoctonia solani AG3-PT durante la interacción con su planta huésped, la patata, según el análisis del transcriptoma

Análisis del transcriptoma

La interacción interespecífica entre R. solani AG3-PT aislado Ben3 con el cultivar de patata medianamente resistente ‘Arkula’ se analizó a nivel del transcriptoma utilizando la secuenciación del ARN. Con el fin de encontrar factores importantes para el establecimiento de la interacción y la posterior progresión de la misma, utilizamos tres muestreos diferentes: micelio puro de R. solani AG3-PT aislado Ben3 cultivado sin ser atraído por una planta de patata en crecimiento (Ben3); brotes de patata a los 3 dpi de los tubérculos con R. solani (temprano) y a los 8 dpi (tardío). En ambas fechas de muestreo de R. solani en interacción con el brote de patata se cosecharon todos los brotes emergentes y se utilizaron en el análisis. Las lesiones necróticas en los brotes se hicieron visibles por primera vez a los 8 dpi. Posteriormente, se realizó la extracción de ARN, la secuenciación de ARN (RNAseq) y el mapeo de las lecturas con el genoma del aislado Ben334 para calcular los valores de lecturas por kilobase por millón de lecturas mapeadas (RPKM). En general, para las muestras inoculadas, entre el 1 y el 23% de cada conjunto de datos se mapeó en el borrador del genoma de Ben3. Para las muestras de control, entre el 70 y el 75% de estos conjuntos de datos pudieron ser mapeados en el genoma Ben3.

En los tres muestreos se pudo detectar un número comparable de genes expresados (Tabla 1). En el micelio puro se expresaron 11.206 genes de los 12.567 identificados en el genoma del aislado Ben3 de R. solani AG3-PT, mientras que se pudieron mapear lecturas en 10.181 y 9.939 genes a los 3 dpi y 8 dpi, respectivamente. En resumen, en todos los transcriptomas de este experimento, 11.287 genes de los 12.567 genes identificados en el genoma de R. solani AG3-PT aislado Ben3 se expresaron en cualquiera de las muestras analizadas.

Como es obvio en la Tabla 1, las cantidades de lecturas totales mapeadas difieren considerablemente. Esto se debe al hecho de que en el muestreo de Ben3 se ha secuenciado el transcriptoma del micelio puro del aislado Ben3 de R. solani AG3-PT, mientras que en los muestreos tempranos y tardíos (3 y 8 dpi) se ha utilizado un enfoque de RNAseq dual para acceder a los transcriptomas de ambos organismos que interactúan simultáneamente30. Dado que los tamaños de las bibliotecas y la cantidad de secuencias producidas a partir de cada biblioteca eran comparables, en el muestreo de Ben3 casi todas las lecturas pudieron ser mapeadas al genoma del aislado Ben3. En los enfoques de RNAseq dual de los muestreos a los 3 y 8 dpi, sólo una fracción de las lecturas producidas pudo ser mapeada al genoma de Ben3, mientras que las otras se mapearon principalmente al genoma de la patata. Debido a estas diferentes cantidades de lecturas totales mapeadas al genoma de R. solani AG3-PT aislado Ben3 por muestreo, hay que considerar lo siguiente (1) los genes con un valor RPKM bajo sólo en Ben3 no se expresan necesariamente cuando el hongo desafía a la planta, podría deberse simplemente a los tamaños de las bibliotecas; (2) los genes que se encuentran expresados en los tres muestreos podrían asignarse como comúnmente expresados; (3) los genes que sólo se encuentran expresados en las bibliotecas mucho más pequeñas de los muestreos de 3 y 8 dpi pueden asumirse como específicos de la interacción.

Los resultados resumidos del mapeo (Tabla 1) ya indicaban que debe haber muchos genes comúnmente expresados en los tres muestreos. Por lo tanto, se construyó un diagrama de Venn para comparar los tres muestreos y visualizar el número calculado de genes que tienen en común frente al número de genes que distingue a los muestreos individuales (Fig. 1). Se encontró que más de 9.000 genes se expresaban en los tres muestreos, mientras que 871 se transcribían exclusivamente en el micelio sin contacto con la planta. La expresión de 29 genes se encontró en común en los muestreos de 3 y 8 dpi, representando genes sólo expresados en presencia de la planta de patata viva. Además, a los 3 dpi se expresaron exclusivamente 27 genes, y las lecturas de secuencias que corresponden a un pequeño conjunto de 21 genes se detectaron exclusivamente a los 8 dpi. Las listas de estos genes, junto con sus respectivos valores RPKM y las descripciones, figuran en las Tablas Complementarias 1 – 4.

