Abstract
Las disacaridasas (DS) son enzimas del borde en cepillo integradas en la membrana microvellosa de los enterocitos del intestino delgado. En la enfermedad celíaca (EC) no tratada, se observa una disminución general de las actividades de las DS. Este manuscrito revisa diferentes aspectos de las actividades de las DS en la EC: su utilidad en el diagnóstico y su aplicación a las pruebas de toxicidad in vitro. Esta última nunca se ha establecido en la investigación de la EC. Sin embargo, con los recientes avances en las técnicas de organoides del intestino delgado, la SD podría emplearse como biomarcador para estudios in vitro. Esto incluye el establecimiento de células epiteliales autorrenovables criadas a partir del tejido, que expresan marcadores de diferenciación, incluidas las enzimas del borde en cepillo. La determinación de las actividades de la DS duodenal puede proporcionar información adicional durante el trabajo de diagnóstico de la EC: (i) cuantificar la gravedad de las lesiones histológicas observadas, (ii) proporcionar valores predictivos para el grado de atrofia de las vellosidades de la mucosa, y (iii) ayudar a diagnosticar la EC cuando se observan cambios histológicos menores. La SD también puede proporcionar información adicional para evaluar la respuesta a una dieta sin gluten, ya que se produce un marcado aumento de sus actividades cuatro semanas después de iniciarla. Diversos factores endógenos y exógenos que afectan a la SD también podrían ser relevantes a la hora de considerar la investigación del papel de la SD en otras condiciones, incluyendo la sensibilidad al gluten no celíaca y las deficiencias de la SD.
1. Introducción
En algunos individuos, los síntomas gastrointestinales, incluida la diarrea, están relacionados con la ingestión de ciertas formas de carbohidratos en la dieta. Los síntomas son atribuibles a una o varias deficiencias enzimáticas de la mucosa del intestino delgado que hidrolizan los disacáridos . Entre ellas se encuentran la deficiencia de lactasa (congénita y en adultos), la deficiencia de sacarasa-isomaltasa, la deficiencia de maltasa-glucoamilasa y la de trehalasa. A excepción de la deficiencia de lactasa en adultos, las demás deficiencias mencionadas son relativamente raras. Otras afecciones, incluida la enfermedad celíaca (EC), que provocan una lesión en el intestino delgado pueden causar una reducción de las actividades de las disacaridasas (DS). También se ha sugerido que las deficiencias secundarias de DS pueden explicar los síntomas en pacientes con EC que tienen las vellosidades intactas.
La lactosa, que es digerida por la enzima lactasa del borde en cepillo, es uno de los carbohidratos de cadena corta mal absorbidos, a menudo denominados FODMAPs (oligo-, di-, monosacáridos y polioles fermentables). Se ha demostrado que la reducción de la ingesta de FODMAPs mejora los síntomas gastrointestinales en pacientes con sensibilidad al gluten no celíaca (NCGS) . Se ha demostrado que otros componentes distintos del gluten en el trigo podrían ser importantes en la SGNC, concretamente el inhibidor de la amilasa-tripsina . La falta de biomarcadores para esta afección podría llevar a los investigadores a estudiar el posible papel de las enzimas del borde en cepillo, como la lactasa.
En la EC no tratada, se observa una disminución general de las actividades de la DS . Antes de la llegada de las pruebas serológicas, las actividades de las SD del intestino delgado eran parámetros de laboratorio importantes para ayudar al diagnóstico de la EC. La determinación de la actividad de la SD individual también ha sido crucial para el diagnóstico diferencial de los trastornos metabólicos congénitos. La medición de su actividad ayuda a distinguir entre las deficiencias de SD primarias y secundarias. Los tipos primarios de deficiencias de SD constituyen «errores innatos del metabolismo» de una enzima específica . Un ejemplo de ello es la deficiencia congénita de lactasa, en la que hay niveles normales de maltasa y sacarasa con una reducción de la lactasa. La EC es una deficiencia secundaria de DS, ya que todas las DS están reducidas debido a la lesión inducida por el gluten en la mucosa del intestino delgado.
