Resultados
Informamos de la demografía y el fenotipo clínico de 36 pacientes con AME confirmados genéticamente del Consorcio Internacional de Trastornos Esteroides Raros. La mayoría de los pacientes eran de ascendencia omaní (22 de 36) y persa (6 de 36), y el 75% procedían de matrimonios consanguíneos, principalmente dentro de Omán (Fig. 1B y Tabla S1). La edad media del diagnóstico de AME fue de 4,6 años (rango: 0,1-15) y la cohorte se distribuyó por igual para ambos sexos. La mayoría de los pacientes (86%) nacieron a término, y el 76% eran pequeños para la edad gestacional. La Fig. 1A muestra que, en nuestra cohorte, había seis mutaciones de sentido erróneo, una de inserción, dos de deleción y tres de cambio de marco, y dos indels. Como era de esperar por la fisiopatología de la AME, la presión arterial media que se presentaba estaba elevada por encima del percentil 90 en todos los sujetos (Fig. 1C). El nivel medio de potasio sérico en el momento del diagnóstico era bajo, 2,72 mmol/L (rango: 1,5-4,1 mmol/L), mientras que el bicarbonato sérico era alto, 29,5 mmol/L (rango: 20-38 mmol/L) (Fig. 1 D y E). Los niveles de aldosterona sérica eran previsiblemente bajos (Fig. 1F), con dos pacientes con niveles elevados por razones poco claras. Además, los niveles de renina eran bajos, excepto en dos pacientes (10,4 y 14 ng/mL/h) que estaban en tratamiento (Tabla S1). En un subconjunto de 29 pacientes, la media del ratio (THF + alloTHF)/THE, que representa los principales metabolitos urinarios del cortisol y la cortisona, estaba significativamente elevada en 19 (rango: 3-55, normal: 1,0) (Fig. 1G). Cabe destacar que 27 de los 36 (75%) pacientes también presentaban nefrocalcinosis. La nefrocalcinosis puede surgir de una hipocalcemia crónica de larga duración como se ha observado, por ejemplo, en el síndrome de Bartter tipo III (14).
Para comprender si el fenotipo clínico de la deficiencia de HSD11B2 podría predecirse examinando los cambios en la estructura de la enzima inducidos por una determinada mutación de HSD11B2, realizamos análisis in silico utilizando tres HSD17B1 estrogénicos que presentaban una similitud de secuencia del 27% con HSD11B2 en 284 aminoácidos (Fig. S1A). El modelo de la HSD11B2 humana mostraba un motivo de pliegue de Rossmann conservado característico de unión a NAD (Fig. S1B) con un sitio de unión a sustrato adyacente (Fig. S1 C y D). Las simulaciones MD de 500 ns de las formas monoméricas y diméricas de HSD11B2 indicaron un modelo estable con una proteína plegada de forma estable (Fig. S1 E-H). Utilizamos el software Internal Coordinate Modeling (ICM) (www.molsoft.com) (18) para determinar la ΔΔG de las mutaciones sin sentido encontradas en pacientes con AME o las mutaciones diseñadas experimentalmente. Todas las mutaciones (Fig. 2A) mostraron un aumento de los valores de ΔΔG, lo que sugiere la pérdida de estabilidad y función de la proteína (Fig. 2B).