De los 29 genes que se expresaron comúnmente en presencia de la planta de patata viva, cuatro genes codifican proteínas implicadas en la degradación de la pared celular de la planta. Esto coincide con la estrategia de virulencia de un patógeno necrótrofo con secreción de enzimas que degradan la pared celular para inducir la necrosis de la célula huésped y la fuga de nutrientes21. Además, un gen que codifica una proteína implicada en la degradación de proteínas apoya aún más esta línea de ataque. Además, dos genes que codifican proteínas con dominios de unión al ADN y función putativa en la regulación transcripcional también están en esta lista y es probable que desempeñen un papel en la regulación transcripcional de la ofensa (por ejemplo, Ben3g4553, véase la Tabla 2). La mayoría de los 27 genes que se expresan exclusivamente a los 3 dpi codifican proteínas hipotéticas a las que no se puede asignar ninguna función putativa. De los 21 genes que se expresaron exclusivamente en etapas posteriores de la interacción (8 dpi), ocho genes codifican proteínas implicadas en la degradación de la pared celular de la planta y dos codifican proteasas. Esto demuestra de nuevo la estrategia típica de un patógeno necrótrofo.

En resumen, un primer examen de los datos del transcriptoma de los tres muestreos reveló diferencias distintas y razonables, demostrando así el potencial de este estudio para encontrar factores importantes para el establecimiento de la interacción entre R. solani AG3-PT aislado Ben 3 con un cultivar de patata susceptible y la posterior progresión de la interacción.

Los transcritos más abundantes de R. solani AG3-PT en los tres muestreos

La interacción interespecífica entre R. solani AG3-PT aislado Ben 3 con el cultivar de patata medianamente resistente ‘Arkula’ se evaluó inicialmente examinando los transcritos más abundantes en los tres muestreos diferentes. En el micelio en crecimiento cultivado en cultivo líquido, se encontraron transcritos de 11.206 genes del genoma del aislado Ben3. En total, se detectaron 698 transcritos de estos genes con valores RPKM medios de 100 y superiores, 37 con valores RPKM medios superiores a 1.000. En la fase de interacción temprana (3 dpi) de los brotes del tubérculo con el patógeno, se detectaron los transcritos de 10.181 genes con 729 que mostraban valores RPKM medianos de 100 y superiores, 25 con valores RPKM medianos superiores a 1.000. Se transcribieron 9.939 genes de R. solani AG3-PT con 742 que mostraban valores RPKM medios de 100 y superiores, 26 valores RPKM medios superiores a 1.000 a los 8 dpi (Tablas suplementarias 5-7). En total, se encontraron 9.679 genes del genoma del aislado Ben3 que se expresaron en los tres muestreos, entre ellos se encuentran los transcritos más abundantes en cada uno de los muestreos individuales analizados. Cinco de estos genes más expresados (Ben3g9573, Ben3g6448, Ben3g5323, Ben3g2326 y Ben3g675) codifican proteínas hipotéticas específicas de R. solani con funciones desconocidas. Por lo tanto, no se esperaba que estas proteínas desempeñaran funciones específicas durante la interacción con la planta, estas proteínas pueden ser más bien importantes para el crecimiento general y el metabolismo celular. Entre los transcritos más abundantes en cada uno de los muestreos individuales se encuentran también varias proteínas que contienen dominios de lectina (Ben3g9146, Ben3g9350 y Ben3g8869). También se ha informado previamente de que varias de estas proteínas que contienen un dominio de lectina de tipo ricina son las más abundantes en el aislado 7/3/14 de R. solani AG1-IB durante la interacción con su planta huésped, la lechuga30. Aunque las funciones específicas de estas proteínas de dominio de lectina son indeterminadas, se ha propuesto que las lectinas de R. solani podrían tener una función como proteína de almacenamiento dentro del micelio37. Además, dos genes que codifican proteínas con dominio de toxina thuringiensis (Ben3g8806, y Ben3g11931) también se transcribieron fuertemente en las tres muestras analizadas. Las toxinas de Bacillus thuringiensis son proteínas bacterianas conocidas por su actividad biocida contra los insectos38 , pero también se dirigen a otros organismos39. La fuerte expresión de estos homólogos del dominio de la toxina en R. solani indica que estas toxinas pueden ser de importancia general para el aislado Ben3 de R. solani AG3-PT más que jugar un papel específico en la interacción hongo-planta. Un gen que codifica una proteína de tapa de poro septal (Ben3g7115) también se encontraba entre los transcritos más abundantes en los tres muestreos, lo que indica su contribución a la homeostasis hifal en los hongos basidiomicetos40. Un transcrito similar a la proteína del tapón del poro septal (RSOLAG1IB_6054) también fue muy abundante en los transcritos del aislado 7/3/14 de R. solani AG1-IB encontrados en la zona de interacción sin síntomas con la lechuga30. Esta proteína específica de R. solani forma parte del material de taponamiento que cierra las perforaciones dentro de la tapa del poro septal de las células hifales e impide el transporte de fluidos citoplasmáticos entre células vecinas. Además, un gen que codifica una proteína de dominio de hemopexina (Ben3g6614) también se encontraba entre los genes más expresados en común en los tres muestreos. Este dominio denota metaloproteinasas dependientes de zinc, que son ampliamente reconocidas por desempeñar un papel importante en la regulación homeostática del entorno extracelular41, pero sus funciones biológicas también pueden ir más allá de la degradación de la matriz extracelular42. Dado que todas estas proteínas mostraron una alta abundancia en R. solani AG3-PT con y sin contacto con la planta huésped, pueden ser importantes para el crecimiento y el metabolismo en general, pero no parecen tener una relevancia específica en la interacción del hongo con la planta.