El aumento marcado de las actividades de las DS se produce cuatro semanas después de comenzar una dieta sin gluten (GFD), pero sus actividades se reducen de nuevo si los pacientes celíacos vuelven a una dieta normal . En los pacientes con EC tratada, la instilación intraduodenal de gluten produce cambios histológicos característicos y una marcada reducción asociada de las actividades de las disacaridasas en 3,5 horas. La reducción de las actividades de la DS se correlaciona con el grado histológico de la biopsia, de modo que la DS podría emplearse como biomarcador de la EC.
Este manuscrito revisa diferentes aspectos de las actividades de la DS en la EC: su utilidad en el diagnóstico y su aplicación a las pruebas de toxicidad in vitro. Además, se describen los recientes avances en las técnicas de organoides del intestino delgado, incluyendo el cocultivo con células inmunes, que ofrecen una interesante oportunidad para desarrollar modelos in vitro de última generación para la investigación de la EC. En este modelo, las enzimas del borde en cepillo podrían emplearse como marcadores de la patogénesis de la EC.
2. Aspectos diagnósticos de las actividades de las disacaridasas del intestino delgado en la EC
El patrón de oro para el diagnóstico de la EC y el seguimiento del efecto de la DGF es el examen de las biopsias duodenales junto con la serología de la EC, incluida la transglutaminasa tisular. La medición de las actividades de la DS proporciona información adicional en el momento del diagnóstico y durante el seguimiento para evaluar la respuesta a una GFD . Además, se ha demostrado que la determinación de las actividades de la DS podría ayudar al diagnóstico de la EC cuando se observan cambios histológicos más leves, incluidas las anomalías Marsh I y II en las biopsias del intestino delgado. Valores predictivos positivos y negativos de la atrofia de las vellosidades de la mucosa
La medición de las actividades enzimáticas del borde en cepillo ofrece una herramienta objetiva adicional para evaluar la gravedad de las anomalías histológicas en pacientes celíacos no tratados . Las actividades de la DS duodenal son buenos predictores del grado de atrofia de las vellosidades de la mucosa en la EC. Los valores predictivos positivos para la atrofia vellosa moderada o grave son los siguientes:(i)90% para la maltasa (proteína U/g de maltasa)(ii)86% para la sacarasa (<40 U/g de proteína)(iii)71% para la lactasa (<20 U/g de proteína).
La disminución de las actividades de la maltasa y la sacarasa tienen, por tanto, un alto valor predictivo positivo para el grado de atrofia vellosa de la mucosa. Los valores predictivos de la actividad de la lactasa son menores, probablemente debido a la presencia de una deficiencia primaria de lactasa en los pacientes celíacos. Ningún paciente con actividades de SD en el rango normal mostró atrofia vellositaria severa.
2.2. La curación de la mucosa en la EC con una dieta sin gluten (GFD)
Está bien establecido que las actividades de las enzimas del borde en cepillo están reducidas en los pacientes celíacos no tratados. Sin embargo, las actividades se recuperan durante la remisión, sobre todo cuatro semanas después de comenzar una GFD . Es importante señalar las diferentes respuestas entre la SD y una DSG; se produce un marcado aumento de las actividades de las alfa glucosidasas, mientras que la actividad de la lactasa sigue siendo baja en muchos pacientes. Peña et al. demostraron que la respuesta de la lactasa a una GFD es variable, a veces mostrando una recuperación completa en unos meses, pero a veces permaneciendo deprimida durante años . La edad del paciente es de gran importancia en la tasa de recuperación de la actividad de la lactasa. Los pacientes de menos de 30 años suelen mostrar una recuperación completa en el transcurso de unos pocos meses, mientras que la mayoría de los pacientes de más edad muestran una recuperación escasa o nula en este espacio de tiempo . En otros estudios se ha demostrado la persistencia de actividades de lactasa bajas a pesar de una buena mejoría histológica en algunos pacientes, especialmente en los adultos.
