Abstract
Un paciente urémico desarrolló hipercalcemia tras una infección tuberculosa, y sus niveles de calcio ionizado se correlacionaron con los niveles de 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3). Realizamos otros estudios para determinar si los monocitos son lugares alternativos de conversión de 1,25(OH)2D3 más allá de las células tubulares renales. Utilizando un bioensayo ex vivo, en este estudio descubrimos que la actividad de la 1-α hidroxilasa (CYP27B1) en los monocitos es significativamente mayor en los pacientes con tuberculosis (TB) activa que en los que tienen un contacto frecuente con la TB. Sin embargo, cuando los monocitos de los pacientes con TB activa fueron reestimulados con antígeno derivado de Mycobacterium tuberculosis, se observó una menor cantidad de 1,25(OH)2D3. En cambio, el nivel de 1,25(OH)2D3 no se modificó en los pacientes con contacto frecuente con la tuberculosis. Concluimos que los monocitos pueden ser una fuente alternativa de 1-α hidroxilasa que podría convertir la 25-hidroxivitamina D3 en la más activa 1,25(OH)2D3.
1. Introducción
La tuberculosis ha asolado el mundo desde la prehistoria. Según un informe reciente, un millón de pacientes sucumben anualmente a la tuberculosis y a las comorbilidades relacionadas con ella . En las últimas décadas, se han realizado enormes esfuerzos para comprender el proceso fisiopatológico de la enfermedad. Los modelos animales y los estudios en humanos han allanado el camino para aclarar las respuestas inmunitarias individuales a Mycobacterium tuberculosis (MTB) . Estos estudios proporcionan pruebas de que la vitamina D desempeña un papel importante en la resistencia humana a la tuberculosis. La vitamina D se ha utilizado para combatir la tuberculosis durante más de 200 años. El aceite de hígado de bacalao y el calciferol, principales fuentes de vitamina D, se han utilizado desde el siglo XVII para tratar a pacientes con tuberculosis . En la fisiología normal, tras la exposición al sol, el 7-dehidrocolesterol almacenado en la piel se convierte en previtamina D3, seguido de una isomerización térmica a vitamina D3 . A continuación, la vitamina D3 se hidroxila en el hígado a 25-hidroxivitamina D3 (25(OH)D3). A continuación, la 25(OH)D3 es hidroxilada a la forma más activa de la vitamina D3, la 1,25(OH)2D3, por la 1-hidroxilasa (CYP27B1). Las células epiteliales tubulares renales son una fuente importante de 1-hidroxilasa y desempeñan un papel fundamental en la determinación de la concentración de 1,25(OH)2D3 en el suero. La presencia del CYP27B1 en los tejidos extrarrenales se reconoce desde hace décadas. El impacto del CYP27B1 extrarrenal en la concentración sérica de 1,25(OH)2D3 aún no se ha determinado.
Nos encontramos con un paciente de 34 años con uremia que había recibido hemodiálisis regular durante 2 años. El paciente experimentó debilidad muscular con fatiga durante 2 días antes de visitar a un médico de familia. La química sanguínea reveló niveles elevados de calcio ionizado (5,44 mg/dL). A pesar de la hipercalcemia, los síntomas de la paciente se aliviaron con el tratamiento convencional. Cuatro meses después, la paciente experimentó una debilidad muscular progresiva acompañada de fiebre. En urgencias, se observaron de nuevo niveles elevados de calcio ionizado (6,88 mg/dL). Además, un electrocardiograma reveló un ritmo cardíaco anormal y un intervalo QT corto con onda T ampliada. Una radiografía de tórax mostró una infiltración pulmonar en el lóbulo superior derecho que posteriormente se determinó que era tuberculosis pulmonar. La paciente recibió entonces 9 meses de tratamiento antituberculoso. Cuatro meses después del tratamiento, los niveles de calcio ionizado de la paciente se normalizaron (5,2 mg/dL), con una resolución completa de los síntomas. Para dilucidar la patogénesis de la hipercalcemia de esta paciente, medimos los niveles de 1,25(OH)2D3 además de los niveles de calcio ionizado. Como se muestra en la figura 1, los niveles de 1,25(OH)2D3 estaban altamente correlacionados con los de calcio ionizado.
