El ensayo clonogénico se ha utilizado en numerosos estudios para cuantificar el crecimiento clonogénico y su abrogación por estímulos citotóxicos, incluyendo la radiación, los fármacos quimioterapéuticos y/o los agentes molecularmente dirigidos, in vitro. El procedimiento estándar actual para determinar las fracciones de supervivencia se basa en la suposición de que el crecimiento clonogénico en los cultivos celulares tratados puede normalizarse con respecto a los controles no tratados mediante la división por un PE constante y específico de la línea celular.
Aquí mostramos, sin embargo, que esto no es universalmente aplicable. Por el contrario, nuestros datos indican claramente que la correlación entre el número de células sembradas en una placa de cultivo y el número de colonias obtenidas está lejos de ser siempre lineal. En el caso de las líneas celulares con comportamiento cooperativo, el análisis basado en PE de los datos de supervivencia clonogénica arrojó resultados con errores intrínsecos al ensayo entre grandes y enormes. Incluso si sólo se utilizaron placas de cultivo con un número razonable de colonias (C = 5 a 100) para el análisis, las fracciones de supervivencia clonogénica a una dosis determinada diferían en mucho más de un orden de magnitud para las líneas celulares con altos grados de cooperación celular. Cabe destacar que prácticamente cualquier curva de supervivencia (empinada o plana, moderada o fuertemente curvada, lineal, cuadrática o irregular) puede derivarse de este rango de resultados calculados a partir del conjunto de datos dado, una observación que podría ser de particular importancia para los biólogos de la radiación.
Tomados en conjunto, nuestros datos muestran que el análisis convencional basado en PE de los datos de supervivencia clonogénica funciona de manera inapropiada tan pronto como se produce la cooperación celular bajo una o más condiciones dentro de un experimento, y los resultados de supervivencia extraídos variarán dentro de un rango insatisfactoriamente grande. En concreto, los resultados estarán muy sesgados si sólo se colocan una o unas pocas densidades celulares similares. Esta práctica genera errores intrínsecos al ensayo que son una consecuencia directa de las densidades celulares elegidas y, por tanto, no son susceptibles de análisis estadísticos de errores. En el caso de las líneas celulares que crecen de forma cooperativa, nuestras observaciones pueden explicar en parte las incongruencias entre ensayos, entre investigadores y entre laboratorios de los datos de respuesta al tratamiento. Un meta-análisis de los datos del ensayo de formación de colonias A549 apoya aún más esta hipótesis: Dentro de un panel de 156 estudios diferentes, Nuryadi et al. informaron de valores de SF4 para esta línea celular específica que oscilaban entre el 5 y el 90%, con un rango intercuartil de SF4 de más del 25% . Aunque otros parámetros diversos pueden ciertamente influir en los datos de respuesta al tratamiento, concluimos a partir de nuestros datos que la cooperación celular es un factor importante que explica la variabilidad entre estudios. Dado que incluso pequeñas diferencias en las fracciones de supervivencia clonogénica pueden animar a los investigadores a postular y estudiar nuevas hipótesis científicas que podrían eventualmente estar basadas en una falsa precisión, desarrollamos un novedoso enfoque de análisis que es menos susceptible al impacto de la densidad celular -especialmente pero no sólo para las líneas celulares de crecimiento cooperativo. Este método tiene en cuenta las relaciones no lineales entre el número de células sembradas y el número de colonias obtenidas mediante la puntuación de placas de cultivo con una amplia gama de números de células sembradas para todas las condiciones de tratamiento.
Matemáticamente, nuestro enfoque utiliza la regresión de potencia y la interpolación de números emparejados de colonias a diferentes dosis de irradiación. Aplicado al mismo conjunto de datos que se utilizó para los cálculos basados en PE, proporcionó resultados claramente más estables e independientes de la densidad celular. Los lectores atentos habrán notado que los cálculos de la fracción de supervivencia realizados según el método presentado aquí, se basan únicamente en el coeficiente a y el exponente b extraídos por regresión de potencia. Aunque esto compensa obviamente los efectos de la cooperación celular, conlleva otra cualidad de error que se deriva de la inexactitud de la regresión y que no puede compararse cuantitativamente con la cualidad de error similar en los cálculos de la fracción de supervivencia basados en PE. En consecuencia, este error debe minimizarse asegurando un diseño experimental cuidadoso con un número suficiente de réplicas independientes. Además, los cálculos de la fracción de supervivencia sólo deben realizarse con resultados de regresión de potencia de rendimiento adecuado, como indica el coeficiente de regresión R.
Nuestro enfoque matemático sustituye básicamente los cálculos de supervivencia clonogénica basados en PE por la pregunta:
¿Cuántas veces más células deben sembrarse en una placa de cultivo tratada para producir el mismo número de colonias que en una placa de control?