La interacción entre R. solani AG3-PT y la patata

Con el fin de encontrar elementos con relevancia para apoyar la interacción del aislado Ben3 de R. solani AG3-PT con el brote de la patata, se llevó a cabo la expresión génica diferencial integrada en la plataforma ReadXplorer (v2.2)43. Esta comparación por pares de los transcriptomas del micelio puro del aislado Ben3 con los transcriptomas de 3 dpi u 8 dpi de interacción con los brotes de patata se llevó a cabo utilizando el programa DESeq2. Los genes se asignaron como expresados diferencialmente con un valor P ajustado de menos de 0,05 y un cambio de pliegue mínimo de |2| o más. Utilizando estos criterios, 592 genes pudieron ser asignados como inducidos diferencialmente a los 3 dpi (suma de 242 genes exclusivamente inducidos tempranamente y 350 genes inducidos a los 3 dpi y también a los 8 dpi; early up) mientras que 520 genes están reducidos diferencialmente a los 3 dpi (suma de 412 genes exclusivamente reducidos tempranamente y 108 genes reducidos a los 3 dpi y también a los 8 dpi; early down). A los 8 dpi, se encontraron 688 transcritos inducidos diferencialmente (suma de 338 genes exclusivamente inducidos tardíamente y 350 genes inducidos a los 8 dpi y también a los 3 dpi; late up) y 233 están reducidos diferencialmente (suma de 125 genes exclusivamente reducidos tardíamente y 108 genes reducidos a los 8 dpi y también a los 3 dpi; late down). Se construyeron diagramas de Venn para comparar y visualizar los genes diferencialmente regulados al alza y a la baja en ambos puntos temporales durante la interacción (Fig. 2). Las listas de estos genes junto con sus respectivos valores de cambio de pliegues se dan en las Tablas Suplementarias 8-9.

Las diferencias de expresión encontradas con este análisis DESeq2 fueron validadas en experimentos utilizando qRT-PCR. Por lo tanto, hay que establecer un gen de control adecuado con un patrón de expresión invariable. La gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Ben3g7151, GAPDH), la enzima conjugadora de ubiquitina E2 (EUC63156, UBC), la ubiquitina-proteína ligasa E3 (Ben3g494, UBI), el factor de elongación 2 (Ben3g3364, EF-2) y los genes de beta tubulina (Ben3g4099; TUB1) y (Ben3g5288, TUB2), y el gen de la beta tubulina Ben3g5288 (TUB2) resultó ser la referencia más adecuada en nuestros experimentos. Los niveles relativos de transcripción de tres genes candidatos con diferentes patrones de expresión se normalizaron sobre la base de la expresión de este control invariable. Se calcularon los valores ΔΔCq y se compararon con los respectivos análisis DESeq2 (Tabla 2).

Para los tres genes candidatos con patrones de expresión muy diferentes, los valores ΔΔCq calculados coincidían con los respectivos valores de cambio log2fold calculados en el análisis DESeq2, demostrando así la validación de las diferencias de expresión.

