Abstract
Disaccharidaser (DS) er enzymer, der er indlejret i tyndtarmens mikrovilløse membran i tyndtarmens enterocytter. Ved ubehandlet cøliaki (CD) ses et generelt fald i DS-aktiviteterne. I dette manuskript gennemgås forskellige aspekter af DS-aktiviteterne i forbindelse med CD: deres anvendelighed i forbindelse med diagnosticering og deres anvendelse i forbindelse med in vitro-toksicitetstestning. Sidstnævnte er aldrig blevet etableret inden for CD-forskningen. Med de seneste fremskridt inden for små tarmorganoidteknikker kan DS imidlertid anvendes som en biomarkør til in vitro-undersøgelser. Dette omfatter etablering af selvfornyende epithelceller, der er opdrættet fra væv, og som udtrykker differentieringsmarkører, herunder enzymer ved børstensgrænsen. Bestemmelse af duodenale DS-aktiviteter kan give yderligere oplysninger i forbindelse med den diagnostiske behandling af CD: (i) kvantificere sværhedsgraden af de observerede histologiske læsioner, (ii) give prædiktive værdier for graden af mukosal villøs atrofi og (iii) hjælpe med at diagnosticere CD, hvor der ses mindre histologiske ændringer. DS kan også give yderligere oplysninger til vurdering af responset på en glutenfri diæt, da der sker en markant stigning i deres aktiviteter fire uger efter påbegyndelse af diæten. Forskellige endogene og exogene faktorer, der påvirker DS, kan også være relevante, når man overvejer at undersøge DS’ rolle i forbindelse med andre tilstande, herunder ikke-cøliakisk glutenfølsomhed og DS-mangler.
1. Indledning
I nogle personer er gastrointestinale symptomer, herunder diarré, relateret til indtagelse af visse former for kulhydrater i kosten. Symptomerne kan tilskrives en eller flere enzymmangler i tyndtarmsslimhinden, der hydrolyserer disaccharider . Disse omfatter laktasemangel (medfødt og hos voksne), sucrase-isomaltasemangel, maltase-glucoamylasemangel og trehalasemangel. Med undtagelse af laktasemangel hos voksne er de andre ovennævnte mangler relativt sjældne . Andre tilstande, herunder cøliaki (CD), som resulterer i skader i tyndtarmen, kan forårsage en reduktion af disaccharidaseaktiviteterne (DS). Det er også blevet foreslået, at sekundære DS-mangler muligvis kan være årsag til symptomer hos patienter med CD, som har intakte villi .
Lactose, som fordøjes af enzymet lactase ved børstensgrænsen, er et af de dårligt absorberede kortkædede kulhydrater, der ofte kaldes FODMAP’er (fermenterbare, oligo-, di-, monosaccharider og polyoler). Det er blevet vist, at et reduceret indtag af FODMAP’er forbedrer gastrointestinale symptomer hos patienter med ikke-cøliakisk glutenfølsomhed (NCGS) . Det er blevet påvist, at andre komponenter end gluten i hvede kan have betydning for NCGS, nemlig amylase-trypsinininhibitor . Manglen på biomarkører for denne tilstand kan få forskerne til at undersøge den potentielle rolle, som enzymer ved børstensgrænsen, såsom laktase, kan spille.
I ubehandlet CD ses et generelt fald i DS-aktiviteterne . Før fremkomsten af serologisk testning var tyndtarmens DS-aktiviteter vigtige laboratorieparametre til at støtte diagnosen af CD. Bestemmelse af individuel DS-aktivitet har også været afgørende for differentialdiagnosen af medfødte stofskiftesygdomme. Måling af deres aktivitet gør det lettere at skelne mellem primær og sekundær DS-mangel . Primære typer af DS-mangler udgør “medfødte fejl i stofskiftet” af et bestemt enzym . Et eksempel herpå er medfødt laktasemangel, hvor der er normale niveauer af maltase og sucrase med nedsat laktaseindhold. CD er en sekundær DS-mangel, da alle DS er reduceret på grund af gluteninduceret skade på tyndtarmsslimhinden .