Mutaciones disruptivas que afectan a la interfaz del dímero de HSD11B2. (A) Modelo de dímero de HSD11B2 humano construido utilizando las estructuras cristalinas existentes de HSD17B1: 1IOL (cocristalizada con 17β-estradiol) que fue la estructura más completa, sin residuos faltantes; 1JTV (1,5 Å) que fue cocristalizada con testosterona y exhibió mayor resolución que 1IOL (2,3 Å); y 1FDV que fue cocristalizada con la coenzima NAD. Se indican las posiciones de todos los residuos mutados conocidos. (B) Valores de ∆∆G para mutaciones severas (rojo) o leves (negro) de HSD11B2. (C) En la interfaz del dímero, se forman dos pares de iones R186-E190 entre la doble simetría invertida de las subunidades adyacentes. En el caso del monómero (D), se forma un par de iones intrahelicoidal, que es similar al puente salino R112 y E120 formado en las plantillas de la HSD17B1. (E) Posiciones espaciales de las mutaciones (azul) mapeadas en una subunidad. Las dos subunidades están claramente coloreadas (marrón y azul). El NAD+ (amarillo) y el cortisol (verde) se ilustran como palos. La interacción ion-par en la interfaz del dímero es estable a lo largo de la simulación de 500 ns (F). Sin embargo, se observa cierta fluctuación en la interacción intrahelical debido a los cambios conformacionales del monómero (G). (H) R186 hace interacciones de par de iones con E190 de la subunidad adyacente. La mutación R186C provoca la pérdida de la interacción del par de iones. También se pierde un par de iones intrahelicoidal formado entre R186 y E190 en el monómero. (I) La mutación A237V aumenta la hidrofobicidad en la interfaz. (J) D244 forma una interacción de par iónico intrasubunidad con R336, así como enlaces de hidrógeno con R360 de la subunidad adyacente. La cadena lateral polar no cargada de la asparagina en el mutante es incapaz de proporcionar estabilidad estructural. (K) El grupo OH de la mutación L251S establece un enlace de hidrógeno con R361 de la subunidad adyacente, mejorando así la interacción en la interfaz del dímero. (L) El enlace de hidrógeno formado entre D176N y T200 mejora el estado de dímero inactivo.
HSD11B2 existe como un homodímero en su estado inactivo (13). Cuatro residuos, a saber, R186, E190, A237 y R336, se encuentran en la interfaz del dímero y, por tanto, podrían interferir en la formación del dímero (Fig. 2C). Los residuos R186 y E190 están situados en la interfaz del dímero en la hélice α4. Se forma una interacción de par iónico intersubunidad (R186-E190) como resultado de la doble simetría invertida de la subunidad adyacente (Fig. 2D), similar al par iónico R112-E120 en HSD17B1 (15⇓-17). Es importante destacar que esta interacción resultó ser estable y se mantuvo a lo largo de las simulaciones MD de 500 ns (Fig. 2 E-G). Además, se encontró que la interacción estabiliza la hélice α4 y mantiene la flexibilidad alrededor del sitio de unión a la coenzima. Así, la mutación R186C provoca la pérdida del par iónico intersubunidad y empuja el equilibrio hacia la formación de una enzima monomérica activa (Fig. 2H). También impide la formación de la interacción del par iónico intrahelicoidal y, por tanto, permite la desestabilización de los elementos estructurales alrededor del sitio de unión a la coenzima.
Hay varias otras mutaciones disruptivas en esta interfaz del dímero que implican a los residuos A237, D244, L251 y D176. El residuo A237 está rodeado por L241 y V239 de ambas subunidades HSD11B2. Su mutación a Val aumenta la hidrofobicidad de este grupo y refuerza el estado dimérico inactivo de la enzima (Fig. 2I). El residuo D244 no sólo crea un puente salino intrasubunidad con R336 que mantiene unidas la hélice α5 y las láminas β7, sino que también crea interacciones de enlace de hidrógeno con R360 de la subunidad adyacente (Fig. 2J). Su mutación a Asn disminuye la fuerza de la interacción R360, lo que lleva a la pérdida del puente salino con R366; esto, a su vez, perjudica la estabilidad de la proteína. Del mismo modo, la mutación de la cadena lateral hidrofóbica L251 a un grupo hidroxilo de Ser aumenta la polaridad y forma un enlace de hidrógeno con los grupos de la cadena lateral cargada positivamente de R361; esto mejora la unión del dímero (Fig. 2K). Finalmente, la mutación de D176 a Asn crea un enlace de hidrógeno entre la asparagina y T200, potenciando así el estado de dímero inactivo (Fig. 2L).
Las mutaciones de los residuos de la HSD11B2 que forman el bolsillo de unión del sustrato o de la coenzima (NAD+) han demostrado en estudios in vitro que eliminan la actividad de la enzima (19) y causan una AME grave. Por ejemplo, Y226 está situado en el bolsillo de unión al sustrato (Fig. 3A). La cadena lateral fenólica aromática forma interacciones hidrofóbicas con el anillo aromático del sustrato. La mutación Y226N sustituye este residuo por un residuo no aromático, lo que resulta en la pérdida del apilamiento hidrofóbico, que interfiere con la unión al sustrato (Fig. 3A). Además, esta mutación cambia la cadena lateral de hidrofóbica a hidrofílica, lo que es desfavorable para la unión de un sustrato hidrofóbico. La mutación A221V sustituye la cadena lateral corta por una cadena lateral ligeramente más voluminosa de Val, interfiriendo así con la unión del sustrato al reducir el volumen del bolsillo, mientras que la mutación A221G disminuye la hidrofobicidad e introduce flexibilidad alrededor del bolsillo de unión rígido (Fig. 3B).
