Resultados
Rápida unión de ATP a GroEL como se revela por los cambios de intensidad de fluorescencia de GroEL F44C etiquetado con Oregon Green 488.
Para monitorizar la unión de ATP por GroEL, nos basamos en una variante de GroEL producida previamente, F44C, que contiene una sola cisteína en una versión de GroEL que de otro modo sería «cisteína-cero» y en la que las 3 cisteínas naturales de la subunidad GroEL (aminoácidos 138, 458 y 519) habían sido sustituidas por alanina (21). Como se ilustra en la Fig. 1A, F44 se encuentra en un bucle que apunta hacia arriba en la cavidad central de GroEL a nivel del dominio ecuatorial, posicionado entre hebras β antiparalelas ecuatoriales cerca de cuyos extremos hay residuos que forman contactos de enlace de hidrógeno con el fosfato terminal del ATP unido a través de una molécula de agua y un ion de potasio. El bucle y el residuo 44 están por tanto dispuestos a verse afectados por la ausencia frente a la presencia de ATP. Un estudio anterior informó de que una sustitución F44W podría informar sobre la unión del ATP (16). Aquí, utilizamos el mutante F44C, que ya se había observado que era totalmente funcional, como indicaba la capacidad de su plásmido codificador para rescatar el crecimiento de un mutante deficiente en GroEL y la capacidad de la proteína purificada para llevar a cabo un eficiente replegamiento de proteínas dependiente de ATP/GroES in vitro (21). La F44C se marcó con Oregon Green 488 (OG488)-maleimida a un nivel de ocupación ≈70%. Permaneció completamente funcional en la mediación del repliegue de la malato deshidrogenasa (MDH) in vitro, mostrando una cinética casi idéntica a la del WT GroEL . La tasa de recambio de ATP en estado estacionario por el mutante modificado, llamado EL44-OG, también se asemejó a la del WT GroEL (Fig. S1B).
El ATP se une rápidamente a GroEL no ligado y al anillo trans del complejo GroEL/GroES/ADP. (A) Diagrama de cintas de una porción del dominio ecuatorial de 1 subunidad de GroEL en el complejo GroEL/GroES/ADP/AlFx (ref. 24; código PDB ID: 1PCQ) que muestra la posición de F44. (B) Espectros de emisión de EL44-OG solo (trazo negro), mezclado con 500 μM de ADP (verde), y mezclado con 500 μM de ATP (rojo). La excitación fue a 496 nm. (C) Cambio en la fluorescencia de EL44-OG en la mezcla de flujo detenido con ATP. La traza podría ajustarse (línea blanca) como la suma de 2 exponenciales con las constantes de velocidad mostradas. El esquema indica la OG (verde) en los dominios ecuatoriales. (D) Dependencia de la tasa más rápida de cambio de fluorescencia en la concentración de ATP. Las constantes de velocidad de los experimentos como en C (negro) y E (rojo) a diferentes concentraciones de ATP se representan como una función de la concentración de ATP, dando líneas rectas con pendientes iguales a las respectivas constantes de velocidad de segundo orden para la unión de ATP, como se muestra. (E) Cambio en la fluorescencia del complejo EL44-OG/GroES/ADP en la mezcla de flujo detenido con ATP. D representa el ADP en el anillo cis, GroES está coloreado en gris, y el ATP (rojo) se muestra adyacente al anillo al que se une. (F) Como en E, pero con EL44-OG sin ligadura. (G) Como en E, pero con MDH unida al anillo trans, representado como una línea azul en el esquema. (H) Experimento de mezcla de flujo detenido similar al de E, excepto que GroEL en el complejo fue etiquetado con OG en la posición 315 en el exterior de los dominios apicales. En este caso, el trazado podría ajustarse como una sola exponencial con la tasa indicada. (I) Experimento de flujo detenido utilizando la versión de anillo único de GroEL, SR1, etiquetado con OG en una cisteína sustituida en la posición 315 (véase la Tabla S1 para un resumen de las tasas y amplitudes.)
Los espectros de emisión de fluorescencia de EL44-OG (excitados a 496 nm) revelaron que la adición de ATP produjo una gran caída en la intensidad de fluorescencia en estado estacionario (≈65% en 500 μM de ATP), acompañada de un pequeño desplazamiento azul del máximo de emisión (Fig. 1B). Por el contrario, el ADP produjo una caída menor de la intensidad, apoyando que el γ-fosfato del ATP tiene un efecto específico sobre la conformación del bucle que contiene 44.
