CSC’er i Brca1-mutante kræftceller medierer cellemigration in vitro
Vi har tidligere isoleret CD24+CD29+ celler og CD24+CD49f+ celler, der er beriget for kræftinitierende celler eller CSC’er fra primære mammatumorer udviklet i Brca1-mutante mus eller fra en dyrket cellelinje, (W0069), som stammer fra en Brca1-mammatumor.39 For at teste disse cellers rolle i metastase sorterede vi CD24+CD29+-celler (skal kaldes CSC’er) og CD24-CD29-celler (ikke-CSC’er) fra W0069-cellinjen, der som tidligere vist indeholder ca. 15 % CD24+CD29+-celler,39 og vi undersøgte migrationsevnen ved hjælp af både sårhelings- og transwell-assays. Efter 24 timer udviste CD24/CD29 dobbelt-positive celler bedre migrationsevne sammenlignet med de dobbelt-negative celler, som det fremgik af sårstørrelsen (Figur 1a). Transwell-migrationsassay afslørede også en signifikant forskel i antallet af migrerede celler både på filterets bundflade (175,6±19 vs. 54,2±18,1, **P<0,01) og det nederste kammer i transwell (82,3±5,5 vs. 4,3±2,1 kolonier, **P<0,01) (Figur 1b). Lignende resultater blev opnået, da vi undersøgte forskellige subkloner afledt af samme cellelinje, som enten var positive eller negative for tilstedeværelsen af CSC’er (data ikke vist). For at bekræfte, at CSC’er har øget motilitet, blandede vi forskellige mængder W0069-celler med dobbeltnegative celler sorteret fra W0069-cellinjen. Som vist i figur 1c faldt migrationsevnen, efterhånden som antallet af dobbeltpositive celler blev mindsket, selv om det samlede antal anvendte celler forblev stabilt ved at øge antallet af CD24-CD29-celler. Ved at starte med 5 × 104 W0069-celler fandt vi, at de migrerede celler dannede 52,6 ± 15,5 kolonier i det nederste kammer. Når 4 × 104 W0069-celler blev blandet med 1 × 104 dobbeltnegative celler, blev antallet af kolonier reduceret til 16±2,6. Antallet af kolonier faldt yderligere, når vi fortsatte med at reducere antallet af W0069-celler og øge antallet af CD24-CD29-celler (figur 1c). Samme resultater blev opnået, da W0069-celler blev blandet med en subklon (W0069-202), som kun har CD24-CD29-celler (Supplerende figur 1a og b). Omvendt viste vi, at antallet af kolonier blev forøget, når antallet af anvendte CD24+CD29+ celler blev gradvist forøget (Supplerende figur S1c). For yderligere at verificere CSC’ernes rolle i migrationen blev W0069-grønt fluorescerende protein-mærkede celler, der var positive for tilstedeværelsen af CSC’er, anvendt og blandet med sorterede ikke-mærkede CD24-CD29- celler. Ved at øge antallet af positive celler bemærkede vi en stigning i antallet af kolonier dannet af de migrerede celler, og alle de dannede kolonier var grønne, da de blev kontrolleret under et fluorescensmikroskop, hvilket antyder, at migration kun kan ses, når CD24+CD29+ celler er til stede i cellekulturen (figur 1d og e). Tilsammen tyder disse data på, at CSC’er udviser øget motilitet i Brca1-muterede kræftcellelinjer.
CSC’er fra Brca1-muterede celler udviser øget migrationsevne. (a) Cellemigration blev analyseret i CD24/CD29 dobbeltpositive og negative celler for tilstedeværelsen af CSC’er ved hjælp af sårhelingsassay. Sorte linjer angiver grænserne for de migrerende celler ved forsøgets afslutning (t=24 timer) (øverst: lav forstørrelse, nederst: høj forstørrelse). Der blev anvendt tre gange hver enkelt brønd pr. tilstand. (b) Transwell-migrationsassay af celler, der er positive (øverste paneler) og negative (nederste paneler) for CSC’er. Karakteristiske billeder af migrerede celler i bunden af filteret (til venstre) og kolonier fra migrerede celler i det nederste kammer (til højre). Kvantificering af migrerede celler både i bunden af filteret og i det nederste kammer af pladen er vist (**P<0,01). (c) Cellernes migrationsevne efter blanding af et nedsat antal positive og et øget antal negative (P/N) celler. Billeder fra kolonier er repræsentative for tre forskellige eksperimenter. Tallene (50, 40, 30, 20, 20, 10, 0) henviser til tusinder af enten positive eller negative celler, der blev anvendt i dette forsøg. (d, e) Transwell motilitetsassay blev udført ved at øge antallet af GFP-mærkede positive celler og holde antallet af ikke-mærkede negative celler stabilt (d). Kolonier blev kontrolleret for tilstedeværelse af fluorescens (e).