Der sker en markant stigning i DS-aktiviteterne fire uger efter påbegyndelse af en glutenfri diæt (GFD), men deres aktiviteter reduceres igen, hvis cøliakipatienter vender tilbage til en normal diæt . Hos patienter med behandlet CD medfører intraduodenal instillation af gluten karakteristiske histologiske forandringer og en tilhørende markant reduktion af disaccharidaseaktiviteterne inden for 3,5 timer . Reduktionen af DS-aktiviteterne korrelerer med den histologiske grad af biopsien, således at DS kan anvendes som en biomarkør for CD.
Dette manuskript gennemgår forskellige aspekter af DS-aktiviteter i CD: deres anvendelighed i diagnosen og deres anvendelse til in vitro-toksicitetstestning. Desuden beskriver vi de seneste fremskridt inden for små tarmorganoidteknikker, herunder kokultur med immunceller, som giver en spændende mulighed for at udvikle state-of-the-art in vitro-modeller til CD-forskning. I denne model kunne enzymer ved børsteranden anvendes som markører for CD-patogenese.
2. Diagnostiske aspekter af småtarmens disaccharidaseaktiviteter ved CD
Guldstandarden til diagnosticering af CD og til at følge virkningen af GFD er undersøgelse af duodenalbiopsier i forbindelse med CD-serologi, herunder vævstransglutaminase. Måling af DS-aktiviteter giver yderligere oplysninger på diagnosetidspunktet og under opfølgningen for at vurdere responset på en GFD . Det er desuden blevet vist, at bestemmelse af DS-aktiviteter kan være en hjælp til diagnosticering af CD, hvor der ses mildere histologiske forandringer, herunder Marsh I- og II-anormaliteter i tyndtarmsbiopsier .
2.1. Positive og negative prædiktive værdier af mucosal Villous Atrophy
Måling af brush border-enzymaktiviteter giver et yderligere objektivt redskab til at vurdere sværhedsgraden af de histologiske abnormiteter hos ubehandlede cøliakipatienter . Duodenale DS-aktiviteter er gode prædiktorer for graden af mukosal villøs atrofi ved CD. Positive prædiktive værdier for moderat eller svær villusatrofi er som følger:(i)90 % for maltase (maltase U/g protein)(ii)86 % for sucrase (<40 U/g protein)(iii)71 % for laktase (<20 U/g protein).
Faldne maltase- og sucraseaktiviteter har således en høj positiv prædiktiv værdi for graden af mukosal villusatrofi. Prædiktive værdier for laktaseaktivitet er lavere, sandsynligvis på grund af tilstedeværelsen af primær laktasemangel hos cøliaki-patienter. Ingen patienter med DS-aktiviteter i normalområdet udviste alvorlig villusatrofi .
2,2. Slimhindehelbredelse ved CD med en glutenfri diæt (GFD)
Det er veletableret, at enzymaktiviteterne ved børstensgrænsen er reducerede hos ubehandlede cøliakipatienter. Aktiviteterne genoprettes imidlertid i løbet af remission, navnlig fire uger efter påbegyndelse af en GFD . Det er vigtigt at bemærke de forskellige reaktioner mellem DS og en GFD; der sker en markant stigning i alfa-glucosidaseaktiviteterne, mens laktaseaktiviteten forbliver lav hos mange patienter . Peña et al. viste, at laktaseaktiviteten reagerer forskelligt på en GFD, og at den undertiden viser fuld genopretning i løbet af få måneder, men at den undertiden forbliver lav i årevis . Patientens alder har stor betydning for hastigheden af genoprettelsen af laktaseaktiviteten. Patienter på under 30 år viser normalt fuld genopretning i løbet af få måneder, mens de fleste ældre patienter viser ringe eller ingen genopretning i løbet af dette tidsrum . Der er i andre undersøgelser påvist vedvarende lav laktaseaktivitet på trods af god histologisk bedring for nogle patienter, især voksne .