Al mezclar a flujo detenido 0,5 mM de ATP con EL44-OG, se observó una rápida caída de la intensidad de la emisión, con una curva que podía ajustarse como la suma de 2 exponenciales, una con una constante de velocidad de ≈100 s-1 y otra con una constante de velocidad de 4 s-1 (Fig. 1C). La primera tasa indica una rápida interacción del ATP con el GroEL no ligado y corresponde a las tasas reportadas anteriormente tanto para F44W (ref. 16; 80 ± 5 s-1) como para otras 2 versiones de GroEL sustituidas por triptófano: Y485W, donde un triptófano fue sustituido en otra parte del dominio ecuatorial (ref. 18; 123 ± 2 s-1), y R231W (ref. 17; 80 s-1), donde se sustituyó un triptófano en el aspecto del dominio apical que mira a la cavidad (por lo demás, GroEL carece de triptófano). Como se esperaba, la velocidad de interacción del ATP con la EL44-OG dependía de la concentración de ATP (Fig. 1D), y se determinó una constante de velocidad bimolecular de 2 × 105 M-1 s-1 para la fase más rápida. La fase cinética más lenta, también dependiente de la concentración de ATP, probablemente corresponde a la tercera fase fluorescente observada para R231W e Y485W de GroEL en la unión al ATP (17, 18). La posibilidad de que esta fase reflejara la hidrólisis del ATP se excluyó empleando una chaperonina D398A/EL44-OG defectuosa para la hidrólisis.
Cambio de fluorescencia igualmente rápido en la unión del ATP al anillo trans abierto del complejo asimétrico GroEL/GroES/ADP.
En condiciones fisiológicas, el estado aceptor normal para el ATP es el anillo trans abierto de un complejo asimétrico GroEL/GroES/ADP. Con la mezcla de flujo detenido, observamos que la velocidad de unión del ATP al anillo trans de los complejos EL44-OG/GroES/ADP era similar a la de un anillo GroEL no ligado (Fig. 1E, compárese con la Fig. 1F). En este caso, también hubo una dependencia de la concentración de ATP similar a la del EL44-OG no ligado (Fig. 1D).
El polipéptido sustrato unido al anillo trans no afecta a la velocidad de unión del ATP.
En varios estudios in vitro, el polipéptido no nativo se ha unido primero al anillo trans abierto de un complejo ADP GroEL/GroES asimétrico antes de añadir ATP y un exceso de GroES (8, 9). En estas condiciones, la unión de ATP seguida de la unión de GroES es claramente capaz de encapsular el polipéptido no nativo y dirigir el plegado productivo. ¿Se ve afectada la velocidad de unión del ATP en este contexto por la proteína sustrato unida? Para comprobarlo, se unió la MDH no nativa a los complejos asimétricos EL44-OG/GroES/ADP, y a continuación se añadió ATP con una mezcla de flujo detenido. En estas condiciones, la tasa de cambio de intensidad de la fluorescencia fue prácticamente idéntica a la del complejo EL44-OG/GroES/ADP en ausencia de polipéptido (comparar la Fig. 1G con la Fig. 1E). Por lo tanto, la presencia de un sustrato no nativo unido a los dominios apicales del anillo trans no tiene ningún efecto detectable en la rápida entrada de ATP en los bolsillos de unión de nucleótidos ecuatoriales del anillo trans.
El rápido movimiento del dominio apical acompaña a la unión de ATP.
Cuando el ATP se une rápidamente a GroEL, ¿causa esto un ajuste significativo en los dominios apicales de unión al polipéptido en la misma escala de tiempo rápida, o son los cambios apicales en respuesta a la unión del ATP relativamente lentos, de tal manera que debe considerarse que los efectos de la unión del ATP ocurren en un momento posterior? El estudio anterior de R231W ya había indicado que los efectos apicales se producían rápidamente con ese mutante (17). También en el presente estudio, una sonda fluorescente en el aspecto exterior de los dominios apicales, alejada del sitio de unión al ATP en el interior del cilindro (GroEL E315C en un fondo de cisteína cero marcado con OG), mostró un rápido cambio en la intensidad de la fluorescencia, en la misma escala de tiempo que la unión al ATP. Por ejemplo, se observó una constante de velocidad de 20 s-1 para un complejo asimétrico GroEL315-OG/GroES/ADP a una concentración de ATP de 150 μM (Fig. 1H, comparar con 25 s-1 en la Fig. 1E). Dichos cambios apicales se produjeron en el mismo anillo al que está unido el ATP, ya que el análisis de una versión de E315C con un solo anillo modificado con OG, SR315-OG, mostró una tasa similar de cambio de intensidad de fluorescencia (Fig. 1I). La tasa de movimiento apical fue también dependiente de la concentración de ATP, con tasas paralelas a las de la unión de ATP (Fig. S2, compárese con la Fig. 1D).