Cambios en las concentraciones de calcio ionizado y 1,25(OH)2D3 en el suero de un paciente con tuberculosis activa y uremia.
Además de la expresión renal de CYP27B1, los macrófagos y los monocitos se consideran importantes lugares extrarrenales de expresión de CYP27B1. En este estudio, evaluamos el papel de los monocitos en el metabolismo de la vitamina D3 mediante un bioensayo ex vivo. Además, estimulamos los monocitos con antígeno derivado del MTB para obtener más información sobre cómo los monocitos modulan el metabolismo de la vitamina D3 en respuesta al desafío bacteriano.
2. Materiales y métodos
2.1. Población de sujetos
Este estudio se realizó en la Universidad Médica de Kaohsiung. Los participantes fueron estratificados en dos grupos: (1) tuberculosis activa y (2) contacto frecuente con la tuberculosis. Aquellos con tuberculosis pulmonar activa confirmada por un cultivo de esputo y una placa de tórax fueron asignados al grupo de tuberculosis activa (). Los contactos frecuentes con la TB () incluían a los siguientes: (1) el personal médico que había trabajado en el centro de TB durante al menos 10 años y nunca se había infectado y (2) los familiares de los pacientes de TB, los clínicos y las enfermeras que tenían un contacto prolongado con los pacientes de TB y nunca se habían infectado. Todos los contactos frecuentes de TB habían sido vacunados con BCG y se sometieron a una radiografía de tórax anual; cuando las placas de tórax eran anormales, se realizaba una prueba de Mantoux. Se excluyeron los sujetos con diabetes, neoplasias o cualquier otra enfermedad que pudiera causar inmunodeficiencia. Los dos grupos estaban emparejados por sexo y edad (Tabla 1).
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| La duración de la enfermedad se definió como el intervalo desde el diagnóstico hasta la extracción de sangre. La duración de la exposición se definió como el intervalo desde el inicio del trabajo en un centro de TB hasta la extracción de sangre. |
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2.2. Preparación de las células
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se aislaron de la sangre tratada con heparina recogida de los 2 grupos de donantes utilizando un gradiente estándar de Ficoll-Paque (Pharmacia, Uppsala, Suecia). Las PBMC (células/mL) se resuspendieron en medio RPMI 1640 suplementado con L-glutamina y 10% de suero fetal de ternera. Tras la incubación durante 1 hora en un matraz de 75 cm2 en un incubador humidificado a 37°C, 5% de CO2, el medio que contenía las células no adherentes se decantó en un tubo cónico, y el matraz se lavó dos veces con medio libre de suero para eliminar cualquier célula no adherente residual. Los monocitos adherentes se eliminaron mediante un raspado suave con un raspador celular de plástico. Las células se transfirieron a un tubo cónico, se centrifugaron para eliminar la solución de lavado y se resuspendieron a células/mL en medio suplementado. La población celular adherente contenía más del 85% de células CD14+.
2.3. Antígeno
La TBM aislada de pacientes con tuberculosis se resuspendió en solución salina tamponada con fosfato y se mató por calor en un baño de agua a 70°C durante 70 minutos. A continuación, las bacterias se sonicaron con un sonicador New Highway (Farmingdale, NY, EE.UU.). La concentración de proteínas del homogeneizado bacteriano se determinó utilizando el kit de ensayo de proteínas BCA de Pierce (IL, EE.UU.) y se almacenó a -20°C.
2.4. Análisis citofluorométrico
El análisis citométrico se realizó utilizando un citómetro FACS (Becton Dickinson). Se incubaron un total de células con cada anticuerpo monoclonal en cantidades saturantes en 50 μL de tampón de tinción (solución salina equilibrada de Hank: 1% de BSA y 0,1% de azida sódica) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se lavaron tres veces con PBS. Las células se prepararon para el análisis mediante la suspensión en 500 μL de paraformaldehído al 1% en PBS. La población de monocitos se separó para el análisis basándose en un gráfico de puntos de dispersión lateral y frontal. Se utilizó un total de 5.000 células separadas para cada análisis. Las células seleccionadas se analizaron además mediante tinción de fluorescencia utilizando anti-CD14 conjugado con fluoresceína-isotiocianato (FITC) (Ancell).