Además, se realizaron anotaciones de ontología genética (GO) para asignar las respectivas funciones a los genes particulares. En el análisis posterior, se prestó una atención específica a los genes significativamente inducidos para captar preferentemente candidatos moleculares que pudieran ser importantes para la iniciación y el establecimiento de la interacción con la planta.

Genes expresados diferencialmente (DEGs) en el aislado Ben3 a los 3 dpi de los brotes de patata

Se seleccionaron los genes inducidos diferencialmente en el aislado Ben3 en la interacción con los brotes de patata a los 3 dpi en comparación con el micelio puro del aislado asumiendo funciones en el inicio y apoyo del proceso de interacción con los brotes de patata. Las posibles funciones de los productos génicos particulares y su distribución en los aspectos comunes de GO para el proceso biológico (BP), la función molecular (MF) y el componente celular (CC) se dan en la Fig. 3.

A los 3 dpi, los genes inducidos diferencialmente se asignan principalmente como implicados en procesos metabólicos de carbohidratos y compuestos celulares de nitrógeno y en el transporte. Casi el 10% (50 genes) de los genes diferencialmente regulados codifican diversas actividades de peptidasa (por ejemplo, Ben3g2070, véase la Tabla 2), mientras que 53 genes codifican enzimas degradadoras de la pared celular, incluyendo varias hidrolasas diferentes que actúan sobre los enlaces glucosilados, y pectato liasas (por ejemplo, Ben3g3530, véase la Tabla 2.) o xilanasas. Para especificar aún más estas enzimas degradadoras de la pared celular, todos los DEGs fueron también anotados según la base de datos Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (Tabla Suplementaria 11). La secreción de un gran arsenal de enzimas hidrolíticas, como las proteasas y las enzimas degradadoras de la pared celular, durante el curso de la interacción44,45 es necesaria para que los hongos patógenos necrótrofos de las plantas, como R. solani, induzcan la necrosis celular mediante la descomposición de las proteínas estructurales y los componentes de los carbohidratos de las paredes celulares de las plantas y causen la fuga de nutrientes9,30,46,47. Por lo tanto, se hipotetiza que las enzimas degradantes de la pared celular inducidas y varias de las peptidasas inducidas funcionan para apoyar la interacción de R. solani AG3-PT con el tejido de la patata germinada. Sin embargo, las peptidasas secretadas también se han estudiado ampliamente por sus funciones como efectores de bacterias gramnegativas48 y también de hongos47,49. Los efectores de los patógenos suelen introducirse como factores de virulencia en las células del huésped para suprimir las respuestas de defensa basales y crear un entorno adecuado para la propagación del patógeno50,51,52. Por lo tanto, la modificación postraduccional de las proteínas del huésped a través del procesamiento proteolítico es un mecanismo ampliamente utilizado en la regulación de la respuesta de defensa de la planta. Con el estado actual de conocimientos se podría suponer que una o más de estas proteasas inducidas tienen funciones putativas como efectores que apoyan la interacción de R. solani AG3-PT en el huésped patata. Sin embargo, se necesitan más análisis funcionales de las proteasas individuales para asignar claramente su papel funcional en la interacción patógeno-huésped.

Otro gran grupo compuesto por 100 miembros de genes diferencialmente regulados de la interacción a los 3 dpi se describe como codificación de proteínas hipotéticas. La mayoría de estos genes son específicos de R. solani y sus homólogos pueden encontrarse en los otros cinco genomas anotados de R. solani AG3 Rhs1AP, R. solani AG2-2IIIB, R. solani AG8, y R. solani AG1-IA y AG1-IB. A partir de nuestro análisis de expresión génica diferencial, se espera que algunos de estos genes estén implicados en el apoyo a la interacción de R. solani AG3-PT en el brote de patata. Ya se sabe que los efectores secretados de los patógenos fúngicos se dirigen a la inmunidad del huésped utilizando varias estrategias, por ejemplo, hidrolizando un precursor del ácido salicílico53, o uniéndose a factores de transcripción, inhibiendo así su actividad54. Se necesitan más análisis para revelar las funciones putativas de las proteínas hipotéticas hasta ahora para sus posibles papeles en la interacción de R. solani AG3-PT con la patata.