CSC’er i Brca1-mutant cancer medierer cancermetastase in vivo
Næst vurderede vi den potentielle rolle af CSC’er i metastase in vivo. Frisk sorteret CD24+CD29+ og CD24-CD29- celler samt subkloner positive eller negative for de samme markører fra W0069-cellinjen blev implanteret i brystkirtlen hos 6-8 uger gamle jomfruathymiske (nøgen) mus. Først bemærkede vi, at tumorvæksten var langsommere, når sorterede CD24-CD29- celler blev sammenlignet med CD24+CD29+ celler (figur 2a og b), hvilket er i overensstemmelse med en opfattelse, at denne population beriger for CSC’er.39 Lignende resultater blev opnået, når der blev anvendt subkloner, der enten var positive eller negative for tilstedeværelsen af CSC’er (data ikke vist). Selv om mus, der blev injiceret med CD24+CD29+ celler, måtte aflives tidligere (dag 49-54) end mus, der blev injiceret med CD24-CD29- celler (dag 60-69) på grund af større tumorbyrder, var der en signifikant stigning i tilstedeværelsen af metastaser i gruppen af mus, der blev injiceret med CD24+CD29+ celler. Især havde 3/15 mus, der var implanteret med negative cellelinjer, én lille tumorknude i lungen pr. mus (figur 2c og d). I modsætning hertil blev det konstateret, at 13/18 mus, der var implanteret med positive cellelinjer, havde metastaserende knuder i lungerne med i alt over 100 knuder (dette antal kan være undervurderet, fordi størrelsen af de fleste knuder var meget større, og knuderne kunne ikke tælles nøjagtigt, når der var for mange i en lunge) (figur 2c og d). Da der var omkring en syvdobbelt (5000mm3/700mm3) forskel i primær tumorstørrelse mellem de positive og negative tumorer, havde vi overvejet en mulighed for, at forskellen i metastasering kan tilskrives forskellen i tumorvækst. Det er imidlertid kendt, at tumormetastase starter i indledende stadier, når tumorerne er små, snarere end i sene stadier, når de er store,40 hvilket taler imod denne mulighed. Desuden er forskellen i knudernes antal ca. 33 gange større (100/3), og de fleste knuder, der stammer fra dobbeltpositive celler, er meget større end dem fra dobbeltnegative celler, hvilket understreger de to subpopulationers forskellige metastatiske evne. Hvad angår oprindelsen af de tre metastatiske knuder, er det muligt, at den dobbeltnegative population stadig kan indeholde nogle celler, der har lavere kræftinitierende og metastatiske evner. Alternativt kan nogle CD24-CD29-celler få disse evner gennem de-differentiering. Dette er interessante spørgsmål, som fortjener yderligere undersøgelser.
CSC’er formidler metastase in vivo. (a, b) Tumordannelse i nøgenmus, der er injiceret med enten CD24/CD29 dobbelt positive eller negative for CSC’er-celler. 2 × 105 celler fra cellelinjer udviklet efter frasortering af enten CD24+CD29+ eller CD24-CD29- celler fra Brca1-mutante W0069-celler blev injiceret i den højre brystfedtpude hos immunsupprimerede hunmus. Tumorstørrelsen blev målt med en skydelære, når der var synlige knuder. Tumorvolumen blev beregnet i mm3 ved hjælp af formlen V=1/2rxry2 (r er radius, og x, y henviser til hver akse). (c, d) Ved forsøgets afslutning blev alle mus fra de forskellige grupper (mus injiceret med enten positive eller negative for CSC’er) aflivet, og forskellige organer blev undersøgt for metastaserende knuder med et Leica MZ10F stereomikroskop. Karakteristiske billeder af metastaserende tumorknuder i lungerne er vist i (c), og antallet af mus med metastaser er vist i (d).
CD29 og CD49f har en kritisk rolle i formidlingen af kræftmetastase
Interessant nok viste profilering af disse metastaserende tumorer ved hjælp af fluorescensaktiveret cellesorteringsanalyse ved hjælp af CD24- og CD29-markører, at dem fra de dobbelt-positive cellelinjer havde en lignende profil som de primære tumorer eller den oprindelige kræftcellelinje (figur 3a, venstre). Da kun CSC’er inden for tumoren kan rekapitulere den oprindelige tumorheterogenitet, indikerer dette, at CSC’er metastaserer og driver dannelsen af de metastatiske tumorer. I modsætning hertil blev der ikke påvist nogen CD24- og CD29-dobbeltpositive celler i tumorer, der stammer fra de negative cellelinjer, selv efter at de har metastaseret (figur 3a, højre), som det fremgår af fluorescensaktiveret cellesorteringsanalyse. Desuden var vi i stand til at påvise CD24+CD29+ celler ved immunofluorescensfarvning i metastaserende knuder i lungen fra tumorer initieret ved implantation med CD24+CD29+ celler (Figur 3b), men ikke fra tumorer initieret ved implantation med CD24-CD29- celler (data ikke vist). I overensstemmelse med observationen af, at CD24+CD29+-celler har højere mobilitet end CD24-CD29-celler, blev der ved farvning med antistoffer mod CD24 og CD29 også påvist CD24+CD29+-celler i migrerende celler under sårhelingsassay (Figur 3c). Disse resultater understøtter ideen om, at CSC’er udviser øget bevægelighed både in vitro og in vivo og har en afgørende rolle i at drive den metastatiske evne hos Brca1-muterede mammatumorer.