Interferencia con la unión de coenzimas o sustratos a la HSD11B2. (A) La tirosina en la posición 226 forma la pared del sitio de unión al sustrato e imparte hidrofobicidad. Una mutación en N226 da lugar a una pérdida de apilamiento hidrofóbico que la hace desfavorable para la unión al sustrato. (B) La mutación A221V reduce el volumen del bolsillo de unión al sustrato, mientras que la A221G aumenta la flexibilidad alrededor del sitio de unión. (C) En la mutación L179R, la cadena lateral de guanidinio cargada positivamente hace enlaces de hidrógeno con las cadenas de tamaño de T184 y E172, reduciendo así la flexibilidad alrededor del sitio de unión a NAD+. (D) La cadena lateral de hidroxifenilo de Y232 hace enlaces de hidrógeno con el grupo hidroxilo del azúcar ribosa y la cadena lateral de N171. Estos enlaces de hidrógeno son esenciales, ya que no se toleran las mutaciones en fenilalanina, serina o cisteína. La mutación a la fenilalanina elimina el grupo hidroxilo y conduce a la pérdida del enlace de hidrógeno, mientras que la mutación a la serina con una cadena lateral más corta da lugar a una mayor distancia del grupo OH del NAD+, y de nuevo impide el enlace de hidrógeno efectivo; ambas mutaciones dan lugar a una enzima inactiva. (E) La cadena lateral carboxilo del ácido aspártico en la mutación G89D provoca graves choques estéricos con la fracción de azúcar ribosa de la adenosina en el NAD y afecta a la unión de la coenzima. (F) La cadena lateral más voluminosa en la mutación K236R disminuye el tamaño del bolsillo de unión a la coenzima, haciéndolo desfavorable para la unión óptima del NAD+.
Nuestro modelo muestra que el grupo polar 17-OH en el cortisol está metido en una región hidrofóbica rodeada por Y226, P227 y L229. Este grupo hidroxilo está ausente en la corticosterona, lo que da lugar a un aumento de las interacciones hidrofóbicas y a una afinidad de unión a la HSD11B2 ∼10 veces mayor en comparación con el cortisol (Fig. S2A). Además del riñón, la HSD11B2 también se expresa en la placenta. Aunque el receptor mineralocorticoide no se expresa en este tejido, la HSD11B2 inactiva el cortisol para eliminar sus efectos inhibidores del crecimiento y proapoptóticos durante el desarrollo embrionario. Durante el embarazo, el alto nivel de progesterona en la circulación materna puede unirse a la actividad de la HSD11B2 y modularla. Esto puede traducirse en los efectos de cualquier mutación de pérdida de función que interrumpa la unión a la progesterona en el peso al nacer. Por ejemplo, la mutación A221V afecta gravemente a la unión de la progesterona más que al cortisol debido a los choques estéricos entre Val y los grupos metilo salientes en la progesterona (Fig. S2B). De manera muy interesante, encontramos que las dos pacientes con las mutaciones A221V eran pequeñas para la edad gestacional (Tabla S1). Asimismo, la mutación A221G afecta a la unión de la progesterona de forma indirecta al alterar la estructura del sitio de unión. Del mismo modo, la mutación Y226N es más perjudicial para la unión de la progesterona, ya que reduce las interacciones hidrofóbicas entre el esqueleto de la progesterona y el anillo hidroxifenilo de la tirosina (Fig. S2B). Por el contrario, P227 proporciona un soporte estructural indirecto al sitio de unión, y la mutación a Leu tiene efectos similares tanto para el cortisol como para la progesterona (Fig. S2B).