Interesantemente, el gen con mayor incremento diferencial (Ben3g6247) es homólogo a las proteínas de la familia de transportadores de lípidos (LTE), como RTA1 de Saccharomyces. La proteína RTA1 contiene siete segmentos potenciales que atraviesan la membrana55 y se predice que es una proteína integral de membrana con función en la resistencia celular a los xenobióticos56. Otros genes de la familia LTE pueden codificar transportadores o sensores que facilitan la excreción de intermediarios biosintéticos, ya sea directa o indirectamente56. Estas funciones putativas de las proteínas de la familia LTE hacen que el gen Ben3g6247 sea un candidato favorito implicado en la secreción de componentes importantes para el ataque del patógeno.

La fase temprana de la interacción necrotrófica se asocia con la muerte celular del huésped vegetal y la producción de varios metabolitos secundarios y la acumulación de especies reactivas de oxígeno21. Se ha demostrado que los procesos antioxidantes y la respectiva expresión génica se correlacionaron con los tejidos necróticos en varios patosistemas de R. solani (brote de patata-R. solani AG3; hipocótilo de soja-R. solani AG4 y hojas de soja-R. solani AG1-IA)27. En la fase inicial de la interacción del hospedador de la patata con el aislado Ben3 (3 dpi) no se observó ninguna evidencia fuerte de la inducción de procesos antioxidantes en las hifas del patógeno a nivel transcripcional, porque no hubo ningún aumento fuerte en la expresión de genes de la glutatión S-transferasa o la regulación al alza de otros genes conocidos por estar involucrados en la eliminación de especies reactivas de oxígeno. Por lo tanto, podría postularse que en nuestro sistema para colonizar el brote de patata con R. solani AG3-PT, el análisis del tejido a los 3 dpi se asemeja a una etapa temprana de la interacción del patógeno de la planta, tal vez antes de la infección del tejido del brote. No se observaron síntomas visibles en este punto de tiempo.

Genes expresados diferencialmente en el aislado Ben3 a los 8 dpi de los brotes de patata

Con el fin de encontrar transcritos que sean importantes en una etapa avanzada de la interacción, se examinaron los genes inducidos diferencialmente entre el micelio puro del aislado Ben3 y el Ben3 atraído por los brotes de patata a los 8 dpi. Las respectivas anotaciones funcionales de los productos génicos y su distribución en las características comunes de GO se muestran en la Fig. 4. A los 8 dpi, los genes inducidos diferencialmente se asignan principalmente como implicados en procesos metabólicos de carbohidratos y macromoleculares y en el transporte. En esta etapa posterior de la interacción, los 152 genes regulados al alza (> 22%) codifican varias enzimas degradantes de la pared celular (por ejemplo, Ben3g3530, véase la Tabla 2). Además, todos los DEGs también fueron anotados según la base de datos Carbohydrate Active enZyme (CAZy) (Tabla suplementaria 11). Este aumento de la expresión de los genes que codifican las enzimas hidrolíticas de la pared celular demuestra muy bien la creciente actividad patógena del aislado Ben3, así como la importancia de la descomposición de los componentes de la pared celular para acceder a los nutrientes durante el curso de la interacción, confirmando así la estrategia de virulencia descrita de un patógeno necrótrofo21,57. Esta táctica destructiva iba acompañada de una inducción de la expresión de genes que codifican componentes integrales de las membranas. Estas 154 proteínas integrales de membrana, en su mayoría no caracterizadas, y los putativos transportadores estaban presumiblemente implicados en la captación de nutrientes y productos de degradación de las actividades hidrolásicas. En esta fase de la interacción, la importancia predominante de los genes que codifican peptidasas parecía estar disminuyendo, pero todavía 33 genes que codifican peptidasas estaban diferencialmente regulados al alza (por ejemplo, Ben3g2070, véase la Tabla 2). Esto también podría explicarse por el hecho de que se cosecharon brotes enteros, incluyendo los brotes con hasta 8 días de interacción con el patógeno desafiante y los posteriores brotes emergentes con un periodo de interacción más corto. En general, esto también está representado en los 350 genes que fueron en común diferencialmente incrementados a los 3 y 8 dpi (Fig. 2).

Además, otro gran grupo de DEGs a los 8 dpi está compuesto por 98 genes con función desconocida. Dado que estos genes son específicos de Rhizoctonia sin ninguna región de similitud con secuencias con funciones asignadas, sólo se puede especular sobre su papel en el apoyo a la interacción planta-patógeno. Otras comparaciones funcionales de estos genes y, por ejemplo, su expresión diferencial en los respectivos sistemas patológicos podrían dar pistas sobre su función putativa.