Med undtagelse af laktase kan måling af DS give et kvantitativt indeks for forbedring af tyndtarmsslimhinden ; deres stigning korrelerer godt med genoprettelsen af slimhinden baseret på tyndtarmens biopsihistologi . Ud over den histologiske og serologiske opfølgning giver måling af DS-aktiviteterne et yderligere potentielt redskab til at vurdere behandlingen af CD med en GFD . Sucraseaktivitet er den bedste indikator for slimhindernes respons på en GFD. Det er imidlertid interessant at bemærke, at selv efter to års behandling af CD med en GFD stiger sucraseaktiviteten i det distale duodenum ikke til kontrolniveauet, selv om der tidligere observeres kliniske virkninger . Generelt er enzymaktiviteterne i tyndtarmsslimhinden hos patienter med CD i remission lavere end i kontrolgrupper, der er matchet med hensyn til alder, køn og biopsisted . Cøliaki-patienter på GFD har imidlertid signifikant øgede niveauer af maltase og sucrase, men en begrænset stigning i laktaseaktiviteten sammenlignet med en ubehandlet gruppe . Det er værd at nævne, at en streng GFD er den foretrukne behandling, ikke kun for CD, men også for CD-associerede sekundære DS-mangler .
2.3. Diagnose af CD med Marsh I/II-score på tyndtarmsslimhindebiopsier (subklinisk CD)
I tyndtarmsslimhindebiopsier med en Marsh-score på I og/eller II er der ingen villøs atrofi . Villøs atrofi udgør kun slutstadiet i sygdommens kliniske forløb; CD udvikler sig gradvist fra tyndtarmsslimhindebetændelse til krypthyperplasi og til sidst til villøs atrofi .
Mindre biopsiforandringer, der er begrænset til lymfocytinfiltration med eller uden krypthyperplasi, kan kræve yderligere data for at øge sikkerheden for en diagnose af CD, da disse histologiske forandringer ikke er eksklusive for CD . Diagnosen CD kan forbedres ved genotypebestemmelse (HLA-DQ2 eller HLA-DQ8); serologiske markører og immunhistokemisk farvning af de γδ+ve intraepitheliale lymfocytter, der findes hos patienter med CD, kan også anvendes til at bekræfte diagnosen .
Skader på mikrovilli kan være en af de tidligste gluteninducerede forandringer ved CD . Derfor kan biokemiske ændringer gå forud for histologiske abnormiteter i duodenalbiopsien observeret ved lysmikroskopi . Murray et al. rapporterede, at CD blev diagnosticeret ved gentagen biopsi hos 4 ud af 37 (10,8 %) patienter, som ikke havde nogen villøs atrofi i deres første biopsi et par år tidligere . Disse fire patienter havde imidlertid nedsat DS-aktivitet og mindre histologiske ændringer (Marsh I eller II) i deres første biopsi. Reducerede DS-aktiviteter uden villusatrofi kan derfor repræsentere tidlig CD .
Mones et al. observerede en markant reduktion af DS-aktiviteter hos pædiatriske patienter med CD, hvis histologiske ændringer i deres tyndtarmsbiopsier scorede som Marsh I eller II (med intakte villi). En positiv test til forudsigelse af CD blev defineret ved følgende grænseværdier for individuel DS-aktivitet: laktase ≤15 enheder/g protein; sucrase ≤25 enheder/g protein; maltase ≤100 enheder/g protein; og palatinase ≤5 enheder/g protein. Den diagnostiske følsomhed varierede fra 74 % til 85 %, idet den højeste følsomhed blev observeret for laktase. Den diagnostiske specificitet varierede fra 57 % til 91 %, med den højeste specificitet for sucrase. Den positive prædiktive værdi af en DS-mangel til at forudsige CD varierede fra 70 % til 91 %. Den negative prædiktive værdi (et normalt DS-niveau) varierede fra 72 % til 76 % for at forudsige, at en biopsi ikke anses for at være CD . DS-mangel fundet i duodenalbiopsier kan derfor være en hjælp til diagnosticering af CD i biopsier med intakte villi . Et lignende resultat blev rapporteret i en anden undersøgelse, hvor evaluering af DS-aktiviteter gav beviser til støtte for diagnosen CD hos nogle patienter.