Hay cuatro mutaciones que residen en el sitio de unión a la coenzima y lo interrumpen, perjudicando así gravemente la actividad de la HSD11B2. La cadena lateral del residuo L179 está normalmente posicionada espacialmente en un giro corto entre la hoja β4 y la hélice α4 (Fig. 3C). Al permitir las interacciones con las cadenas laterales hidrofóbicas de V174 y L282, estas interacciones hacen que el sitio de unión a la coenzima sea más flexible. La mutación a Arg introduce una cadena lateral de guanidinio, que permite interacciones con la cadena lateral del grupo carboxilo de E172 y la cadena lateral del grupo hidroxilo de T184 (Fig. 3C), introduciendo así rigidez en el giro y disminuyendo la flexibilidad necesaria para la función óptima de la enzima (7). Situado en el bolsillo de unión a la coenzima, Y232 es un residuo muy conservado en el motivo del pliegue de Rossmann (20), lo que sugiere que su mutación será perjudicial para la actividad de la enzima (21). La cadena lateral hidroxilo-fenilo de Y232 forma importantes enlaces de hidrógeno con N171 y NAD+, manteniendo la coenzima en la posición correcta para su función catalítica (Fig. 3D). Esta interacción está interrumpida en la mutación Y232C, que provoca una AME grave. La importancia de este residuo en la actividad de la enzima ha sido confirmada independientemente por varias mutaciones de ingeniería (21) (Fig. 3D). En la mutación G89D, la cadena lateral carboxilo de Asp presenta graves choques estéricos con la fracción de azúcar ribosa de la adenosina, lo que afecta a la unión del NAD+ (Fig. 3E). Otra mutación de ingeniería K236R conduce a la interrupción de la unión del NAD (Fig. 3F). Aunque conserva la capacidad de interactuar con el NAD+ mediante enlaces de hidrógeno, la mutación suprime la actividad de la enzima (21).
Las alteraciones de la estabilidad estructural de la HSD11B2 alteran su estructura terciaria, causando una marcada atenuación de la actividad de la enzima y una grave AME. El residuo L250 está situado en la hélice α5, y sus cadenas laterales se sitúan en un apretado bolsillo hidrofóbico rodeado por las cadenas laterales de L204, F246, W253, V255 y V257 (Fig. 4A). Los residuos del bolsillo hidrofóbico están bloqueados por una interacción de par de iones entre R208 y E249. La introducción de una cadena lateral Pro rompe la hélice α5 introduciendo rigidez. Este bolsillo también es demasiado estrecho para acomodar la gran y voluminosa cadena lateral de guanidinio de Arg (Fig. 4A). La consiguiente pérdida de hidrofobicidad en esta región afecta a la estabilidad estructural. Otra interacción estable de pares de iones intrahelicoidal se forma entre D144 y R147 (Fig. 4B). Esta interacción permite que la hélice α3 se empaquete firmemente con las hojas β adyacentes cerca del sitio de unión al NAD+. La mutación D144V provoca la pérdida de esta interacción y desestabiliza la disposición del empaquetamiento (Fig. 4B). El empaquetamiento hidrofóbico también se interrumpe en la mutación F185S, cuando la cadena lateral aromática de la fenilalanina, rodeada por los residuos hidrofóbicos de V182, C188 y M189, se sustituye por una cadena lateral polar de serina (Fig. 4C). Del mismo modo, la cadena lateral hidrofóbica de L363, rodeada por M347, I350 y F362, se posiciona en una hélice-giro-hélice (Fig. 4D). La mutación L363P interrumpe la hélice y el entorno estructural local.