Con la excepción de la lactasa , la medición de la SD puede proporcionar un índice cuantitativo de la mejoría de la mucosa del intestino delgado ; su aumento se correlaciona bien con la recuperación de la mucosa basada en la histología de la biopsia del intestino delgado . Además del seguimiento histológico y serológico, la medición de las actividades de la SD ofrece una herramienta potencial adicional para evaluar el tratamiento de la EC con una DSG. La actividad de la sucrasa es el mejor indicador de la respuesta de la mucosa a una DSG. Sin embargo, es interesante observar que incluso después de dos años de tratamiento de la EC con una DSG, la actividad de la sucrasa en el duodeno distal no aumenta hasta el nivel de los controles, aunque los efectos clínicos se observan antes . En general, las actividades enzimáticas en la mucosa del intestino delgado de los pacientes con EC en remisión son inferiores a las de los grupos de control emparejados por edad, sexo y lugar de la biopsia . Sin embargo, los pacientes celíacos sometidos a una GFD presentan niveles significativamente mayores de maltasa y sucrasa, pero un aumento limitado de la actividad de la lactasa en comparación con un grupo no tratado . Merece la pena mencionar que una DM estricta es el tratamiento de elección no sólo para la EC, sino también para las deficiencias secundarias de SD asociadas a la EC.
2.3. Diagnóstico de la EC con puntuación Marsh I/II de las biopsias de la mucosa del intestino delgado (EC subclínica)
En las biopsias de la mucosa del intestino delgado con puntuación Marsh I y/o II, no hay atrofia vellositaria . La atrofia de las vellosidades es sólo la etapa final del curso clínico de la enfermedad; la EC se desarrolla gradualmente desde la inflamación de la mucosa del intestino delgado a la hiperplasia de las criptas y finalmente a la atrofia de las vellosidades.
Los cambios más leves de la biopsia que se limitan a la infiltración linfocítica con o sin hiperplasia de las criptas pueden requerir datos adicionales para aumentar la certeza del diagnóstico de EC, ya que estos cambios histológicos no son exclusivos de la EC. El diagnóstico de la EC puede mejorarse mediante la determinación del genotipo (HLA-DQ2 o HLA-DQ8); los marcadores serológicos y la tinción inmunohistoquímica de los linfocitos intraepiteliales γδ+ve que se encuentran en los pacientes con EC también pueden utilizarse para confirmar el diagnóstico.
El daño a las microvellosidades puede ser una de las alteraciones más tempranas inducidas por el gluten en la EC . Por lo tanto, los cambios bioquímicos pueden preceder a las anomalías histológicas de la biopsia duodenal observadas por microscopía óptica . Murray et al. informaron del diagnóstico de EC en la repetición de la biopsia en 4 de 37 (10,8%) pacientes que no tenían atrofia vellositaria en su biopsia inicial unos años antes. Sin embargo, estos cuatro pacientes tenían actividades de SD disminuidas y cambios histológicos menores (Marsh I o II) en su biopsia inicial. La reducción de las actividades de la SD sin atrofia de las vellosidades puede, por tanto, representar una EC temprana.
Mones et al. observaron una marcada reducción de las actividades de la SD en pacientes pediátricos con EC cuyos cambios histológicos en sus biopsias del intestino delgado puntuaban como Marsh I o II (con vellosidades intactas). Una prueba positiva para predecir la EC se definió mediante los siguientes valores de corte para la actividad individual de la SD: lactasa, ≤15 unidades/g de proteína; sacarasa, ≤25 unidades/g de proteína; maltasa, ≤100 unidades/g de proteína; y palatinasa, ≤5 unidades/g de proteína. La sensibilidad diagnóstica osciló entre el 74% y el 85%, observándose la mayor sensibilidad para la lactasa. La especificidad diagnóstica osciló entre el 57% y el 91%, con la mayor especificidad para la sucrasa. El valor predictivo positivo de una deficiencia de SD para predecir la EC osciló entre el 70% y el 91%. Los valores predictivos negativos (un nivel normal de DS) oscilaron entre el 72% y el 76% para predecir una biopsia no considerada como EC . La deficiencia de DS encontrada en las biopsias duodenales puede, por tanto, ayudar al diagnóstico de EC en biopsias con vellosidades intactas . Un hallazgo similar se comunicó en otro estudio en el que la evaluación de las actividades de la DS proporcionó pruebas para apoyar el diagnóstico de EC en algunos pacientes.