3. Forskningsaspekter af disaccharidaseaktiviteter ved cøliaki
DS-aktiviteter i biopsier af tyndtarmens slimhinde kan bestemmes ved Dahlqvist-metoden. Vævet inkuberes med det relevante disaccharid, og den frigjorte glukose bestemmes ved kolorimetrisk analyse med TRIS-glukoseoxidasereagens. Enheder af DS-aktivitet udtrykkes som mikromol hydrolyseret disaccharid pr. minut pr. gram slimhinde (vådvægt) .
3.1. Faktorer, der påvirker enzymaktiviteterne
DS er nedsat ved aktiv cøliaki. De kan være nedsat ved andre tilstande, herunder inflammatorisk tarmsygdom, fødevareallergi, dyspepsi, protein-energimalabsorption, immundefekter og infektionssygdomme (såsom giardiasis, virusinfektioner og bakteriel overvækst i tyndtarmen) . Nedgangen i DS-aktiviteterne kan normalt vendes ved en vellykket behandling af den underliggende sygdom. Interessant nok kan DS også være unormalt forhøjet hos diabetespatienter . En reduktion af individuelle DS-mangler ses ved primære DS-mangler, som omfatter medfødt laktoseintolerance, sucrase-isomaltase-mangel, maltase-glucoamylase-mangel og trehalase-mangel .
I raske personer kan DS-aktiviteterne vise et bredt spektrum af absolutte værdier . Der er flere endogene og eksogene faktorer, der påvirker deres aktiviteter.
3.1.1. Endogene faktorer
DS-aktiviteter varierer langs tarmens længdeakse (duodenum-jejunum-ileum) . Laktase har maksimale aktiviteter ved 50-200 cm fra ligament of Treitz og er næsten fraværende i distale ileum. Sucrase-aktiviteterne er konstante langs tyndtarmen. Maltase er dobbelt så rigelig i det distale ileum sammenlignet med den i det proximale jejunum .
Ethnicitet påvirker DS-værdierne som vist ved sammenligning af afrikanske og finske børn med normal villusarkitektur; de førstnævnte havde lavere aktiviteter af duodenal laktase, sucrase og maltase. Omkring en tredjedel af de finske børn udviser laktaseaktivitet under det etablerede referenceområde på 20 U/g protein, i modsætning til to tredjedele af de afrikanske børn .
Køn påvirker ikke nogen af DS-aktiviteterne . Alderen har kun en signifikant effekt på laktaseaktiviteten; den falder med alderen. Hos nogle sorte børn kan laktasemangel udvikle sig efter 3-årsalderen og er ikke forbundet med slimhindesygdom .
Den cirkadiske rytme påvirker DS-aktiviteterne . Desuden korrelerer svingninger af DS-aktiviteter med rytmen for fødeindtagelse .
Patchy slimhindeforandringer, der kan forekomme ved CD, påvirker de absolutte værdier af DS-aktiviteter, der findes i biopsier. Jonsson et al. påviste, at der var ca. 30 % variationskoefficient i DS-aktivitet af prøver taget fra to steder i duodenum.
3.1.2. Exogene faktorer
Sucrosefodring er kendt for at øge aktiviteten af sucrase-isomaltase. Stigningen er et resultat af de novo-syntese af enzymet, som når sit højdepunkt (2,6-dobbelt stigning) 12 timer efter påbegyndelse af en saccharoseholdig diæt . Nedbrydningen af enzymet er uafhængig af kosten.
Fasten hæmmer tarmepitelcellefornyelsen. Det forårsager en reduktion af tyndtarmens masse, villostørrelse og krypt enterocytmitoseindeks. Kulhydratmangel inducerer et fald i intestinal sucrase, som genoprettes ved kulhydratfodring .
Niveauerne af DS varierer også afhængigt af biopsistedet . Dette gælder ikke kun for den langsgående akse (duodenum-jejunum-ileum) i tyndtarmen, men også for den krypto-villøse akse. Da DS er indlejret i mikrovilli af villøse enterocytter, afhænger deres aktivitet af antallet af villøse enterocytter i biopsien, således at de mere overfladiske biopsier med et højere epithelindhold kan have et højere indhold af DS.
