Resultater og diskussion
For bedre at forstå dannelsen og reparationen af AP-steder som følge af base excision repair og spontan depurination/depyrimidination in vivo, målte vi antallet af endogene AP-steder i genomisk DNA ekstraheret fra forskellige væv fra voksne rotter og menneskelig lever af transplantationskvalitet ved hjælp af ASB-assayet (3). Antallet af endogene AP-steder varierede meget fra væv til væv (Fig. 1)⇓ men ikke inden for væv. Det højeste antal AP-steder blev påvist i hjernen med 30 AP-steder pr. 106 nukleotider, efterfulgt af hjertet og tyktarmen. I modsætning hertil viste rotteelever, -nyre og -lunge konsekvent det laveste antal AP-steder (8-9 AP-steder pr. 106 nukleotider). Antallet af endogene AP-steder i menneskelig lever var sammenligneligt med antallet i rottelever. Disse data tyder på, at AP-stederne vedvarer ved 50 000-200 000 læsioner pr. pattedyrcelle under normale fysiologiske forhold. Det stationære antal AP-steder i genomisk DNA bør afspejle balancen mellem dannelse og reparation af AP-stederne. Mulige fortolkninger af det højere antal endogene AP-steder i hjernen er som følger (a) højere depurineringshastighed og/eller endogen DNA-adduktdannelse, hvilket resulterer i flere AP-steder; (b) højere aktivitet af DNA-glykosylase, hvilket inducerer flere AP-steder; (c) lavere aktivitet af type II AP-endonuklease, hvilket forårsager ophobning af AP-steder; og (d) mindre effektivitet af dRp-ase eller β-elimination, hvilket efterlader 5′-nicked AP-steder.
Endogene AP-steder i væv fra rotter og mennesker. DNA blev ekstraheret ved 4 °C fra intakt rottevæv og normal menneskelig lever, og antallet af AP-steder blev målt ved hjælp af ASB-assayet. A, typisk røntgenfilm, der viser endogene AP-steder i rottevæv. DNA (herunder standard-DNA-prøver) blev indlæst på en NC-membran (1,5 μg pr. slot). B, scanningsdensitometriske data for endogene AP-steder i væv fra rotter og mennesker. Søjler, middelværdier fra duplikerede slots af fem til otte individuelle prøver; søjler, SD.
Den vigtigste proces i reparationen af AP-steder er den type II AP-endonuklease-/β-pol-afhængige vej (7). Type II AP-endonuklease kan genkende AP-steder og skære fosfodiesterryggen umiddelbart 5′ til læsionerne og efterlade en 3′-hydroxylgruppe og en 5′-AP-stedterminus (5). 5′-dRp frigøres derefter, og det enkelte nukleotidgab udfyldes. Det er blevet påvist, at der findes betydelige mængder AP-endonuklease af type II i kernen af pattedyrceller (8). Vi har tidligere vist, at kombinationen af ASB-assay og type II AP-endonuklease eller NaOH inducerer henholdsvis 3′- eller 5′-spaltning af AP-steder (3). For at forstå aktiviteten af AP-endonuklease og dRp-ase in vivo har vi yderligere optimeret AP-stedspaltningsassayet. I dette forsøg anvendte vi Exo III som type II AP-endonuklease til at identificere 3′-spaltning af AP-steder og putrescin til at påvise 5′-nicks (fig. 2)⇓. For at karakterisere dette AP-stedspaltningsassay inkuberede vi DNA, der var blevet forbehandlet med MX for at reducere antallet af AP-steder til 3,8 ± 0,5 AP-steder pr. 106 nukleotider (gennemsnit ± SD), med varme og syrebuffer. Forskellige perioder med varme/syreinkubation inducerede 11, 47, 115 og 320 AP-steder pr. 106 nukleotider. En enkelt behandling med Exo III reducerede antallet af AP-steder med 4-10 AP-steder pr. 106 nukleotider i hver DNA-prøve, uanset det oprindelige antal tilstedeværende (fig. 3)⇓. Denne reduktion kan skyldes kombinationen af enzymatisk snit på 5′-siden af Exo III og uspecifik 3′-spaltning af AP-steder under inkubation med Exo III. Denne uspecifikke 3′-spaltning udelukker en præcis kvantificering af antallet af 3′-nicked AP-steder i DNA med denne test. Putrescinbehandling viste derimod ingen reduktion i antallet af AP-steder. Efter inkubation med Exo III efterfulgt af putrescin blev antallet af AP-steder reduceret til det oprindelige antal AP-steder i kalvehymus-DNA, der var forbehandlet med MX. Spaltningseffektiviteten af AP-stederne ved kombinationen af Exo III og putrescin var >99%.