3. Aspectos de la investigación de las actividades de las disacaridasas en la enfermedad celíaca
Las actividades de la DS en las biopsias de la mucosa del intestino delgado pueden determinarse mediante el método Dahlqvist. El tejido se incuba con el disacárido correspondiente y la glucosa liberada se determina mediante un ensayo colorimétrico utilizando el reactivo TRIS-glucosa oxidasa. Las unidades de actividad de la DS se expresan como micromoles de disacárido hidrolizado por minuto y por gramo de mucosa (peso húmedo). Factores que afectan a las actividades enzimáticas
Las SD se reducen en la enfermedad celíaca activa. Pueden estar reducidas en otras afecciones, como la enfermedad inflamatoria intestinal, la alergia alimentaria, la dispepsia, la malabsorción proteico-energética, las inmunodeficiencias y las enfermedades infecciosas (como la giardiasis, las infecciones víricas y el sobrecrecimiento bacteriano del intestino delgado) . La disminución de las actividades de la SD suele poder revertirse mediante un tratamiento exitoso de la enfermedad subyacente. Curiosamente, la SD también puede aumentar anormalmente en pacientes diabéticos . Una reducción de las deficiencias individuales de la SD se observa en las deficiencias primarias de la SD que incluyen la intolerancia congénita a la lactosa, la deficiencia de sucrasa-isomaltasa, la deficiencia de maltasa-glucoamilasa y la de trehalasa.
En individuos sanos, las actividades de la SD pueden mostrar un amplio rango de valores absolutos . Hay varios factores endógenos y exógenos que afectan a sus actividades.
3.1.1. Factores endógenos
Las actividades de la SD varían a lo largo del eje longitudinal (duodeno-yeyuno-ileo) del intestino . La lactasa tiene actividades máximas a 50-200 cm del ligamento de Treitz y está casi ausente en el íleon distal. Las actividades de la sucrasa son constantes a lo largo del intestino delgado. La maltasa es dos veces más abundante en el íleon distal que en el yeyuno proximal.
La etnia afecta a los valores de la DS, como se demostró al comparar niños africanos y finlandeses con una arquitectura vellosa normal; los primeros tenían actividades más bajas de lactasa, sucrasa y maltasa duodenal. Alrededor de un tercio de los niños finlandeses presentan una actividad de lactasa por debajo del rango de referencia establecido de 20 U/g de proteína, frente a dos tercios de los niños africanos.
El sexo no afecta a ninguna de las actividades de la SD . La edad sólo tiene un efecto significativo sobre la actividad de la lactasa; ésta disminuye con la edad. En algunos niños negros, la deficiencia de lactasa puede desarrollarse después de la edad de 3 años y no está asociada a la enfermedad de la mucosa .
El ritmo circadiano influye en las actividades de la SD . Además, las oscilaciones de las actividades de la SD se correlacionan con el ritmo de la ingesta de alimentos .
Los cambios en la mucosa que pueden ocurrir en la EC afectan a los valores absolutos de las actividades de la SD encontrados en las biopsias. Jonsson et al. demostraron que había aproximadamente un 30% de coeficiente de variación en la actividad de la DS de las muestras tomadas de dos lugares del duodeno.
3.1.2. Factores exógenos
Se sabe que la alimentación con sacarosa aumenta la actividad de la sacarasa-isomaltosa. El aumento es el resultado de la síntesis de novo de la enzima que alcanza su máximo (aumento de 2,6 veces) 12 horas después de comenzar una dieta que contiene sacarosa . La degradación de la enzima es independiente de la dieta.
El ayuno dificulta la renovación de las células epiteliales intestinales. Provoca una reducción de la masa del intestino delgado, del tamaño de las vellosidades y del índice mitótico de los enterocitos de la cripta. La privación de hidratos de carbono induce un descenso de la sucrasa intestinal que se restablece con la alimentación de hidratos de carbono.