3.2. Ex vivo- og in vitro-metoder til undersøgelse af glutentoksicitet ved cøliaki
Der findes ingen dyremodel, der gengiver alle træk ved cøliaki . In vivo-forsøg er den gyldne standard for vurdering af toksicitet ved cøliaki . Det er imidlertid veletableret, at in vivo-administration af gluten kan forårsage systemisk skade hos patienten. Derfor anvendes der normalt in vitro-metoder, før der foretages in vivo-undersøgelser, når fødevarer skal vurderes for manglende CD-toksicitet.
Den mest pålidelige in vitro-metode er biopsikultur af tyndtarmens slimhinde, ofte kaldet duodenalbiopsiorgankultur (OC). Metoden blev oprindeligt beskrevet af Browning og Trier . Der er et betydeligt behov for prækliniske in vitro-undersøgelser, så princippet i Browning og Triers metode er blevet videreudviklet og anvendt til testning af probiotika, som kræver en apikal stimulering af tarmslimhindeeksploranter . OC muliggør forskellige andre anvendelser, f.eks. biokemiske undersøgelser af syntese og forarbejdning af DS , dimerisk samling af DS , og undersøgelse af insulins virkninger på forhøjede DS-aktiviteter hos diabetikere .
Browning og Triers oprindelige metode er blevet ændret, således at systemet påviser skadelige virkninger af gluten ved at tilsætte det til kulturmediet og evaluere efterfølgende histologiske, morfologiske og immunologiske abnormiteter. Den modificerede Browning og Triers teknik anvendes stadig i vid udstrækning i undersøgelser, der undersøger CD-patogenese og ved testning for cøliaki-toksicitet . OC-systemet har også vist sig at være nyttigt til at støtte diagnosen af CD, hovedsagelig i tilfælde uden villøs atrofi eller hos seronegative patienter .
3.2.1. Tidligt arbejde med småtarmens organkultur og undersøgelse af børstegrænseenzymer ved CD
Enterocytskader er kendetegnende for cøliaki . Den toksiske virkning af gluten på tyndtarmsslimhinden blev påvist biokemisk ved at måle aktiviteten af enzymet alkalisk fosfatase (AP) i OC. Aktiviteten af AP fra biopsier fra ubehandlede CD-patienter steg, når vævet blev inkuberet i glutenfrit medium. Denne stigning blev hæmmet af tilstedeværelsen af glutenpeptider i kulturmediet, hvilket viser de toksiske virkninger af gluten.
Katz og Falchuk foreslog efterfølgende at anvende den tyndtarmede OC-teknik som en prædiktiv test til den endelige diagnose af glutenfølsomhed. Toogtyve af 26 patienter, der blev diagnosticeret med CD, havde vist glutenfølsomhed in vitro på deres første biopsier. En stigning i AP-aktiviteten i tarmvæv fra disse 22 patienter blev hæmmet af tilstedeværelsen af glutenpeptider i mediet. Den falsk-negative rate for fastlæggelse af diagnosen CD var derfor 15 % (4 ud af 26). I deres undersøgelse var der også 14 patienter med unormal slimhinde, som viste sig ikke at have CD. Tretten af dem viste ikke glutenfølsomhed in vitro (en falsk-positiv rate på 7 %). Alle patienter med normale biopsier blev klassificeret korrekt. Disse spændende resultater tydede på, at dyrkning af tyndtarmens organkultur kunne anvendes til prospektiv diagnose af CD. I en anden undersøgelse påviste Falchuk et al. igen glutenfølsomhed in vitro hos patienter med aktiv CD. De antydede endvidere, at der var forskelle alt efter forsøgspersonernes histokompatibilitetstype.
Andre forskere foretog lignende OC-undersøgelser, hvor de målte AP-aktivitet og et andet brush border-enzym α-glucosidase. Howdle et al. og Hauri et al. kunne ikke reproducere in vitro-effekter af gluten på duodenalbiopsier fra ubehandlede CD-patienter og heller ikke ved vurdering af AP- eller α-glucosidaseaktivitet.
Mitchell et al. viste, at der er et progressivt tab af proteiner fra vævet under OC. Samtidig falder niveauerne af brush border-enzymer og ophobes i mediet. De foreslog derfor at udtrykke enzymaktiviteter som mU/ml kulturmedium i modsætning til U/g protein på grund af proteintab under organkultur og genvundne enzymaktiviteter i mediet .