2.5. Cuantificación de 1,25(OH)2D3
Se cultivaron monocitos purificados a una densidad de células/mL en 100 μL en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos con 200 nM de 25(OH)D3 disuelta en una concentración final de etanol al 1%. Tras 3 horas de incubación, se añadió 1 mL de acetonitrilo para detener la reacción. Las células y el medio se cosecharon y se combinaron con un volumen igual de metanol para eliminar los lípidos. La cantidad de 1,25(OH)2D3 se determinó utilizando el kit RIA de 1,25-dihidroxivitamina D 125I (INCSTAR, Stillwater, MN, USA). Brevemente, se añadieron 2 mL de agua y 5 mL de metanol/agua (70 : 30) a un cartucho de C18OH para eliminar las sales, los lípidos polares y los pigmentos bajo vacío. A continuación, se añadieron 5 mL de hexano/cloruro de metileno (90 : 10) al cartucho de C18OH para eliminar la 25(OH)D3, y 5 mL de hexano/isopropanol (99 : 1) para eliminar la 24,25(OH)2D3/25,25(OH)2D3. Cada cartucho de C18OH estaba ajustado dentro de un cartucho de sílice. Tras añadir hexano/isopropanol (92 : 8) al vacío, se retiró el cartucho de C18OH. Finalmente, la 1,25(OH)2D3 purificada se eluyó del cartucho de sílice en 5 mL de hexano/isopropanol (80 : 20). Los niveles de 1,25(OH)2D3 se cuantificaron mediante radioinmunoanálisis competitivo (RIA) utilizando anticuerpos anti-1,25(OH)2D3 y anti-1,25(OH)2D3 marcados con 125I.
2.6. Tratamiento con antígenos MTB
Los monocitos ( células/mL) se incubaron con 10 μg/mL de MTB y 200 ng/mL de 25(OH)D3. Tras 3 horas de incubación, se añadió 1 mL de acetonitrilo para detener la reacción. La 1,25(OH)2D3 resultante se purificó de las células y del medio y se cuantificó por RIA. El resto del procedimiento fue el mismo que para el ensayo anterior.
2.7. Análisis estadístico
Todos los datos se analizaron mediante la prueba de Student.
3. Resultados
3.1. Concentraciones de calcio ionizado y 1,25 dihidroxivitamina D3 en un paciente con tuberculosis activa y uremia
Se determinó el calcio ionizado en suero y la 1,25(OH)2D3 en diferentes momentos desde la primera visita hasta un año después de finalizar el tratamiento antituberculoso. Como se muestra en la Figura 1, los niveles de calcio ionizado se correlacionaron con la concentración de 1,25(OH)2D3 (Figura 1).
3.2. Población del estudio
Se reclutaron 25 individuos en el grupo de contactos frecuentes con TB y 25 pacientes en el grupo de TB activa. La media de edad y la proporción de sexos no difirieron significativamente entre los grupos. Las características del conjunto de datos se presentan en la Tabla 1.
3.3. Cuantificación de 1,25(OH)2D3
Se cultivaron monocitos con 25(OH)D3 durante 3 horas. A continuación, se purificó la 1,25(OH)2D3 de las células y del medio y se midió por RIA. Como se muestra en la figura 2, la cantidad de 1,25(OH)2D3 en el grupo de TB activa era de pg/mL (media ± SD), que era significativamente mayor que la del grupo de contacto frecuente con la TB () (). Cuando los monocitos se incubaron simultáneamente con MTB y 25(OH)D3 durante 3 horas, la cantidad de 1,25(OH)2D3 en el grupo de TB activa disminuyó significativamente en comparación con el grupo sin MTB ( y , respectivamente) () (véase la figura 3). No hubo diferencias entre los monocitos con o sin exposición a la TB en el grupo de contactos frecuentes con la TB ( y , resp.).
Cuantificación de 1,25(OH)2D3 en pacientes con TB activa y contactos frecuentes con la TB. Medición por RIA de la 1,25(OH)2D3 purificada a partir de suspensiones de monocitos cultivadas con 25(OH)D3 durante 3 horas. La cantidad de 1,25(OH)2D3 en el grupo de tuberculosis activa fue significativamente mayor que en el grupo de contactos frecuentes con tuberculosis. Cada columna representa la media de la cuantificación de 1,25(OH)2D3. Las barras de error representan la desviación estándar. *Figura 3
Cuantificación de 1,25(OH)2D3 en pacientes con TB activa y contactos frecuentes de TB con o sin antígeno de M. tuberculosis (MTB). Los monocitos fueron pulsados con 25(OH)D3 con o sin MTB. La cantidad de 1,25(OH)2D3 con la exposición a la MTB disminuyó significativamente en comparación con la del grupo sin MTB. Cada columna representa la media de la cuantificación de 1,25(OH)2D3. Las barras de error representan la desviación estándar. *.