Analyse af CD24+CD49+ celler i cellelinje, primære og metastatiske kræftformer. (a) Profilering af metastatisk tumor, primær mælketumor og oprindelig cellelinje for CSC-markører (CD24, CD29). Repræsentative eksempler på primære og metastaserende tumorer i mus, der er injiceret med enten positive (venstre) eller negative (højre) celler for CSC’er. (b) Immunofluorescens i en metastatisk lungetumor ved hjælp af CD24 og CD29 som markører for CSC’er. (c) Migrerende celler in vitro er positive for CSC-markører. Sårhelingsforsøg blev udført med W0069 Brca1-mutant kræftcellelinje. Migrerede celler blev farvet med antistoffer mod CSC-markørerne CD24 og CD29 ved immunofluorescens. (d) W0069-celler blev dyrket under forhold med lavt fasthæftningsniveau som tumorsfærer for at berige CSC’er og farvet med antistoffer mod CD24 og CD29 ved immunofluorescens. Til FACS-analyse blev cellerne farvet ved en koncentration på 1 × 106 celler pr. 100 μl buffer (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) med antistoffer mod CD24 (anti CD24-PE, BD Pharmingen), CD29 (anti CD29-FITC, Chemicon) og CD49f (anti CD49f-FITC, BD Pharmingen). Efter inkubation ved 4 °C i 25 minutter blev analysen foretaget ved hjælp af FACSCalibur flowcytometeret (Becton Dickinson). Til sortering af forskellige cellepopulationer blev samme procedure fulgt, og sorteringen blev udført ved hjælp af en FACSAria Cell Sorter (Becton Dickinson).
Både CD29 (β1-integrin) og CD49f (α6-integrin) er integrinunderenheder, der fungerer som receptorer for ekstracellulær matrix.41 Da ekstracellulær matrix er involveret i cellemobilitet og kræftmetastase,41 var vi interesserede i at afgøre, om CD29 og CD49f kun tjener som markører for CSC’er, eller om de faktisk har en kritisk rolle i formidlingen af kræftmetastase. Vi slog først CD29 ned i W0069- og CD24+CD29+-celler ved hjælp af et individuelt lille interfererende RNA (siRNA), der er rettet mod den åbne læseramme af CD29, og vores data afslørede en bemærkelsesværdig, men ikke statistisk nedsat cellevandring af siCD29-celler sammenlignet med kontrolceller (Figur 4a og b). Da CD29 og CD49f danner heterodimere, mistænkte vi, at CD49f kunne kompensere nogle funktioner, når CD29-ekspressionen var nedsat. For at undersøge dette slog vi dernæst CD49f ned med siRNA i disse celler (Figur 4a). Vores data viste, at knockdown af CD49f alene også reducerede cellemigrationsevnen en smule til lignende niveauer, som blev observeret i siCD29-behandlede celler (Figur 4b). Der blev imidlertid observeret en markant reduktion af cellemigrationen, men ikke af cellernes levedygtighed, når begge dele blev slået ned på samme tid (figur 4a-d). Samme resultater blev opnået ved at anvende en pulje af siRNA’er mod fire forskellige regioner i den åbne læseramme for disse gener (Supplerende figur 2a-c). Vi har også kontrolleret ekspressionen af fire beslægtede integriner (integriner α5 og 7 og integriner β2 og 3) efter at have slået CD29 og CD49f ned, og data viser, at disse siRNA’er ikke ændrede ekspressionen af andre integriner, hvilket udelukker krydsinhiberende aktivitet af disse siRNA’er over for andre integriner (Supplerende figur 2d). Samlet set antyder disse resultater, at integrinerne α6 og β1 kan have en overlappende, men kritisk funktionel rolle i CSC’ers migration. Ved at sortere cellerne ved hjælp af integriner α6 og β1 som markører beriger vi således faktisk de celler, hvor disse proteiner kan have en funktionel rolle i formidlingen af cellemigration in vitro og kræftmetastase in vivo.