Flere forfattere undersøgte proteinerne, DNA-indholdet og børstensgrænsenzymerne i tyndtarmsbiopsi OC. De fleste har observeret et fald i alle disse parametre i dyrkede biopsier med undtagelse af AP-aktiviteten, som steg i praktisk talt alle tilfælde . DS går sandsynligvis lettere tabt i mediet under dyrkning end AP .
3.2.2.2. Cellemodeller og enzymaktiviteter
Ud over CD-patienters tyndtarmsslimhinde OC har forskerne anvendt forskellige cellelinjer til in vitro-undersøgelser af CD. Etablerede cellemodeller er baseret på glutenfølsomme T-cellelinjer og kloner isoleret fra personer med CD, som stadig anvendes i vid udstrækning til screening for CD-toksicitet . Der er også foretaget omfattende forskning ved hjælp af epithelcellelinjer af kræftoprindelse, som er relativt lette at dyrke. Det er imidlertid ikke fastslået, i hvilket omfang malign transformation påvirker deres eventuelle afhængighed af påvirkninger fra det omgivende mikromiljø. Det er blevet påvist, at i modsætning til normale epithelceller kræver tarmkræftcellelinjer ikke tilsætning af vækstfaktorer for at kunne ekspandere in vitro . Desuden udtrykker Caco2-celler betydeligt lavere mængder af enzymer ved børstensgrænsen i forhold til normale enterocytter.
Hvor Sato et al. offentliggjorde deres banebrydende opdagelse om tarmorganoider, var enterocytter notorisk vanskelige at dyrke in vitro. Gennem årtier har mange undersøgelser af normalt tarmepitel rapporteret om vanskeligheder med at opretholde dyrkning af disse celler i mere end et par dage ( og referencer heri) på trods af anvendelse af forskellige isolationsprotokoller og efterfølgende dyrkningsbetingelser. I mange år troede man, at langtidskulturer fra primært humant væv ikke kunne etableres, medmindre cellerne var genetisk transformerede. Det blev også opdaget, at forstyrrelse af interaktionerne mellem normale epithelceller og den omgivende ekstracellulære matrix inducerer apoptose af cellerne.
Quaroni et al. har imidlertid formået at etablere en langtidskultur af epithelceller fra tyndtarmen hos rotter. Deres oprindelige fremgangsmåde til isolering var den, der blev anvendt i OC, men de dyrkede epitelceller havde træk af udifferentierede kryptceller fra tyndtarmen. Dårlige differentieringsniveauer for dyrkede enterocytter in vitro blev rapporteret i andre undersøgelser, hvor der blev anvendt biopsier af tarmene fra mennesker, mus, rotter og kvæg, hvilket stemmer overens med vores observationer (upublicerede data). Rusu et al. undersøgte differentiering in vitro ved at vurdere specifikke aktiviteter af maltase og AP i prøver fra kvæg af (a) frisk skrabede epithelier, (b) organoid-suspensioner, der anvendes til at sætte kulturer (ikke at forveksle med Satos organoider), og (c) tarmcellekulturer, som omfatter primærkulturceller og celler, der er dyrket efter første og anden passage. Organoid-suspensioner udviste en 50% reduktion i forhold til det friske epithelpræparat. Maltaseaktiviteten, der anvendes som en differentieringsmarkør, faldt tydeligt i primærkulturer og med efterfølgende kulturpassager mod et stabilt lavt niveau. Lignende resultater blev opnået ved målingerne af tarmens AP-aktivitet. Disse resultater afspejlede et tab af celledifferentiering in vitro .
Epitelet er kun en (i) af fire komponenter i en integreret funktionel enhed, som også består af (ii) ekstracellulær matrix, (iii) mesenkymafledte celler og (iv) luminalfaktorer. Isolering af enterocytter fra deres mesenkymale miljø resulterer i tab af differentiering . Ikke-transformerede humane føtale tyndtarmceller fra mennesker, der er dyrket på plastik, har karakteristika som udifferentierede kryptenterocytter . Den sekventielle tilsætning af bindevævs- og luminalmolekyler til ikke-maligne humane føtale enterocytter in vitro inducerede et spektrum af ændringer i den epitheliale celletype i retning af fuld differentiering . En rottetyndtarmscellelinje differentierede også, som vurderet ved en betydelig stigning i sucraseaktivitet, når den blev dyrket i tilstedeværelse af mesenchym . Normal udvikling og differentiering af tyndtarmens epitel afhænger derfor af interaktionen med mesenchym og andre bestanddele .