Unión relativamente lenta del polipéptido sustrato medida por FRET.
Para permitir una comparación de la tasa de unión del polipéptido sustrato no nativo con la de la unión de ATP, medimos a continuación la tasa de unión de las proteínas sustrato a los complejos asimétricos GroEL/GroES/ADP utilizando FRET. Se estudiaron tres proteínas sustrato diferentes: MDH (33 kDa), Rubisco (51 kDa) y una forma doblemente mutante de la proteína de unión a la maltosa (DM-MBP; 41 kDa). Las 3 proteínas se comportan como proteínas sustrato estrictas a 25 °C, requiriendo la presencia de GroEL, GroES y ATP para alcanzar la forma nativa (3). En su ausencia, se produce una agregación cuantitativa. Para monitorizar la unión, se midió la FRET entre la proteína sustrato marcada con cumarina propil maleimida (CPM; donante) en un residuo de cisteína (ver Materiales y Métodos) y EL44-OG (aceptor). Excitando al máximo de excitación para CPM (384 nm), se recogieron los espectros de emisión para los sustratos marcados con CPM (donante) mientras estaban unidos a GroEL sin marcar (Fig. 2A, DM-MBP-CPM como ejemplo, trazo negro), para EL44-OG complejado con sustrato sin marcar (Fig. 2A, aceptor marcado, trazo azul), o para complejos con sustrato marcado con CPM unido a EL44-OG (Fig. 2A, trazo rojo). Tanto para DM-MBP-CPM como para MDH-CPM, hubo un fuerte apagamiento del donante en la asociación con EL44-OG; al mismo tiempo, hubo la aparición de una señal sustancial del aceptor.
Unión relativamente lenta de un sustrato no nativo, DM-MBP, a GroEL no ligado y al anillo trans del complejo GroEL/GroES/ADP. (A) Espectro de emisión de DM-MBP marcado con CPM (donante) mientras está unido a GroEL (D, trazo negro), espectro de emisión de EL44-OG (aceptor) mientras está complejado con DM-MBP no nativo (A, trazo azul), y espectro de emisión del complejo de DM-MBP-CPM con EL44-OG (D-A, trazo rojo), todos excitados a 384 nm, el máximo de excitación para CPM. (B) Cambio en la fluorescencia del canal donante en la mezcla de flujo detenido de DM-MBP-CPM no nativo con EL44-OG. La línea azul representa la DM-MBP no nativa, y la D en el círculo amarillo representa la etiqueta CPM. (C) Dependencia de la constante de velocidad más rápida para la unión de DM-MBP con la concentración de GroEL. Las constantes de velocidad de los experimentos como en B a diferentes concentraciones de GroEL (negro) o de experimentos similares utilizando el complejo GroEL/GroES/ADP (rojo) se representan frente a la concentración de GroEL, dando lugar a líneas rectas con pendientes (constantes de velocidad de segundo orden) de 6,11 × 106 M-1s-1 y 5,36 × 106 M-1s-1, respectivamente. (D) Cambio en la fluorescencia del donante en la mezcla de flujo detenido de DM-MBP-CPM no nativo con el complejo EL44-OG/GroES/ADP y 500 μM de ATP. En múltiples experimentos (n = 6), la tasa de la fase más rápida fue consistentemente ligeramente más rápida para el anillo trans en presencia de ATP que en su ausencia: 2,08 ± 0,11 frente a 1,36 ± 0,22 (Tabla S2).