En el sistema experimental aquí descrito para colonizar el brote de patata con el aislado Ben3 de R. solani AG3-PT las lesiones se hacen visibles por primera vez a los 8 dpi. Se ha demostrado en otros experimentos25,27 que la interacción necrótrofa y la muerte celular en la planta huésped estaban correlacionadas con la respectiva expresión génica en la planta y en el hongo. Samsatly y colaboradores27 demostraron mediante el uso de RT-PCR cuantitativa, que la expresión de los genes antioxidantes que codifican la glutatión S-transferasa y la catalasa se incrementaron significativamente en R. solani AG3 cinco días después de la inoculación de brotes de patata desprendidos. Sin embargo, en los experimentos aquí descritos no se encontró una expresión tan fuertemente aumentada de estos genes antioxidantes. Las razones de estas diferencias podrían deberse a la inoculación con aislados de R. solani AG3 que presentan diferencias de patogenicidad. Sin embargo, otra distinción es el hecho de que Samsatly y colaboradores27 realizaron experimentos con brotes desprendidos en un sistema in vitro limitado, mientras que nuestro montaje experimental refleja plenamente las condiciones del entorno in vivo con brotes en crecimiento en tubérculos de semillas cultivadas. Otras investigaciones junto con el análisis concomitante del transcriptoma en el huésped de la patata aumentarán finalmente la comprensión de una relación mutua en la interacción patógeno huésped en un entorno que se asemeja a la situación natural.

Genes expresados diferencialmente en el aislado Ben3 comparando 3 y 8 dpi de brotes de patata

Para diferenciar entre R. solani AG3-PT que eran principalmente relevantes en el punto de tiempo temprano y los que se vuelven más importantes en las etapas avanzadas de la interacción genes expresados diferencialmente entre 3 y 8 dpi de la interacción también se analizaron con DESeq2. Utilizando los criterios mencionados, con valores P ajustados de menos de 0,05 y un cambio mínimo de |2| o más, 173 genes pudieron ser asignados como expresados diferencialmente entre 3 y 8 dpi, mientras que 400 genes son expresados diferencialmente en el punto de tiempo posterior. Las listas completas de estos genes, junto con sus respectivos valores de la media base y los valores del cambio de pliegues, figuran en la Tabla Suplementaria 10, y las listas de los 20 genes más expresados diferencialmente entre los 3 y los 8 dpi se presentan en las Tablas 3 y 4. Mientras que 10 de los 20 genes más expresados diferencialmente entre 3 y 8 dpi codifican proteínas implicadas en la degradación de proteínas y en la absorción y asimilación de nitrógeno (Tabla 3), la mayoría de los genes expresados diferencialmente entre 3 y 8 dpi están implicados en la degradación de polisacáridos, centrándose en las monooxigenasas líticas de polisacáridos dependientes del cobre para la escisión de las cadenas de celulosa con la oxidación de varios carbonos (Tabla 4).

Se sabe que el metabolismo del nitrógeno y la expresión génica regulada por el nitrógeno en los hongos fitopatógenos es de gran importancia para el establecimiento de la enfermedad en la planta huésped58. Sin embargo, el nitrato es la fuente de nitrógeno menos preferida en comparación con el amonio y la L-glutamina con respecto a la utilización de nutrientes en los hongos, al menos durante la infección de las hojas59. En los hongos, esta utilización preferente de nutrientes se regula a través de la represión de los metabolitos del nitrógeno y asegura la transcripción de los genes que codifican la permeasa activa de amonio y urea. Además de la fuerte expresión transitoria de los genes que codifican las permeasas transportadoras de amonio y compuestos nitrogenados (Ben3g6147, Ben3g6767, Ben3g4369, y Ben3g7775) en la etapa de interacción temprana a los 3 dpi, el aislado Ben3 de R. solani AG3-PT ejerció también una alta inducción y expresión de los genes involucrados en la captación y asimilación de nitrato (Ben3g6360, Ben3g6359, y Ben3g6361). Si esto es un rasgo distintivo del aislado Ben3 o una característica de los hongos patógenos de plantas transmitidos por el suelo necesitaría más investigaciones.

La mayoría de los genes con una expresión diferencialmente aumentada entre 3 y 8 dpi están implicados en la degradación de la pared celular codificando hidrolasas que actúan sobre los enlaces glicosilos, y pectato liasas. Esto era de esperar y demuestra de nuevo la creciente importancia de la degradación de los componentes de la pared celular que designa la estrategia de virulencia de un patógeno necrótrofo21.