Los niveles de SD también varían según el lugar de la biopsia. Esto se aplica no sólo al eje longitudinal (duodeno-yeyuno-ileo) en el intestino delgado, sino también al eje cripto-velloso. Dado que las SD están incrustadas en las microvellosidades de los enterocitos vellosos, su actividad depende del número de enterocitos vellosos presentes en la biopsia, de modo que las biopsias más superficiales que tienen un mayor contenido epitelial podrían tener un mayor contenido de SD. Métodos ex vivo e in vitro para estudiar la toxicidad del gluten en la enfermedad celíaca
No existe un modelo animal que reproduzca todas las características de la enfermedad celíaca . Las pruebas in vivo son el estándar de oro para evaluar la toxicidad celíaca . Sin embargo, está bien establecido que la administración in vivo de gluten puede causar lesiones sistémicas al paciente. Por lo tanto, se suelen emplear métodos in vitro antes de realizar estudios in vivo cuando se evalúa la ausencia de toxicidad de los alimentos para la EC.
El método in vitro más fiable es el cultivo de la biopsia de la mucosa del intestino delgado, a menudo denominado cultivo de órganos de la biopsia duodenal (OC). El método fue descrito originalmente por Browning y Trier . Existe un requisito importante para los estudios preclínicos in vitro, por lo que el principio del método de Browning y Trier se ha seguido desarrollando y aplicando para probar probióticos que requieren una estimulación apical de los explantes de la mucosa intestinal . La OC permite otras aplicaciones, por ejemplo, estudios bioquímicos de la síntesis y el procesamiento de la DS , el ensamblaje dimérico de la DS , y el estudio de los efectos de la insulina en las actividades elevadas de la DS en sujetos diabéticos .
El método original de Browning y Trier se ha modificado para que el sistema detecte los efectos nocivos del gluten añadiéndolo al medio de cultivo y evaluando las subsiguientes anomalías histológicas, morfológicas e inmunológicas. La técnica de Browning y Trier modificada se sigue utilizando ampliamente en los estudios que examinan la patogénesis de la EC y en las pruebas de toxicidad celíaca . El sistema OC también ha demostrado ser útil para ayudar al diagnóstico de la EC, principalmente en casos sin atrofia vellositaria o en pacientes seronegativos.
3.2.1. Primeros trabajos sobre el cultivo de órganos del intestino delgado y el estudio de las enzimas de borde de cepillo en la EC
El daño de los enterocitos es el sello distintivo de la enfermedad celíaca . El efecto tóxico del gluten en la mucosa del intestino delgado se demostró bioquímicamente midiendo la actividad de la enzima del borde en cepillo fosfatasa alcalina (AP) en la EC. La actividad de la fosfatasa alcalina obtenida de biopsias de pacientes con EC no tratados aumentó cuando el tejido se incubó en un medio sin gluten. Este aumento fue inhibido por la presencia de péptidos de gluten en el medio de cultivo, lo que demuestra los efectos tóxicos del gluten.
Katz y Falchuk propusieron posteriormente el uso de la técnica de OC del intestino delgado como prueba predictiva para el diagnóstico definitivo de la sensibilidad al gluten. Veintidós de 26 pacientes diagnosticados de EC habían mostrado sensibilidad al gluten in vitro en sus biopsias iniciales. El aumento de la actividad AP del tejido intestinal de estos 22 pacientes fue inhibido por la presencia de péptidos de gluten en el medio. La tasa de falsos negativos para establecer el diagnóstico de EC fue, por tanto, del 15% (4 de 26). En su estudio, también hubo 14 pacientes con mucosa anormal que demostraron no tener EC. Trece de ellos no mostraron sensibilidad al gluten in vitro (una tasa de falsos positivos del 7%). Todos los pacientes con biopsias normales fueron clasificados correctamente. Estos interesantes resultados sugieren que el cultivo de órganos del intestino delgado podría utilizarse para el diagnóstico prospectivo de la EC. En otro estudio, Falchuk et al. volvieron a demostrar la sensibilidad al gluten in vitro en pacientes con EC activa. Sugirieron además que había diferencias según el tipo de histocompatibilidad de los sujetos.
Otros investigadores llevaron a cabo estudios de CO similares, midiendo la actividad de AP y otra enzima del borde en cepillo, la α-glucosidasa. Howdle et al. y Hauri et al. no pudieron reproducir los efectos in vitro del gluten en biopsias duodenales de pacientes con EC no tratados ni mediante la evaluación de la actividad de la AP o de la α-glucosidasa.
