Receptor
El receptor de la eritropoyetina ha sido clonado mediante una estrategia de expresión a partir de una biblioteca de ADNc de células eritroleucémicas murinas (D’Andrea et al., 1989). El gen del receptor humano de la eritropoyetina está localizado en el cromosoma 19p (Winkelman et al., 1990). Tiene ocho exones y siete intrones, y codifica un péptido de 507 aminoácidos con un peso molecular de 66 kDa. En el gen humano, los exones 1-5 codifican el dominio extracelular de 251 aminoácidos, el exón 6 una región a-hélica que abarca la membrana de 20 aminoácidos, y los exones 7-8 el dominio citoplásmico de 236 aminoácidos (Youssoufian et al., 1993). El receptor humano de la eritropoyetina no tiene sitios de glicosilación ligados al N, pero sí una alta frecuencia de residuos de serina y treonina (Jones et al., 1990). Existe un 82% de identidad entre la eritropoyetina humana y la murina. La reticulación de la eritropoyetina a la superficie celular de las células eritroides ha revelado dos moléculas accesorias de 85 y 100 kDa que no son reconocidas por los anticuerpos anti-p66 (D’Andrea y Zon, 1990; Mayeux et al., 1991). Sin embargo, su función está por determinar.
El receptor de la eritropoyetina pertenece a la familia tipo 1 de receptores de citoquinas de una sola membrana. Esta familia comparte un dominio extracelular conservado compuesto por subdominios de fibronectina tipo III (FNIII), así como un motivo conservado de la cadena α de la caja citoplasmática 1 que se une selectivamente a las Janus quinasas (JAK) (Bazan, 1990b). La región extracelular del receptor de la eritropoyetina contiene dos subdominios FNIII (D1 y D2), que forman una forma de L, con el eje largo de cada dominio alineado a aproximadamente 90° respecto al otro eje. El dominio NH2-terminal D1 consta de cuatro filamentos a sobre cuatro, y el dominio D2 de siete filamentos a aniparalelos (Livnah et al., 1996). El dominio D1 forma un pliegue tipo h con una topología híbrida tipo FNIII/inmunoglobina, y dos pares distales de residuos de cisteína forman puentes disulfuro. El dominio D2 proximal a la membrana se pliega con una topología FNIII de tipo s estándar, y contiene un motivo WSXWS conservado (es decir, triptófano-serina-cualquier aminoácido-triptófano-serina), que es importante para el plegamiento del receptor de eritropoyetina (Quelle et al., 1992). Los dominios D1 y D2 aportan conjuntamente seis bucles para las interacciones de la eritropoyetina. La región citoplasmática que es rica en los aminoácidos prolina, glutamina y aspartasa contiene un dominio caja 1 (residuos 257-264) que es específico de JAK2 (Zhuang et al., 1994; Jiang et al., 1996), un dominio de caja 2 (residuos 303-313), y ocho sitios de fosfotirosina (Tyr 343, 401, 429, 431, 443, 460, 464, 479) que median el reclutamiento de efectores que codifican el dominio de homología 2 de Src (SH2). Una caja2 extendida (residuos 329-372) es esencial para la unión del receptor de tirosina quinasa KIT tras la activación por su ligando y provoca la fosforilación de tirosina del receptor de eritropoyetina, lo que indica una interacción funcional entre ambos receptores (Wu et al., 1995a). La eritropoyetina activa el receptor de eritropoyetina por dimerización (Philo et al., 1996). Una molécula p66 se une a la eritropoyetina con alta afinidad (Kd alrededor de 1 nM), la otra con una afinidad menor (Kd alrededor de 2 μM). Utilizando mutaciones y deleciones, se han mapeado los sitios activos de la eritropoyetina (Boissel et al., 1993; Wen et al., 1994; Elliott et al., 1997). Los anticuerpos monoclonales bivalentes, pero no monovalentes, dirigidos al dominio extracelular del receptor de la eritropoyetina inducen la proliferación de líneas celulares dependientes de la eritropoyetina y la formación de BFU-E, lo que sugiere una activación del receptor a través de su dimerización (Elliot et al., 1996). El mismo efecto puede obtenerse utilizando pequeños péptidos miméticos de la eritropoyetina (EMP) (Livnah et al., 1996; Wrighton et al., 1996). Aunque los PEM no comparten ninguna homología de secuencia con la eritropoyetina, se unen específicamente al receptor de la eritropoyetina. Las mutaciones puntuales en el dominio extracelular (R129C, E132C o E133C) forman enlaces disulfuro y también activan constitutivamente el receptor (Watowich et al., 1994). En particular, la mutación del residuo de arginina 129 en una cisteína es oncogénica e induce eritroleucemia (Longmore y Lodish, 1991). Por el contrario, EMP33 es capaz de dimerizar, pero no de activar, el receptor indicando un papel esencial del cambio conformacional en el receptor dimerizado para su señalización (Livnah et al., 1998; Remy et al., 1999). Se ha propuesto la existencia de dímeros de receptores inactivos preformados en la superficie celular, mediados por las regiones intermedias D1-D2 y que proporcionan una separación de 79 A en la base de sus dominios extracelulares (Livnah et al., 1996). Después de unirse a un agonista, los dominios extracelulares del receptor cambian su estructura en una orientación definida con una separación de 39 Å proporcionando un ajuste de sus componentes citoplasmáticos y dando lugar a la señalización (Wilson y Jolliffe, 1999).
Además de unirse a la eritropoyetina, el receptor de la eritropoyetina puede ser activado por otros mecanismos. La proteína de envoltura gp55 codificada por el virus Friend murino induce la eritroleucemia en ratones tras unirse al receptor de la eritropoyetina murina y activarlo (Wolff y Ruscetti, 1985; Li et al., 1990). Además, los péptidos sintéticos que no comparten ninguna homología de secuencia con la eritropoyetina son capaces de estimular el receptor de la eritropoyetina (véase más adelante).