4. Discusión
Observamos que los niveles de 1,25(OH)2D3 se correlacionan con los niveles de calcio ionizado en un paciente urémico con tuberculosis pulmonar. En la tuberculosis pulmonar activa, los niveles séricos de 1,25(OH)2D3 en este paciente eran elevados, lo que a su vez inducía niveles elevados de calcio ionizado. Tras el tratamiento, tanto los niveles de 1,25(OH)2D3 como los de calcio ionizado disminuyeron. Teóricamente, en un paciente urémico, la actividad renal del CYP27B1 es trivial. Los niveles séricos de 1,25(OH)2D3 son bajos y se observan a menudo en pacientes urémicos. En consonancia con lo observado en humanos, en un modelo de ratón anéfrico también se observan niveles bajos de 1,25(OH)2D3 . Sin embargo, se ha descrito una fuente extrarrenal de CYP27B1 desde hace más de 6 décadas. Harrell y Fisher fueron de los primeros en encontrar la síntesis extrarrenal de 1,25(OH)2D3 en condiciones patológicas . Estos autores establecieron la asociación entre la homeostasis del calcio desregulada y la sarcoidosis. Posteriormente se demostró que los macrófagos tisulares eran una fuente extrarrenal de producción de 1,25(OH)2D3 en estos grupos de pacientes. Diferentes grupos de estudio descubrieron que un número creciente de tejidos expresaban el CYP27B1, como los melanocitos de la piel, los macrófagos tisulares y las células residuales de la placenta . Sorprendentemente, no todas las células que expresan CYP27B1 poseen actividad enzimática . Para aclarar la posibilidad de que los monocitos circulantes contribuyan a los niveles elevados de 1,25(OH)2D3, utilizamos un bioensayo ex vivo utilizando 25(OH)D3 como sustrato para determinar la actividad de CYP27B1. Nuestros resultados demuestran que la actividad del CYP27B1 en los monocitos de pacientes con tuberculosis activa es significativamente mayor que la de los monocitos de individuos con contacto frecuente con la tuberculosis. Los monocitos circulantes contribuyen a la conversión de 25(OH)D3 en la más activa 1,25(OH)2D3. Curiosamente, tradicionalmente se consideraba que la vitamina D3 era un factor endocrino; la 1,25(OH)2D3 producida en sitios locales (túbulos renales) es transportada por la sangre para afectar a otros tejidos u órganos, por ejemplo, el hueso. Sin embargo, en las últimas décadas se ha demostrado que la vitamina D3 desempeña otras funciones además de las endocrinas. La 1,25(OH)2D3 producida por las células inflamatorias puede estimular la expresión del receptor de la vitamina D tanto en las células vecinas como en las propias células inflamatorias. Al unirse al receptor de la vitamina D y al receptor de retinoides, el complejo ligando-receptor puede unirse a los promotores de muchos genes inflamatorios. Debido a estos efectos, se consideró que la vitamina D3 tenía funciones tanto paracrinas como autocrinas. En contraste con la función endocrina de la vitamina D3 como regulador del calcio, sus funciones paracrinas y autocrinas inducen a las células inflamatorias a producir péptidos antibacterianos y aumentan el proceso de autofagia. Dado que la 1,25(OH)2D3 se produce localmente y no se transporta a los lugares de destino para la regulación de la homeostasis del calcio, su producción no afecta a los niveles de calcio sérico. Curiosamente, en este estudio, encontramos que la 1,25(OH)2D3 producida por los monocitos era un caso especial. Aunque la 1,25(OH)2D3 producida por los monocitos puede actuar localmente, estas células son transportadas por la sangre a los tejidos de todo el cuerpo. La 1,25(OH)2D3 producida por los monocitos también se comporta como un factor endocrino. Los monocitos pueden ser las únicas células de nuestro cuerpo que pueden orquestar las funciones endocrinas, paracrinas y autocrinas de la vitamina D3. Una cuestión interesante es cuál es la contribución relativa de la fuente monocítica de 1,25(OH)2D3 al nivel total de 1,25(OH)2D3. Dusso et al. observaron que la producción máxima de 1,25(OH)2D3 de los monocitos es trivial (en fmole/hora/microgramo de ADN) en comparación con la concentración de 1,25(OH)2D3 en la normalidad (en pmol/mL) . Pero los datos proceden de un experimento ex vivo, no sabemos cuántos monocitos del organismo son estimulados para producir 1,25(OH)2D3. Especulamos que la contribución relativa de la fuente monocítica de 1,25(OH)2D3 al nivel total de 1,25(OH)2D3 es pequeña en la mayoría de las circunstancias. Incluso en pacientes con enfermedad granulomatosa, sólo unos pocos presentan síntomas clínicos de hipercalcemia como consecuencia de un nivel elevado de 1,25(OH)2D3. Nuestro caso indicador es uno de ellos.