Mitchell et al. demostraron que existe una pérdida progresiva de proteínas del tejido durante la OC. Al mismo tiempo, los niveles de las enzimas del borde en cepillo disminuyen y se acumulan en el medio. Por lo tanto, sugirieron expresar las actividades enzimáticas como mU/ml del medio de cultivo, en lugar de U/g de proteína, debido a las pérdidas de proteínas durante el cultivo del órgano y a las actividades enzimáticas recuperadas en el medio.
Varios autores investigaron las proteínas, el contenido de ADN y las enzimas del borde en cepillo en la biopsia de intestino delgado OC. La mayoría ha observado una disminución de todos estos parámetros en las biopsias cultivadas con la excepción de la actividad de AP que aumentó en prácticamente todos los casos . Probablemente las DS se pierden más fácilmente en el medio durante el cultivo que las AP .
3.2.2. Modelos celulares y actividades enzimáticas
Además de la OC de la mucosa del intestino delgado del paciente con EC, los investigadores han utilizado diferentes líneas celulares para estudios in vitro de la EC. Los modelos celulares establecidos se basan en líneas de células T sensibles al gluten y en clones aislados de individuos con EC, que se siguen utilizando ampliamente en la detección de la toxicidad de la EC . También se han llevado a cabo importantes investigaciones utilizando líneas celulares epiteliales de origen canceroso que son relativamente fáciles de cultivar. Sin embargo, no se ha establecido en qué medida la transformación maligna afecta a su posible dependencia de las influencias microambientales circundantes. Se ha demostrado que, a diferencia de las células epiteliales normales, las líneas celulares de cáncer de colon no requieren la adición de factores de crecimiento para su expansión in vitro . Además, las células Caco2 expresan cantidades considerablemente menores de enzimas del borde en cepillo en comparación con los enterocitos normales.
Antes de que Sato et al. publicaran su innovador descubrimiento sobre los organoides intestinales, los enterocitos eran notoriamente difíciles de cultivar in vitro. A lo largo de décadas, muchos estudios sobre el epitelio normal del intestino han informado de las dificultades para mantener el cultivo de estas células durante más de unos pocos días ( y sus referencias) a pesar de emplear diferentes protocolos de aislamiento y condiciones de cultivo posteriores. Durante muchos años se pensó que no se podían establecer cultivos a largo plazo a partir de tejido humano primario a menos que las células se transformaran genéticamente. También se descubrió que la interrupción de las interacciones entre las células epiteliales normales y la matriz extracelular circundante induce la apoptosis de las células.
Quaroni et al. , sin embargo, consiguieron establecer un cultivo a largo plazo de células epiteliales del intestino delgado de rata. Su enfoque inicial para el aislamiento fue el utilizado en OC, pero las células epiteliales cultivadas tenían las características de las células de la cripta del intestino delgado indiferenciadas. En otros estudios en los que se utilizaron biopsias intestinales humanas, de ratón, de rata y de bovino se informó de niveles de diferenciación pobres de los enterocitos cultivados in vitro, lo que coincide con nuestras observaciones (datos no publicados). Rusu et al. estudiaron la diferenciación in vitro evaluando las actividades específicas de la maltasa y la AP en muestras bovinas de (a) epitelios recién raspados, (b) suspensiones de organoides utilizadas para sembrar cultivos (que no deben confundirse con los organoides de Sato), y (c) cultivos de células intestinales que incluyen células cultivadas primarias y células cultivadas después del primer y segundo pasaje. Las suspensiones de organoides presentaron una reducción del 50% con respecto a la preparación de epitelio fresco. La actividad de la maltasa utilizada como marcador de diferenciación disminuyó claramente en los cultivos primarios y con los siguientes pases de cultivo hacia un nivel bajo estable. Se obtuvieron resultados similares en las mediciones de la actividad AP intestinal. Estos resultados reflejaron una pérdida de diferenciación celular in vitro.