El exponente b es de especial importancia a este respecto. Indica si la correlación entre el número de células sembradas y el número de colonias contadas es lineal (b ≈ 1) o no. Los valores b elevados, como los obtenidos para las células BT20 y SKLU1, indican que el crecimiento celular in vitro se desacelera (o se anula por completo) si se aumenta el volumen de medio de cultivo por célula, ya sea mediante el uso de grandes volúmenes de ensayo o la reducción del número de células sembradas. Cabe destacar que los valores b no son en absoluto específicos para una determinada línea celular, sino que son una consecuencia del medio de cultivo celular elegido, de varios parámetros de incubación del ensayo y del procedimiento experimental, incluyendo prácticamente cualquier aspecto que pueda afectar al crecimiento clonal de las células que se encuentran en una situación de estrés extremo cuando se siembran como células individuales, como la formulación del medio, la suplementación con nutrientes y factores de crecimiento, los métodos utilizados para la separación de las células, el material plástico, etc. Por ejemplo, el uso de medios condicionados de células BT20 casi confluentes atenuó fuertemente el comportamiento cooperativo de las células individuales BT20, mientras que este procedimiento no tuvo ningún impacto en el crecimiento clonogénico de las células MDA-MB231 de crecimiento no cooperativo. Además, el tiempo de duplicación de las células BT20 cooperativas dependía tanto del tiempo de incubación del ensayo como de la densidad celular en el pozo, dando así una explicación biológica evidente a las imprecisas fracciones de supervivencia clonogénica obtenidas mediante cálculos basados en PE: La tasa de crecimiento de un grupo de células en proliferación puede ser simplemente demasiado lenta para alcanzar el umbral de 50 células por colonia dentro del tiempo de incubación del ensayo. Por lo tanto, la aparente «no clonalidad» de un grupo de, por ejemplo, 35 células de proliferación lenta en el punto de tiempo de parada es simplemente una consecuencia inevitable del tiempo de incubación del ensayo que, al menos hasta cierto punto, se elige arbitrariamente. En este contexto, analizamos adicionalmente el impacto del tiempo de incubación en las fracciones de supervivencia clonogénica obtenidas y observamos que no es suficiente determinar el punto de detención únicamente mediante la inspección de los platos de control como sugieren otros : La terminación prematura del periodo de incubación puede conducir a fracciones de supervivencia excesivamente bajas en platos con un tratamiento más agresivo donde la reparación del daño antes de la continuación del crecimiento celular requiere un tiempo adicional.
Importantemente, nuestros datos coinciden plenamente con los hallazgos seminales de los investigadores pioneros de los cultivos celulares en las décadas de 1940 y 1950 y simplemente reflejan un fenómeno que estaba siendo investigado ampliamente en ese momento. Puck y sus colegas fueron los primeros en publicar una curva de supervivencia de células individuales irradiadas en 1956. Sin embargo, el mayor desafío científico a este logro fundamental fue un problema por entonces no resuelto del cultivo de células de mamíferos: Las líneas celulares dejaban de crecer in vitro en cuanto las células se sembraban a baja densidad. Un intento de superar este problema fue realizado en 1948 por Sanford et al., que consiguieron cultivar colonias de fibroblastos unicelulares en pequeños capilares en los que la difusión de los factores derivados de las células en el medio era muy reducida, lo que permitía una estimulación suficiente del crecimiento autocrino . Identificaron la importancia del preacondicionamiento del medio de cultivo por parte de las células cultivadas y concluyeron que un medio de cultivo celular suficiente para permitir el crecimiento infinito de un cultivo celular de alta densidad está de hecho «lejos de ser óptimo para el crecimiento de una sola célula». En consonancia con esto, Earle et al. describieron que la siembra del tipo de célula respectivo a una densidad muy baja provocaba la muerte de la célula, y este trabajo constituyó la base de la primera publicación sobre el crecimiento clonogénico de células de mamíferos in vitro realizada por Puck y Marcus en 1955. Inspirados por la necesidad de un medio de cultivo condicionado para facilitar el crecimiento de células individuales, utilizaron un sistema de co-cultivo de células individuales HeLa y una capa de células alimentadoras del mismo tipo fuertemente irradiadas. De acuerdo con los estudios anteriores, concluyeron que la inhibición del crecimiento de las células individuales en grandes volúmenes de ensayo se debía a la «pérdida de un factor difusible de corta duración». En publicaciones posteriores, como la de la primera curva de supervivencia de células de mamífero irradiadas, Puck y sus colegas omitieron con frecuencia el uso de capas alimentadoras, ya que habían desarrollado técnicas de cultivo avanzadas que permitían el crecimiento unicelular con un 100% de PE sin la suplementación del factor de crecimiento mediante células alimentadoras . Afirmaron que los protocolos de lavado y tripsinización cuidadosos eran esenciales en este sentido y acuñaron el término «acción cooperativa» para describir que las células en una placa de cultivo pueden diferir con respecto al genotipo así como al estado fisiológico . Nuestros resultados recapitulan estas observaciones: Dentro de un panel de 50 líneas celulares de cáncer, observamos que el crecimiento subóptimo de células individuales en medios de cultivo modernos y estandarizados suplementados con FCS sigue siendo un fenómeno muy común, como