Langtidskulturer af normale primære humane epithelceller isoleret fra tyndtarmen er nu veletableret. Menneskelige epitheliale “minitarme” kan dyrkes fra tarmkrypter og enkelte stamceller . Det er muligt at opformere de organoidkulturer in vitro, der stammer fra både musetarm og mennesketarm . Disse organoider kan dyrkes på ubestemt tid og viser alle kendetegn ved tyndtarmens epitel med hensyn til arkitektur, celletyper og selvfornyelsesegenskaber .
Sato et al. definerede de betingelser, der fremmede organoidproliferation og differentiering. Stamceller såvel som organoider skulle indlejres i Matrigel, som er en laminin- og kollagenrig matrix, der efterligner den basale lamina. Kultur af menneskelig tyndtarm er mere kompleks end dyrkning af musetarm. Ud over R-spondin, Noggin og epidermal vækstfaktor kræver de humant optimerede kulturbetingelser flere kosttilskud (Wnt3A, gastrin, nikotinamid, Alk-inhibitor og p38-inhibitor). Differentiering af dyrkede humane små epithelorganoider til forskellige celletyper i tarmen kræver, at visse kosttilskud trækkes tilbage (Wnt3, nikotinamid og p38-hæmmer). En differentieringsmarkør for modne enterocytter blev visualiseret ved hjælp af AP-farvning af børstensgrænsen . I en anden undersøgelse udelod Middendorp et al. også visse kulturtilskud for at opnå tyndtarmsdifferentiering af menneskelige organoider. Det er dog interessant, at visualisering af modne enterocytter ved hjælp af sucrase-isomaltasefarvning fungerede godt for ileale organoider, men ikke for duodenale. Ekspression af laktase blev induceret i både ileale og duodenale organoider ved hjælp af det såkaldte differentieringsmedium.
3.2.3. Nylige fremskridt inden for tarmorganoidmetoder
Organoidteknologien kan muligvis finde anvendelse i regenerativ terapi for visse tarmsygdomme gennem ex vivo-ekspansion af tarmepithelier og transplantation . Denne metode muliggør også in vitro-opformering af syge gastrointestinale væv, hvilket kan belyse sygdomspatogenese og udvikling af terapier . Tarmorganoider er allerede blevet anvendt til at modellere monogene sygdomme, der påvirker epitelet, inflammatoriske tarmsygdomme (hvor man undersøger celledød, slimhindeintegritet og virkningerne af inflammatoriske cytokiner) og interaktioner mellem tarmvæv og mikrober samt kræft ( og referencer heri). CD-forskningen halter bagefter disse fremskridt. Det er veletableret, at der er mange celletyper involveret i CD-patogenese, og som sådan mangler organoider mange af de celletyper, der er til stede i et in vivo-system. Kompleksiteten kan dog øges gennem samdyrkning med immunceller . Nozaki et al. beskrev kokultur af murine organoider og intraepitheliale lymfocytter (IEL’er), hvor både αβT- og γδT-celler prolifererede med succes og var lige så mobile som IEL’er, der opholder sig i in vivo-miljøer. Kokulturer af organoider er også blevet beskrevet for det enteriske nervesystem og myofibroblaster .
På grund af fremskridt inden for serologisk og genetisk testning i diagnostisk udredning for cøliaki er duodenalbiopsi måske ikke længere nødvendig for mange patienter. Derfor vil biopsi-materialet blive knapt. Der kan imidlertid også genereres tarmorganoider fra embryonale stamceller eller inducerede pluripotente stamceller ( og henvisninger hertil), som, selv om det tager længere tid at etablere dem og er teknisk mere krævende og dyrere end biopsiafledte organoider, i høj grad kan øge antallet af resulterende organoider og gøre det muligt i stedet at anvende det kliniske materiale til opdræt af immunceller.