Al mezclar a flujo detenido 125 nM DM-MBP-CPM con 125 nM EL44-OG, se observó una caída de la intensidad de la emisión del donante, con una curva que podía ajustarse como la suma de 2 exponenciales, una con una constante de velocidad de 1,33 s-1 y la otra con una constante de velocidad de 0,65 s-1 (Fig. 2B). La tasa más rápida (k1) dependía de la concentración de chaperonina (Fig. 2C), pero la más lenta no. A una concentración de GroEL de 125 nM (Fig. 2B), la tasa de unión del polipéptido sustrato (k1 = 1,33 s-1) es 60 veces más lenta que la tasa de unión del ATP (100 s-1 a 500 μM de ATP; Fig. 1C). Aunque se prevé que la tasa de unión del sustrato sea varias veces mayor a la concentración fisiológica de GroEL de 1-2 μM (Fig. 2C), la tasa de unión del ATP también sería probablemente algo mayor, considerando que la concentración fisiológica de ATP es de varios milimoles (Fig. 1D). Por lo tanto, es probable que la tasa de llegada de ATP en condiciones fisiológicas sea al menos 10 veces mayor que la llegada de sustrato.
En una prueba adicional, la adición de ATP al mismo tiempo que la DM-MBP marcada con fluorescencia tuvo un efecto reproducible de aumento de la tasa de unión de DM-MBP (Fig. 2D y Tabla S2). En resumen, el orden fisiológico de la adición a un anillo trans parece comprender la llegada rápida del ATP seguida de la llegada más lenta de la proteína sustrato. Este orden es opuesto al programado en estudios recientes, en los que el polipéptido se unía inicialmente al anillo trans y luego se añadía el ATP (8, 9). ¿Tiene el orden de adición algún efecto medible en el replegado de la proteína sustrato? Para comprobarlo, llevamos a cabo experimentos de orden de adición y medimos la recuperación de la enzima nativa en condiciones esencialmente de una sola vuelta.
Se recupera más ampliamente el estado nativo cuando se añade primero el ATP, seguido del polipéptido, en comparación con el orden opuesto.
Se llevó a cabo un experimento de orden de adición utilizando la versión de un solo anillo de GroEL, SR1, lo que permitió un análisis de «una sola vuelta». El polipéptido capturado por SR1 se pliega casi cuantitativamente a su forma nativa, tras la unión de GroES, dentro de la cavidad cis de larga duración del complejo estable SR1/GroES (10, 11). Así, SR1 podía incubarse con ATP y polipéptido no nativo en cualquier orden, seguido de la adición de GroES, y el grado de recuperación de la proteína nativa podía medirse en relación tanto con el orden de adición como con el intervalo entre las adiciones (Fig. 3A). Para estas pruebas, el GroES se añadió 2 segundos después del ATP/polipéptido para permitir la finalización de las interacciones iniciales. En un experimento inicial, observamos de forma reproducible que cuando se añadía primero la Rubisco no nativa seguida 2 seg después por el ATP, el grado de recuperación de la Rubisco en forma nativa era sólo ≈30%. Esto se comparó con una recuperación de >60% cuando se añadió primero el ATP y con la recuperación de ≈70% observada cuando se añadieron ATP y GroES a un complejo binario Rubisco-SR1 preformado (producido por una incubación de 10 minutos de Rubisco no nativa con SR1). Esto sugiere que en el contexto de una reacción cíclica en la que el anillo trans de un complejo aceptor GroEL/GroES/ADP está abierto y disponible para la unión del polipéptido durante sólo ≈1-2 s antes de que GroES se una, la movilización de sus dominios apicales por la rápida unión del ATP favorece la unión del polipéptido no nativo. El orden opuesto, la adición del polipéptido 2 s antes del ATP, parecía ser menos favorable para la unión, aunque los dominios apicales movilizados por el ATP estuvieran posteriormente disponibles durante 2 s antes de la adición de GroES. Notablemente, cuando el intervalo entre las adiciones de Rubisco y ATP se incrementó a 4 s (Fig. 3A), el efecto del orden de adición se alivió, con la cinética y la extensión de la recuperación ahora igual a las de la adición de ATP primero, presumiblemente una función de la unión más extensa del polipéptido durante el intervalo antes de la adición de ATP. Aunque el grado de recuperación de la Rubisco en los estudios de orden de adición con un intervalo de 2 s se vio significativamente afectado, la cinética de recuperación del estado nativo dentro de los complejos estables SR1/GroES fue similar, lo que es consistente con un efecto sobre la unión de la proteína sustrato y no sobre la tasa de plegado en la cámara encapsulada.