También encontramos que cuando los monocitos de pacientes con TB activa se cultivan con antígeno MTB, la conversión de 1,25(OH)2D3 es significativamente menor que cuando no se añade ningún antígeno. En el grupo de contacto frecuente con la TB, no hubo diferencias entre estar con o sin antígeno MTB. Hay dos posibles explicaciones para esta observación. En primer lugar, los monocitos cebados de pacientes con TB activa pueden inducir más actividad de la 24(OH) hidroxilasa (CPY24) que sus homólogos, que hidroxila activamente la 1,25(OH)2D3 a ácido calcitróico, cuando se les estimula además con antígeno MTB. La vitamina D3 induce no sólo productos genéticos inflamatorios sino también la expresión de CPY24. La CPY24 es una importante enzima catabólica de la vitamina D3. Las actividades de CYP27B1 y CYP24 se modulan de forma diametralmente opuesta para controlar los niveles séricos de 1,25(OH)2D3 . Debido a esta acción concertada, rara vez se observa hipercalcemia en los pacientes. El grupo de contacto frecuente con la tuberculosis demostró una acción concertada aún mejor, razón por la cual no hubo cambios en la conversión de 1,25(OH)2D3 tras la estimulación con antígeno MTB. Una segunda explicación es que la actividad de CPY27B1 se agota cuando los monocitos son reestimulados por el antígeno MTB.
La expresión del ARNm no se determinó en este estudio por las siguientes razones. En primer lugar, se requirió un gran número de monocitos de los participantes para el bioensayo ex vivo. Si realizáramos tanto la expresión cuantitativa de ARNm como el bioensayo ex vivo, habríamos necesitado recoger más de 30 mL de sangre de cada participante. La recogida de este volumen de sangre fue rechazada por nuestro comité ético. En segundo lugar, como se indicó anteriormente, algunos tejidos pueden expresar el CYP27B1 sin una actividad enzimática detectable. Los niveles de ARNm no siempre están correlacionados con la actividad enzimática. A pesar de la expresión del CYP27B1 en algunos tejidos, no se detectó actividad enzimática. En futuros estudios, deberían cuantificarse los niveles de CYP27B1 y CYP24 y los metabolitos de la vitamina D3, como el ácido calcitróico y el 24,25(OH)2D3, para aclarar el metabolismo de la vitamina D3 en el proceso fisiopatológico de la tuberculosis.
5. Conclusión
En conclusión, los niveles de calcio se correlacionaron con los niveles de 1,25(OH)2D3 en un paciente urémico infectado con tuberculosis. Además, descubrimos que la actividad de CYP27B1 en los monocitos es mayor entre los pacientes con tuberculosis activa que entre los que tienen un contacto frecuente con la tuberculosis.
Aprobación ética
Este proyecto de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional del Hospital de la Universidad Médica de Kaohsiung. El número de aprobación es KMUH-IRB-20130103.
Conflicto de intereses
Los autores declaran que no hay conflicto de intereses para este trabajo.
Contribución de los autores
Yi-Ching Tung y Wen-Chan Tsai realizaron los experimentos y escribieron el artículo. Tsan-Teng Ou y Wen-Chan Tsai diseñaron el estudio y recogieron los especímenes. Todos los autores leyeron y aprobaron el artículo final.