puede deducirse del hallazgo de que más de la mitad de las líneas celulares mostraron un comportamiento de crecimiento cooperativo. Por lo tanto, si se encuentran PE subóptimos para una determinada línea celular, es probable que el ensayo clonogénico detecte simultáneamente tanto la influencia del tratamiento de interés como el impacto de la cooperación celular. No entraba en el ámbito de este estudio identificar factores específicos de apoyo al crecimiento que pudieran afectar a los PE de las líneas celulares analizadas. Sin embargo, nuestra hipótesis es que las condiciones de crecimiento subóptimas para las células individuales de una determinada línea celular pueden ser el resultado de parámetros muy diferentes, como las bajas concentraciones de factores de crecimiento clásicos y/u hormonas (por ejemplo, el factor de crecimiento epidérmico o el estrógeno), pero también varios metabolitos de bajo y alto peso molecular para los que al menos una fracción de las células individuales muestra auxotrofia. Además, la suplementación de nutrientes de las células individuales en una placa de cultivo se verá probablemente influida por los parámetros fisicoquímicos del medio circundante y del material plástico, incluido el grado de unión a proteínas de los respectivos factores auxotróficos o su adsorción a la superficie del plástico. En teoría, este problema podría abordarse adoptando medidas que restablezcan el máximo de PE en condiciones de baja densidad, de modo que se (re)establezca una correlación lineal entre S y C (b = 1). Las recomendaciones de Puck sobre el uso de células alimentadoras, medios condicionados y/o la incrustación de células individuales en agar blando pueden ser suficientes para lograr esto para líneas celulares seleccionadas y deberían aumentar la solidez de los cálculos basados en PE en consecuencia. Sin embargo, es obvio que puede ser más que un reto refinar y estandarizar las condiciones del ensayo para que las tasas de supervivencia y crecimiento de las células individuales sean óptimas para cada tipo de célula individual de interés . Decidimos aceptar condiciones de ensayo subóptimas para el crecimiento de células individuales y, en su lugar, desarrollamos un método computacional para el análisis de datos de supervivencia clonogénica que tiene en cuenta este fenómeno bien descrito. Obviamente, nuestro enfoque que utiliza la regresión de potencia y la interpolación estaba más allá de las capacidades técnicas de los años 50, cuando los datos de supervivencia se ajustaban a ojo . Sin embargo, de alguna manera la relevancia de la cooperación celular pasó a un segundo plano durante las décadas siguientes. Aunque a lo largo del tiempo se informó de algunos informes sobre la no linealidad en los ensayos de formación de colonias, no se abordó el rendimiento limitado de los análisis basados en PE.
Interesantemente, estos estudios informaron sobre un aumento menos que lineal del número de colonias con el aumento del número de células sembradas para ciertos tipos de células en condiciones específicas. De acuerdo con esto, para algunas líneas celulares de nuestro panel también obtuvimos valores b ligeramente inferiores a 1,0. Esta observación puede explicarse en tres situaciones diferentes, de las cuales dos se deben a artefactos metodológicos: En primer lugar, los valores b ligeramente inferiores a 1,0 pueden ser el resultado del recuento de pocillos con un gran número de colonias sobrecrecidas en los que el investigador pasa por alto las colonias pequeñas (véanse los pocillos marcados con «nd» en la Fig. 1a). En segundo lugar, el crecimiento celular de los platos con un elevado número de células puede verse inhibido en fases bastante tempranas debido a una rápida disminución de la concentración de nutrientes, lo que da lugar a colonias abortivas. Una tercera opción, biológicamente menos intuitiva, es el comportamiento competitivo del crecimiento celular, por ejemplo debido a la secreción de factores inhibidores del crecimiento. Es importante destacar que cualquiera de estos fenómenos se tiene en cuenta en el enfoque de regresión e interpolación, ya que considera cualquier desviación de la linealidad como se refleja en el valor b.
Además, es notable que los valores b de varias líneas celulares para condiciones no tratadas en comparación con las irradiadas no son idénticos. En la mayoría de estos casos, los valores b de las células irradiadas tienden a ser más altos que los respectivos valores b de los controles no tratados, lo que indica que la cooperación celular aumenta con la irradiación. En consecuencia, el rango de valores de la fracción de supervivencia obtenido para C = 5 a 100 colonias se hace más amplio que en el caso de valores b casi idénticos (véanse las líneas celulares HCC1806 y A549). Esto implica que técnicamente no es posible extraer valores de supervivencia más precisos mediante el procedimiento de ensayo clonogénico, a menos que se seleccione un número fijo de colonias (C) para el análisis. Además, las líneas celulares con valores b excesivamente altos para las células tratadas pueden ser de especial interés para los estudios de resistencia a la terapia. Por ejemplo, el factor o factores de supervivencia inducidos por la radiación y secretados por un determinado tipo de célula podrían identificarse debido a un valor b correspondientemente alto.
En resumen, nuestros datos muestran la necesidad de analizar cuidadosamente los datos de los experimentos de formación de colonias y de considerar el impacto subestimado de la cooperación celular en los cálculos de la fracción de supervivencia. Esto puede aumentar en gran medida la fiabilidad del ensayo clonogénico-y la resistencia de cualquier hipótesis basada en él.