3.2.4. Relevans af tarmorganoidernes arbejde og børstegrænseenzymer for udviklingen af avancerede in vitro-metoder til CD-forskning
Det er veletableret, at medfødte og adaptive immunreaktioner udløses i CD-patogenese ; den nøjagtige rækkefølge af disse patologiske hændelser er imidlertid ikke blevet belyst til dato. Organoid-teknologien gør det imidlertid muligt at tilføje cellerne sekventielt til kokulturen, hvorved det bliver muligt at studere det medfødte immunrespons ved at rekonstituere organoider og IEL’er separat fra virkningerne af et adaptivt immunrespons. Til gengæld kan gluten-specifikke T-celler, som også kan dyrkes in vitro, derefter inkluderes i denne in vitro-model af CD for at gøre det lettere at undersøge de fulde toksiske virkninger af gluten på tarmepitelet.
Organoid-teknologien gør det også muligt at belyse enterocytternes rolle i behandlingen af gliadinpeptider ved CD. Enterocytter har kapacitet til at fungere som antigenpræsenterende celler, hvorved T-celle-stimulering formidles af deres HLA-DR-molekyler . Endvidere indeholder gliadin peptider, der kan udløse et medfødt immunforsvar . Det er interessant, at det glutenpeptid, der udløser medfødt immunitet ved cøliaki, behandles anderledes i enterocytten sammenlignet med de peptider, der udløser et adaptivt immunrespons, hvor peptiderne når HLA-DR-positive sene endosomer og præsenteres for lamina propria T-celler . Da skader på enterocytternes børstegrænse er en af de tidligste forandringer ved CD, kan DS anvendes til at undersøge de toksiske virkninger af gluten ved CD. Det er vigtigt at bemærke, at enzymer i børsteranden er en integreret del af modne villøse enterocytter og er kvantitativt forbundet med deres differentiering . DS-aktiviteten kan imidlertid ikke nødvendigvis korrelere med enterocytternes levedygtighed, da enzymaktiviteterne i børstensgrænsen er blevet påvist i ikke-levedygtige epitelceller . Derfor kan immunfarvningen eller mere præcist manglen på immunfarvning af børstegrænsenzymer som følge af ødelæggelse af mikrovilli snarere end deres aktiviteter anvendes som en markør for CD-patogenese.
Organoidteknologi har et betydeligt potentiale for sygdomsmodellering og dermed for at belyse sekvensen af patogene hændelser i CD, hvor børstegrænsenzymer kan udnyttes. Nye in vitro-modeller baseret på de seneste fremskridt inden for stamcelleforskning kan lette udviklingen af nye terapeutiske strategier for CD.
4. Konklusioner
Den lille tarmslimhindes struktur og de involverede fysiologiske processer er meget komplekse. CD øger denne kompleksitet og påvirker mange komponenter i tarmen, herunder DS. På trods af at DS-aktiviteter har spillet en vigtig rolle i forbindelse med diagnosticering af CD, er anvendelsen af DS-aktiviteter i in vitro-forskningen af CD endnu ikke blevet fastlagt. De seneste fremskridt inden for ex vivo-vækst af epitheliale “minidutter” udgør en spændende ny platform, som er blevet tilgængelig. Den gør det muligt at undersøge normalt eller sygt epithel med vævsteknologi. Epitelceller vokser og differentierer under definerede betingelser, som omfatter tilstedeværelsen af en ekstracellulær matrix og vækstfaktorer. En selvfornyende population af epitelceller udtrykker enzymer ved børstensgrænsen, som kan anvendes i in vitro-undersøgelser af CD, når der sker en rekonstituering af andre immunceller i modellen.
Interessekonflikter
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.
Anerkendelser
Forfatterne vil gerne takke Dr. H. Julia Ellis for nyttige diskussioner og gennemgang af manuskriptet. Tanja Šuligoj vil gerne takke Clinical Research Trust for støtten. Borut Božič vil gerne takke for den delvise finansielle støtte fra Slovenian Science Foundation, Grant no. SZF-BBozic01/2007.