Skema for AP-stedspaltningsassay. For bedre at forstå aktiviteterne af type II AP-endonuklease samt dRp-ase in vivo bestemte vi eksistensen af spaltninger på 5′- eller 3′-siden af AP-steder i genomisk DNA. Putrescin og Exo III (type II AP-endonuklease) efterlader henholdsvis 3′-kløvede og 5′-kløvede AP-steder. For intakte AP-steder uden snit på 3′- og 5′-siden af AP-stederne kan ASB-assayet teoretisk set påvise det oprindelige antal AP-steder efter behandling med enten Exo III eller putrescin, fordi AP-stederne forbliver på DNA-ryggen efter snit på begge sider af fosfodiesterbindingen ved siden af AP-stedet. Kombinationen af Exo III og putrescin klipper imidlertid både på 3′- og 5′-siden af AP-stedet , hvilket resulterer i, at AP-stedet frigøres fra DNA-ryggen . Sådanne frigjorte AP-steder påvises ikke ved denne test. På grundlag af antallet af AP-steder, der er tilbage på DNA-ryggen efter denne spaltningsreaktion, kan antallet af 5′- og 3′-spaltede AP-steder anslås. Hvis der er 5′-spaltede AP-steder i DNA’et, kan putrescin-behandling frigøre de 5′-spaltede AP-steder ved 3′-spaltning af AP-stederne . På samme måde kan 3′-nicked AP-steder i DNA frigøres ved 5′-ekskision ved hjælp af Exo III .
AP-stedspaltningsassay af kalvthymus-DNA behandlet med varme/syrebuffer. For at validere AP-stedspaltningsassayet undersøgte vi virkningerne af Exo III og putrescin på intakte AP-steder, der er induceret i kalvehinde-DNA. Det oprindelige antal AP-steder i kalvehinde-DNA blev reduceret med MX (CTD/MX). DNA blev derefter inkuberet i varme/syrebuffer i forskellige tidsrum for at indføre forskellige antal intakte AP-steder (-/-; Ref. 9). DNA blev inkuberet med Exo III og/eller putrescin, og antallet af resterende AP-steder i kalvehinde-DNA blev målt ved hjælp af ASB-assayet . Søjler, middelværdier fra duplikerede slots af tre individuelle prøver; søjler, SD. A, AP-stedspaltningsassay af DNA, der indeholder 115 AP-steder pr. 106 nukleotider. B, resumé af AP-stedspaltningsassay af DNA, der indeholder forskellige antal AP-steder.
Vi anvendte dette assay på genomisk DNA ekstraheret fra rotte- og menneskevæv for at karakterisere endogene AP-steder. Fraktionerne af intakte og spaltede AP-steder og resterende aldehydiske læsioner er opsummeret i fig. 4⇓. DNA fra rotte- og menneskevæv blev inkuberet med Exo III efterfulgt af putrescin for at undersøge, om de påviste læsioner var egentlige AP-steder. Efter 5′- og 3′-spaltning af AP-steder blev der påvist 1,5-2,2 resterende aldehydiske læsioner pr. 106 nukleotider. Disse data tyder på, at ASB-assayet korrekt måler endogene AP-steder. De resterende læsioner kan skyldes begrænsninger i enzymreaktionerne i AP-stedspaltningsassayet samt tilstedeværelsen af endogene aldehydiske baselæsioner som f.eks. formyluracil (10). Desuden blev der påvist en kombineret fraktion af 3′-spaltede og intakte AP-steder på ∼2-3 læsioner pr. 106 nukleotider i forskellige væv, hvilket svarer til ∼1/3-1/10 af det samlede antal endogene AP-steder. For at undersøge antallet af 5′-spaltede AP-steder inkuberede vi DNA med putrescin. Reduktionen af AP-steder ved putrescin (det oprindelige antal AP-steder minus det antal AP-steder, der var tilbage efter putrescininkubationen) repræsenterede antallet af 5′-spaltede AP-steder. I modsætning til kalve-thymus-DNA, der var forbehandlet med varme/syrebuffer, havde genomisk DNA, der var behandlet med putrescin, et markant reduceret antal AP-steder. Disse data tyder på, at ca. to tredjedele eller mere af de endogene AP-steder allerede er spaltede på 5′-siden af AP-stederne in vivo.
Resumé af AP-stedspaltningsassay af DNA fra rotte- og menneskevæv. Det oprindelige antal AP-steder som beskrevet i legenden til fig. 1B⇓ bestod af 5′-spaltede, 3′-spaltede, intakte AP-steder og resterende aldehydiske læsioner. Antallet af 5′-spaltede AP-steder blev beregnet som det oprindelige antal AP-steder minus det antal AP-steder, der var tilbage efter behandling med putrescin alene. Den kombinerede fraktion af 3′-spaltede og intakte AP-steder var forskellen mellem putrescin-behandling og kombinationsbehandling med Exo III og putrescin. Resterende AP-steder viste antallet af ikke-spaltede aldehydiske læsioner.