CD29 (β1-integritin) og CD49f (α6-integritin) har en vigtig rolle i formidlingen af CSC’ers migration. (a) Realtids-RT-PCR-analyse for mRNA-niveauer efter at have slået CD29 og CD49f ned alene og sammen ved hjælp af Thermo Scientific Individual siRNA, der er rettet mod den åbne læseramme for hvert gen. Integrin α6 siRNA’et er D-040204-05-0002, og integrin β1 er D-040783-01-0002. Ikke-målrettet siRNA blev anvendt som kontrol. (b) Transwell-migrationsassay af W0069-celler. Kolonier fra migrerende celler er vist til venstre, og kvantificering af migrerede celler er vist til højre. (c) Celleproliferationsassay 24, 48 og 72 timer efter siRNA-nockdown i W0069-celler. (d) Transwell-migrationsassay af en dobbelt-positiv cellelinje afledt af W0069-celler. (e, f) Immunofluorescens i CD24+CD29+ og CD24-CD29- celler ved hjælp af antistoffer for E-cadherin og ZO-1 (e). Realtids-RT-PCR ved hjælp af primere for de gener, der er anført i grafen, i CD24+CD29+- og CD24-CD29- sorteret fra W0069-celler (f).
CSC’er udviste epithelial til mesenkymal overgangssignaturgenekspression
For at forstå den mekanisme, der ligger til grund for CSC’ernes forbedrede metastatiske evne, udførte vi morfologiske og molekylære analyser på både CD24+CD29+ og CD24-CD29- celler. Vores analyse viste, at CD24-CD29-cellerne udviste mere fremtrædende membranbundet E-cadherin, en markør for epithelceller, end CD24+CD29+-celler (figur 4e). qRT-PCR-analyse påviste også højere ekspressionsniveauer af E-cadherin i CD24-CD29-celler end CD24+CD29+-celler (figur 4f). I overensstemmelse med de reducerede ekspressionsniveauer af E-cadherin udviste CD24+CD29+ celler også højere ekspressionsniveauer af flere markørgener for mesenkymale celler som afsløret ved qRT-PCR (Figur 4f) og western blot-analyse (Supplerende figur 2e). Da begge celletyper stammer fra et brystkanalkarcinom, tyder den forbedrede mesenkymale egenskab ved CD24+CD29+-cellerne på, at de har gennemgået en overgang fra epithel til mesenkym, hvilket giver et molekylært grundlag for deres øgede bevægelighed in vitro og kræftmetastase in vivo.
Sammenfattende har vi undersøgt det metastatiske potentiale af CSC’er beriget i CD24+CD29+ cellepopulationen isoleret fra en Brca1-mutant musemodel af brystkræft, og vores data indikerede, at CSC’er viste meget højere migrationsevne end ikke-CSC’er i vævskultur og forbedret metastatisk potentiale i allograft-nude mus. Vi påviste, at CD24+CD29+-celler bevarede evnen til at differentiere og genskabe heterogenitet i de metastaserende tumorer, mens CD24-CD29-celler ikke kunne det. Et meget spændende resultat er imidlertid, at CD29 og CD49f, som er blevet anvendt som markører til at isolere CSC’er fra mammatumorer i musemyrer,39, 42, 43 har en overlappende, men kritisk rolle i formidlingen af CSC’ers migration. I mus udgør β1-integrin det fremherskende integrin, der udtrykkes i brystepitelceller, og har en kritisk rolle i kræftprogression.44 I humane brystkræftformer udtrykkes α6-integrin i høje niveauer og tjener som en uafhængig prognostisk faktor, som det fremgår af en undersøgelse med en tidsafhængig effekt begrænset til de første 2 års opfølgning.45 Alligevel er den potentielle rolle af begge gener i CSC’er i brystkræft fortsat uklar. Vores data viste, at nedsat funktion af β1-integritin eller α6-integritin alene resulterer i en meget mildere effekt end at slå begge gener ned samtidig. Dette resultat er i overensstemmelse med det faktum, at begge integriner kan parre sig med hinanden for at danne heterodimere for ekstracellulære matrixkomponenter som fibronectin og laminin.41, 46, 47, 48, 49 Det er blevet foreslået, at et malignt socialt netværk medierer celle-celleadhæsion og kommunikation mellem CSC’er og deres mikromiljø.20, 21 Vores undersøgelse implicerer en vigtig rolle for β1/α6-integritiner i medieringen af dette netværk. Specifikt kan β1/α6-integritiner formidle interaktion mellem CSC’er og stromaer, der videresender signaler fra den ekstracellulære matrix til det cellulære maskineri og fører til øget aktivitet af CSC’er med hensyn til levedygtighed, differentiering og metastase.