El epitelio es sólo uno (i) de los cuatro componentes de una unidad funcional integrada que también consta de (ii) matriz extracelular, (iii) células derivadas del mesénquima y (iv) factores luminales. El aislamiento de los enterocitos de su entorno mesenquimal provoca una pérdida de diferenciación. Las células fetales no transformadas del intestino delgado humano cultivadas en plástico tienen características de enterocitos de cripta indiferenciados. La adición secuencial de moléculas de tejido conectivo y luminal a los enterocitos fetales humanos no malignos in vitro indujo un espectro de cambios en el tipo celular epitelial hacia la diferenciación completa . Una línea celular de intestino delgado de rata también se diferenció, según la evaluación de un aumento significativo de la actividad de la sucrasa, cuando se cultivó en presencia de mesénquima . Por lo tanto, el desarrollo normal y la diferenciación del epitelio del intestino delgado dependen de la interacción con el mesénquima y otros componentes.
Los cultivos a largo plazo de células epiteliales humanas primarias normales aisladas del intestino delgado están ahora bien establecidos. Se pueden cultivar «mini intestinos» epiteliales humanos a partir de criptas intestinales y células madre individuales . Es posible propagar in vitro los cultivos de organoides que se derivan tanto del intestino de ratón como del humano . Estos organoides pueden cultivarse indefinidamente y muestran todas las características del epitelio del intestino delgado en términos de arquitectura, tipos de células y características de autorrenovación.
Sato et al. definieron las condiciones que promovían la proliferación y diferenciación de los organoides. Las células madre, así como los organoides, debían estar incrustados en Matrigel, que es una matriz rica en laminina y colágeno que imita la lámina basal. El cultivo del intestino delgado humano es más complejo que el del intestino del ratón. Además de la R-espondina, el Noggin y el factor de crecimiento epidérmico, las condiciones de cultivo optimizadas para humanos requieren más suplementos (Wnt3A, gastrina, nicotinamida, inhibidor de Alk e inhibidor de p38). La diferenciación de los organoides epiteliales pequeños humanos cultivados en diferentes tipos de células del intestino requiere la retirada de ciertos suplementos (Wnt3, nicotinamida e inhibidor de p38). Se visualizó un marcador de diferenciación de los enterocitos maduros mediante la tinción AP del borde en cepillo. En otro estudio, Middendorp et al. también omitieron ciertos suplementos de cultivo para lograr la diferenciación del intestino delgado de los organoides humanos. Sin embargo, resulta interesante que la visualización de los enterocitos maduros mediante la tinción con sucrasa-isomaltasa funcionó bien en los organoides ileales, pero no en los duodenales. La expresión de la lactasa fue inducida tanto en los organoides ileales como en los duodenales por el llamado medio de diferenciación. Avances recientes en los métodos de organoides intestinales
La tecnología de organoides podría tener aplicaciones en la terapia regenerativa de algunas enfermedades intestinales mediante la expansión ex vivo de los epitelios intestinales y el trasplante . Esta metodología también permite la propagación in vitro de tejidos gastrointestinales enfermos, lo que podría dilucidar la patogénesis de la enfermedad y el desarrollo de terapias. Los organoides intestinales ya se han utilizado para modelar enfermedades monogénicas que afectan al epitelio, la enfermedad inflamatoria intestinal (estudiando la muerte celular, la integridad de la mucosa y los efectos de las citoquinas inflamatorias) y las interacciones entre los tejidos intestinales y los microbios, así como el cáncer ( y sus referencias). La investigación sobre la EC va por detrás de estos avances. Está bien establecido que hay muchos tipos de células implicadas en la patogénesis de la EC y, como tal, los organoides carecen de muchos de los tipos celulares presentes en un sistema in vivo. Sin embargo, se puede aumentar la complejidad mediante el cocultivo con células inmunitarias. Nozaki et al. describieron el cocultivo de organoides murinos y linfocitos intraepiteliales (LIE) en el que tanto las células αβT como las γδT proliferaron con éxito y fueron tan móviles como los LIE que residen en entornos in vivo. También se han descrito cocultivos de organoides para el sistema nervioso entérico y los miofibroblastos.
Debido a los avances en las pruebas serológicas y genéticas en el trabajo de diagnóstico de la enfermedad celíaca, es posible que la biopsia duodenal ya no sea necesaria para muchos pacientes. Por lo tanto, el material de la biopsia será escaso. Sin embargo, los organoides intestinales también pueden generarse a partir de células madre embrionarias o de células madre pluripotentes inducidas ( y sus referencias) que, aunque tardan más en establecerse y son técnicamente más exigentes y costosas en comparación con los organoides derivados de la biopsia, pueden aumentar en gran medida el número de organoides resultantes y permitir que el material clínico se utilice en su lugar para criar las células inmunitarias.