La unión del ATP antes de la Rubisco no nativa mejora el rendimiento de plegado al aumentar la extensión y la tasa de unión. (A) Recuperación de la actividad de Rubisco con diferentes órdenes de adición. SR1 se incubó con ATP durante 2 o 4 s antes de añadir la Rubisco no nativa (dRUB); alternativamente, la Rubisco no nativa se añadió a SR1 primero, seguida de ATP 2 o 4 s después. En ambos casos, se añadió GroES 2 s más tarde y se extrajeron alícuotas a los tiempos indicados para analizar la actividad de la Rubisco. Para comparar, se llevó a cabo un ensayo «estándar» de replegamiento de Rubisco incubando SR1 con Rubisco no nativa durante 10 minutos antes de añadir ATP y GroES juntos para iniciar el replegamiento (símbolos negros). (B) Grado de unión de 35S-Rubisco a SR1 con diferentes órdenes de adición. Los experimentos se llevaron a cabo con los diferentes órdenes de adición como en A, excepto que después de añadir GroES y luego ADP-AlFx (para estabilizar el complejo ternario), las mezclas se cromatografiaron en una columna Superose 6 y se determinó la radiactividad de las fracciones. La radiactividad total recuperada en la posición de elución del complejo SR1/GroES/ADP-AlFx/Rubisco se reporta como un porcentaje de la radiactividad cargada en la columna. En análisis idénticos con intervalos de 4 s, ambos órdenes de adición produjeron una recuperación de ≈70%, correspondiente a la recuperación de la actividad en A (no mostrado). (C) Tasa de unión de la Rubisco a un anillo SR1 en ausencia de ATP, medida por FRET. Fluorescencia donante de Rubisco-CPM después de la mezcla de flujo detenido con una molécula SR1 D398A defectuosa por hidrólisis que lleva el fluoróforo OG en una Cys-44 sustituida. (D) Velocidad de unión de la Rubisco a la SR398A en presencia de ATP (añadido antes de la carga en la jeringa de flujo detenido). (E) Tasa de unión de la Rubisco a un anillo SR398A cuando se añade simultáneamente con ATP.
Una unión más extensa de la Rubisco con ATP añadido primero.
Para abordar el efecto del orden de adición en la unión de la proteína del sustrato, utilizamos Rubisco marcada con 35S y medimos la cantidad que se unió a SR1 durante las incubaciones del orden de adición utilizando la filtración en gel de las mezclas del producto final para separar los complejos estables SR1/GroES/Rubisco del polipéptido no unido. Esto reveló que ≈10.000 cpm de 35S-Rubisco se habían unido cuando se añadieron 40.000 cpm de 35S-Rubisco (125 nM) 2 segundos antes del ATP y que ≈30.000 cpm se habían unido cuando se añadió ATP 2 segundos antes de Rubisco (Fig. 3B). Este último grado de unión también se logró cuando los complejos binarios SR1-Rubisco formados durante un período de 10 min se incubaron con ATP y GroES juntos (Fig. 3B). Estas mediciones de la extensión de la unión del sustrato son, por tanto, paralelas a la extensión de la recuperación de la actividad enzimática (compárese la Fig. 3B con la Fig. 3A) y apoyan la conclusión de que en el contexto de un intervalo de 2 s entre la adición de ATP/polipéptido, la adición de ATP favorece inicialmente una unión más eficiente de la proteína sustrato.
Mayor tasa de unión de la Rubisco a un anillo de chaperonina expuesto al ATP.
La observación anterior de una mayor extensión de la unión de la Rubisco en un experimento de orden de adición en el que se añade inicialmente el ATP sugiere que la tasa de asociación de la Rubisco con los dominios apicales movilizados por el ATP podría ser mayor. Para comprobarlo, se utilizó una versión D398A de SR1 defectuosa en hidrólisis de ATP con OG unido a una cisteína sustituida en la posición 44 (en un fondo C138A) para informar mediante FRET de la tasa de unión de Rubisco marcada con CPM (Fig. 3 C-E). Observamos que la tasa de unión de la Rubisco, llevada a cabo con las mismas condiciones que los experimentos de orden de adición anteriores, era 2 veces mayor en presencia frente a la ausencia de ATP (comparar la Fig. 3D con la Fig. 3C). Cuando el ATP y la Rubisco no nativa se añadieron simultáneamente, reflejando la situación fisiológica, la tasa de unión de la Rubisco se asemejó a la de cuando el ATP se había añadido antes de la Rubisco (Fig. 3E, comparar con la Fig. 3D). Estos datos apoyan que la Rubisco se asocia más rápidamente con un anillo cuyos dominios apicales han sido movilizados por el ATP y que, en condiciones fisiológicas en las que tanto el ATP como el sustrato no nativo están presentes, son los dominios apicales movilizados por el ATP los que operan en la unión del sustrato.