Efter 5′-spaltning af AP-stederne med type II AP-endonuklease skal de snittede AP-steder efterfølgende frigøres fra DNA-ryggen via excision af 5′-dRp-rester. Denne frigørelsesproces udføres muligvis af dRp-ase via en hydrolytisk reaktion (11) eller β-elimination (12) eller via et endonukleolytisk enzym, der skærer nedstrøms fra 5′-dRp-grupperne (13). Det er blevet påvist, at Xenopus og humant β-pol frigiver 5′-dRp ved β-elimination (14). Ved hjælp af reparationsplasterstørrelse enten i β-pol-null- eller -proficient-celler er det blevet påvist, at en enkelt gap-reparationsvej var fremherskende i β-pol-proficient-celler, men ikke i β-pol-null-celler (15). Desuden fremskynder interaktionen mellem human AP-endonuklease og β-pol frigivelsen af 5′-dRp-rester in vitro (16). 5′-dRp-delenes reparationseffektivitet er imidlertid ikke blevet velkarakteriseret i celler eller in vivo. Ved hjælp af cellefrie gærcelleekstrakter er det blevet konstateret, at behandlingen af 5′-dRp-delen er et hastighedsbegrænsende trin under baseekskisionsreparation af uracil-holdigt DNA (17). Endvidere blev den katalytiske effektivitet af β-pol til at fjerne 5′-dRp undersøgt (18). Interessant nok var Kcat for 5′- dRp-aseaktiviteten af β-pol ∼100 gange lavere end Kcat for AP-endonuklease. Denne undersøgelse viser en klar persistens af 5′-inciterede AP-steder i væv fra rotter og mennesker. Disse data tyder på, at incision af AP-endonuklease og den efterfølgende frigivelse af 5′-dRp-rester muligvis ikke er effektivt forbundet på et basalt niveau in vivo, og at reparationsprocessen af 5′-dRp kan være et af de hastighedsbegrænsende trin i baseekskisionsreparation.
I den tidligere undersøgelse (3) viste vi, at spontan depurination fandt sted med 1,5 AP-steder pr. 106 nukleotider pr. dag under fysiologiske forhold. For at teste, om varmelabile DNA-addukter såsom N3- og N7-alkylpuriner var kilden til det højere antal endogene AP-steder i hjernen, blev der udført en depurineringsassay i hjerne- og lever-DNA. Der blev imidlertid ikke observeret nogen forskel i hjerne og lever (data ikke vist). Derfor kan den stabile tilstand af endogene AP-steder ikke skyldes labile baselæsioner. En af de vigtigste og mest udbredte endogene DNA-læsioner er oxidativ DNA-baseskade. Det er blevet rapporteret, at den stationære tilstand af 5-hydroxycytosin i rottehjerne er ∼2 gange højere end i rottelever (19). Sådanne oxidative pyrimidinbaser repareres af End III og efterlader AP-steder på DNA-ryggen. For at undersøge, om oxidativ stress kunne være relateret til steady-state antallet af AP-steder i DNA, blev End III-følsomme steder kvantificeret ved hjælp af en kombination af ASB-assayet og E. coli End III. Antallet af End III-følsomme steder var tre gange højere i hjernen (14 læsioner pr. 106 nukleotider) sammenlignet med andre væv (4-5 læsioner pr. 106 nukleotider). For nylig er det menneskelige homolog af End III-genet (hNTH1) blevet klonet og karakteriseret (20). Dette gens mRNA-ekspression varierer fra organ til organ efter et mønster, der svarer til antallet af endogene AP-steder (20). De fleste DNA-glykosylaser, der er involveret i reparation af oxiderede baser, har AP-lyaseaktivitet, som kløver 3′-siden af AP-stederne. Derfor ville endogene 5′ AP-steder ikke stamme fra sådanne DNA-glykosylasers spaltning af oxiderede baser. Et indledende forsøg viste, at hydrogenperoxid med FeSO4 direkte inducerede 5′-spaltede AP-steder i kalvthymus-DNA uden nogen enzymer (data ikke vist). Disse undersøgelser tyder på, at oxidativ stress kan være en af de faktorer, der er ansvarlige for den stabile tilstand af AP-steder med 5′-spaltning.
Vi forventede oprindeligt at finde et lavt antal endogene AP-steder i genomisk DNA på grund af deres toksicitet og mutagenicitet. Denne undersøgelse viser imidlertid, at den stationære tilstand af AP-steder er ∼1 læsion pr. 105 nukleotider i genomisk DNA. Selv om AP-stederne konstant repareres, er det sandsynligt, at den del af AP-stederne, der undslipper reparation, bidrager til mutationer, kromosomaberrationer og transkriptionsfejl, som kan være forbundet med spontane aldersrelaterede sygdomme som kræft og degenerative lidelser.