3.2.4. Relevancia del trabajo con organoides intestinales y enzimas de borde de cepillo para el desarrollo de métodos in vitro de vanguardia para la investigación de la EC
Está bien establecido que las respuestas inmunes innatas y adaptativas se desencadenan en la patogénesis de la EC; sin embargo, la secuencia exacta de estos eventos patológicos no se ha dilucidado hasta la fecha. La tecnología de organoides, sin embargo, permite la adición secuencial de las células en el cocultivo, permitiendo así el estudio de la respuesta inmune innata mediante la reconstitución de organoides celíacos y IELs por separado de los efectos de una respuesta inmune adaptativa. A su vez, las células T específicas del gluten, que también pueden cultivarse in vitro, pueden incluirse entonces en este modelo in vitro de EC para facilitar la totalidad de los efectos tóxicos del gluten en el epitelio intestinal.
La tecnología de los organoides también permite dilucidar el papel de los enterocitos en el procesamiento de los péptidos de gliadina en la EC. Los enterocitos tienen la capacidad de funcionar como células presentadoras de antígenos, por lo que la estimulación de las células T está mediada por sus moléculas HLA-DR . Además, la gliadina contiene péptidos que pueden desencadenar una respuesta inmunitaria innata. Curiosamente, el péptido del gluten que desencadena la inmunidad innata en la enfermedad celíaca se procesa de forma diferente dentro del enterocito en comparación con los que desencadenan una respuesta inmunitaria adaptativa, en la que los péptidos alcanzan los endosomas tardíos HLA-DR positivos y se presentan a las células T de la lámina propia. Dado que el daño en el borde en cepillo de los enterocitos es una de las alteraciones más tempranas en la EC, la SD podría utilizarse para estudiar los efectos tóxicos del gluten en la EC. Es importante señalar que las enzimas del borde en cepillo son una parte integral de los enterocitos vellosos maduros y están cuantitativamente asociadas a su diferenciación . Sin embargo, la actividad de las DS puede no estar relacionada con la viabilidad de los enterocitos, ya que las actividades de las enzimas del borde en cepillo se han demostrado en células epiteliales no viables. Por lo tanto, la inmunotinción o, más precisamente, la falta de inmunotinción para las enzimas del borde en cepillo debido a la destrucción de las microvellosidades y no a sus actividades, podría utilizarse como marcador de la patogénesis de la EC.
La tecnología orgánica tiene un potencial sustancial para la modelización de la enfermedad y, por lo tanto, para la elucidación de la secuencia de eventos patogénicos en la EC en la que se pueden utilizar las enzimas del borde en cepillo. Los nuevos modelos in vitro basados en los recientes avances en la investigación con células madre pueden facilitar el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas en la EC.
4. Conclusiones
La estructura de la mucosa del intestino delgado y los procesos fisiológicos implicados son muy complejos. La EC aumenta esta complejidad, afectando a muchos componentes del intestino, incluido el SD. A pesar de que las actividades de la DS solían desempeñar un papel importante en la ayuda al diagnóstico de la EC, la aplicación de las actividades de la DS a la investigación in vitro de la EC sigue sin establecerse. Los recientes avances en el crecimiento ex vivo de las «miniguetas» epiteliales proporcionan una nueva y emocionante plataforma que ha quedado disponible. Permite aplicaciones para estudiar el epitelio normal o enfermo con ingeniería de tejidos. Las células epiteliales crecen y se diferencian en condiciones definidas que incluyen la presencia de una matriz extracelular y factores de crecimiento. Una población autorrenovable de células epiteliales expresa enzimas del borde en cepillo que podrían emplearse en los estudios in vitro de la EC cuando hay reconstitución de otras células inmunitarias en el modelo.
Conflictos de intereses
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Dra. H. Julia Ellis por sus útiles discusiones y la revisión del manuscrito. Tanja Šuligoj desea agradecer el apoyo del Clinical Research Trust. Borut Božič desea agradecer el apoyo financiero parcial de la Fundación Científica de Eslovenia, subvención no. SZF-BBozic01/2007.