Mutaciones que afectan a la estabilidad de HSD11B2. (A) L250 se sitúa en la hélice α5 y la cadena lateral está rodeada en un bolsillo hidrofóbico constreñido. No se tolera una mutación a arginina o prolina voluminosa que introduzca una distorsión de la hélice. (B) La mutación D144V da lugar a la pérdida de la interacción del par de iones D144-R147 y desestabiliza la disposición de la hélice α3 cerca del sitio de unión al NAD. (C) La cadena lateral polar en la mutación F185S interrumpe el empaquetamiento hidrofóbico formado por V182, C188 y M189. (D) El residuo hidrofóbico L363 se sitúa en una hélice-giro-hélice, rodeada por M347, I350 y F362. La mutación a prolina interrumpe la hélice y el entorno estructural local. (E) En el mutante A328V, la cadena lateral de la valina presenta choques estéricos dentro del bolsillo hidrofóbico. (F) La cadena lateral del grupo hidroxilo de S180 realiza interacciones con los átomos del esqueleto y la cadena lateral de T184. Una cadena lateral de fenilalanina suprime estas interacciones e imparte flexibilidad al bucle. (G) Las interacciones de pares de iones R208-E249 mantienen unidas las hélices α4 y α5. Los mutantes R208H/C son incapaces de formar esta interacción. (H) La cadena lateral carboxilo de D223 establece enlaces de hidrógeno con las cadenas laterales de Q261 y R337. La mutación a Asn interrumpe el enlace de hidrógeno con R337. (I) La mutación R213C provoca la pérdida de las interacciones de enlace de hidrógeno formadas entre la cadena lateral de la arginina y los átomos de la columna vertebral de A331 y L329. (J) R337 hace una interacción de par de iones con D223 y también un enlace de hidrógeno con Y339. Mientras que la cadena lateral de la lisina conserva una capacidad reducida de formar un enlace de hidrógeno con Y339, una mutación a histidina, cisteína o alanina suprime completamente la interacción de par iónico R337-D223. (K) La cadena lateral hidroxifenil de Y338 realiza enlaces de hidrógeno con los átomos de la columna vertebral de D327 y A328. Estas interacciones mantienen las posiciones espaciales de α7 y β7. Una mutación a histidina o fenilalanina resulta en la pérdida de estas interacciones e introduce flexibilidad.
Además, varias mutaciones pueden interrumpir el empaquetamiento de la proteína HSD11B2 para perjudicar la estabilidad mediante la introducción de un residuo más voluminoso. El residuo A328 forma una interacción hidrofóbica con V215, I260, I325 e Y338 (Fig. 4E). Al sustituir la alanina por un residuo Val más voluminoso, la mutación A328V provoca choques estéricos con la cadena lateral de I260 e Y338 de las hojas β circundantes (Fig. 4E). El residuo S180 está situado en un bucle y su cadena lateral del grupo hidroxilo interactúa con la cadena lateral y el nitrógeno de la columna vertebral de T184 (Fig. 4F). Esta cadena lateral se encuentra dentro de un espacio muy estrecho y restringe el alojamiento de cualquier residuo más voluminoso, lo que provoca choques estéricos, de hecho, sin alterar la estructura de la proteína. Así, una cadena lateral Phe con un anillo aromático voluminoso, como en la mutación S180F, no se tolera en esta posición (Fig. 4F).
Múltiples enlaces de hidrógeno y puentes salinos entre residuos polares estabilizan la estructura terciaria de la enzima HSD11B2. Ciertas mutaciones provocan una pérdida de estas interacciones, dando lugar a una enzima inactiva y a una AME grave. Por ejemplo, el puente salino entre R208 y E249 es crítico (Fig. 4G). Su pérdida, como en el caso de las mutaciones R208C y R208H, desestabiliza la proteína y provoca una enfermedad grave (Fig. 4G). Del mismo modo, D223 forma un puente salino con R337 (Fig. 4H). Al sustituir este puente salino por un enlace menos fuerte, un enlace de hidrógeno, la mutación D223N cambia el residuo cargado negativamente por un residuo polar sin carga, lo que resulta en una marcada atenuación de la actividad in vitro (22). Esto también sugiere que el puente salino juega un papel crucial en el mantenimiento de la estabilidad y la actividad de la HSD11B2. Las cadenas laterales de R213 forman enlaces de hidrógeno con los átomos de la columna vertebral de los residuos A331 y L329 (Fig. 4I). Al disminuir estos enlaces de hidrógeno, que ayudan a mantener la estructura terciaria de la proteína, la mutación R213C perjudica la estabilidad de la enzima (Fig. 4I).
El grupo Arg/Tyr de los residuos 335-339 se ha implicado previamente en el mantenimiento de la estabilidad de la proteína, aunque el mecanismo preciso no ha quedado claro (23). Se han notificado mutaciones que afectan a estos residuos en pacientes con AME, incluyendo R337C e Y338H. Las simulaciones de los modelos monomérico y dimérico de HSD11B2 sugieren que el residuo R337 forma una interacción de puente salino con D223 y enlaces de hidrógeno con el grupo OH de Y339 (Fig. 4J). Sus interacciones parecen ser importantes para mantener el correcto plegamiento y la estabilidad de la proteína. Por lo tanto, su mutación a Cys suprime tanto el puente salino como el enlace de hidrógeno para desestabilizar la enzima y causar una grave AME. Las mutaciones genéticas de este residuo muestran además que la R337K, que mantiene la polaridad y la carga positiva, reduce la actividad de la enzima en un 70%, mientras que la R337A, que es similar a la R337C por tener cadenas laterales cortas y sin carga, inactiva completamente la HSD11B2 (23) (Fig. 4J). En el mismo grupo Arg/Tyr, la mutación de Y338 a His inactiva la enzima causando una AME severa. Nuestro modelo sugiere que este residuo Tyr forma interacciones hidrofóbicas con A328 y enlaces de hidrógeno con D327 (Fig. 4K). Ambas interacciones ayudan a mantener la estabilidad de la proteína, de modo que la sustitución de Tyr por His, por ejemplo, inactiva la HSD11B2. Esto se debe a que, aunque Y338H conserva la capacidad de enlace de hidrógeno, tiene cadenas laterales más cortas que desestabilizan la enzima. Del mismo modo, no se tolera la sustitución de Tyr por Phe en una construcción de ingeniería Y338F. En este caso, se conservan las interacciones hidrofóbicas pero se suprime el enlace de hidrógeno (23). Por último, R337 e Y338 en el grupo Arg/Tyr también están muy conservados en muchas especies; por tanto, es poco probable que se tolere cualquier cambio en estos residuos (23).
Se ha informado de que varias mutaciones causan una forma más leve de AME con manifestaciones clínicas y bioquímicas menos graves. Se ha demostrado que las construcciones mutadas pertinentes mantienen la actividad de la HSD11B2 in vitro (4, 19, 24), lo que concuerda con el fenotipo clínico menos grave. Estructuralmente, estas mutaciones pueden interrumpir indirectamente la unión del sustrato (como la mutación P227L en uno de nuestros pacientes) o alterar la estructura de la proteína (como las mutaciones R279C y R359W) para atenuar, pero no abolir, la actividad de la enzima (Fig. 5). En particular, aunque el residuo P227 no se encuentra en una posición que interactúe directamente con el sustrato, su posición adyacente al residuo Y226 sugiere que puede tener un papel en la unión del sustrato (Fig. 5A). De hecho, este residuo forma el «pliegue» en la región del bucle, manteniendo la conformación del sitio activo y también mantiene a Y226 en la posición correcta para interactuar óptimamente con el sustrato. La mutación de este residuo a Leu (P227L) interrumpe el pliegue y altera la posición de Y226 (Fig. 5A).
Mutaciones de la HSD11B2 que causan una AME leve de tipo 2. (A) P227 forma un pliegue en el bucle y ayuda a posicionar correctamente Y226 para interactuar de forma óptima con el sustrato. Un aumento de la flexibilidad del bucle en la mutación P227L da lugar a una mala alineación de Y226. (B) El enlace de hidrógeno entre R279 y N171 es uno de los muchos que mantienen unidas las láminas β4 y β6. También orienta la cadena lateral de N171 para interactuar con NAD+. La mutación a cisteína provoca la pérdida de estas interacciones. (C) Las interacciones R359-I350 mantienen la hélice-giro-hélice. La mutación R359W introduce flexibilidad en la región.
En pacientes con AME tipo 2 se han identificado dos mutaciones no conservativas que se cree que alteran la estructura terciaria de la HSD11B2. R279 forma un enlace de hidrógeno con la columna vertebral de N171, que ayuda a mantener y estabilizar el entorno local de la proteína (Fig. 5B). La sustitución de R279 por un residuo que no forma un enlace de hidrógeno, como en la mutación R279C, conduce a una atenuación leve, pero no a la eliminación total de la actividad de la HSD11B2 (24), consistente con un fenotipo clínico leve (Fig. 5B). Otra mutación no conservadora, R359W, cambia las propiedades de la cadena lateral de cargada a hidrofóbica. Esto altera la interacción local dentro de la estructura de la proteína, en la que la cadena lateral cargada positivamente de R359 forma un enlace de hidrógeno con el oxígeno carbonilo de la columna vertebral de I350 (Fig. 5C). La pérdida de esta interacción contribuye a aumentar la flexibilidad estructural, causando la atenuación de la actividad enzimática. Cabe destacar que tanto la R279C como la R359W causan una interrupción mínima de las interacciones intramoleculares y se producen cerca de la superficie de la proteína.