Den klonogene test er blevet anvendt i adskillige undersøgelser til at kvantificere klonogen vækst og dens ophævelse af cytotoksiske stimuli, herunder stråling, kemoterapeutiske lægemidler og/eller molekylært målrettede stoffer, in vitro. Den nuværende standardprocedure til bestemmelse af overlevelsesfraktioner er baseret på den antagelse, at klonogen vækst i behandlede cellekulturer kan normaliseres i forhold til de ubehandlede kontroller ved at dividere med en cellelinjespecifik, konstant PE.
Her viser vi imidlertid, at dette ikke er universelt anvendeligt. Derimod viser vores data klart, at sammenhængen mellem antallet af celler, der er udsået i en kulturskål, og antallet af opnåede kolonier langt fra altid er lineær. For cellelinjer med kooperativ adfærd gav den PE-baserede analyse af klonogene overlevelsesdata resultater med store til enorme assay-intrinsiske fejl. Selv om der kun blev anvendt kulturskåle med et rimeligt antal kolonier (C = 5 til 100) til analysen, varierede de klonogene overlevelsesfraktioner ved en given dosis med langt mere end en størrelsesorden for cellelinjer med høj grad af cellulært samarbejde. Det skal bemærkes, at stort set enhver overlevelseskurve (stejl eller flad, moderat eller stærkt buet, lineær, kvadratisk eller uregelmæssig) kan udledes af dette interval af resultater beregnet ud fra det givne datasæt – en observation, der kan være af særlig betydning for strålingsbiologer.
Sammen viser vores data, at konventionel PE-baseret analyse af klonogene overlevelsesdata fungerer uhensigtsmæssigt, så snart der opstår cellulært samarbejde under en eller flere betingelser inden for et eksperiment, og de ekstraherede overlevelsesresultater vil variere inden for et utilfredsstillende stort interval. Specifikt vil resultaterne være stærkt skævvredet, hvis kun en eller få lignende celletætheder er udplottet. Denne fremgangsmåde giver anledning til forsøgsintrinsiske fejl, som er en direkte konsekvens af de valgte celletætheder og derfor ikke lader sig analysere ved hjælp af statistiske fejlanalyser. For kooperativt voksende cellelinjer kan vores observationer delvis forklare de rapporterede uoverensstemmelser mellem forsøg, mellem forskere og mellem laboratorier i forbindelse med behandlingsresponsdata . En metaanalyse af data fra A549-koloniopbygningsassayet understøtter yderligere denne hypotese: Inden for et panel af 156 forskellige undersøgelser rapporterede Nuryadi et al. om SF4-værdier for denne specifikke cellelinje, der varierede fra 5 til 90% med et SF4-interkvartilområde på mere end 25% . Selv om forskellige andre parametre helt sikkert kan påvirke behandlingsresponsdata, konkluderer vi ud fra vores data, at cellulært samarbejde er en vigtig faktor, der forklarer variabiliteten mellem studierne. Da selv små forskelle i klonogene overlevelsesfraktioner kan tilskynde forskere til at postulere og undersøge nye videnskabelige hypoteser, som i sidste ende kan være baseret på falsk præcision, har vi udviklet en ny analysemetode, som er mindre modtagelig over for virkningen af celletæthed – især, men ikke kun for kooperativt voksende cellelinjer. Denne metode tager højde for ikke-lineære forhold mellem antallet af udsåede celler og antallet af kolonier, der opnås ved at score kulturskåle med et bredt spektrum af udsåede celletal for alle behandlingsbetingelser.
Matematisk set anvender vores fremgangsmåde effektregression og interpolation af matchede antal kolonier ved forskellige bestrålingsdoser. Anvendt på det samme datasæt, som blev brugt til PE-baserede beregninger, gav det klart mere stabile, celletæthedsuafhængige resultater. Opmærksomme læsere har måske bemærket, at de beregninger af overlevelsesfraktionerne, der er udført i henhold til den metode, der er præsenteret her, udelukkende er baseret på koefficienten a og eksponenten b, som er udtrukket ved hjælp af effektregression. Selv om dette naturligvis kompenserer for virkningerne af cellesamarbejde, er det forbundet med en anden fejlkvalitet, som skyldes regressionens unøjagtighed, og som ikke kvantitativt kan sammenlignes med den tilsvarende fejlkvalitet i PE-baserede overlevelsesfraktionsberegninger. Denne fejl bør derfor minimeres ved at sikre en omhyggelig eksperimentel planlægning med et tilstrækkeligt antal uafhængige gentagelser. Desuden bør overlevelsesfraktionsberegninger kun udføres med effektregressionsresultater af korrekt ydeevne som angivet ved regressionskoefficienten R.
Vores matematiske tilgang erstatter grundlæggende PE-baserede klonogene overlevelsesberegninger med spørgsmålet:
Hvor mange gange flere celler skal udsås i en behandlet kulturskål for at give det samme antal kolonier som i en kontrolskål?
Eksponenten b er af særlig betydning i denne henseende. Den angiver, om korrelationen mellem antallet af udsåede celler og antallet af talte kolonier er lineær (b ≈ 1) eller ej. Høje b-værdier som dem, der er opnået for BT20- og SKLU1-celler, viser, at cellevækst in vitro bremses (eller helt ophæves), hvis mængden af kulturmedium pr. celle øges – enten ved brug af store analysemængder eller reduktion af antallet af udsåede celler. Det skal understreges, at b-værdierne på ingen måde er specifikke for en bestemt cellelinje, men snarere er en konsekvens af det valgte cellekulturmedium, flere forsøgsinkubationsparametre og den eksperimentelle procedure, herunder stort set alle aspekter, der kan påvirke klonudvæksten af celler, der befinder sig i en ekstrem stresssituation, når de udplantes som enkeltceller, f.eks. mediets sammensætning, tilførsel af næringsstoffer og vækstfaktorer, metoder til celleseparation, plastikvarer osv. F.eks. svækkede brugen af konditioneret medie fra BT20-celler, der var næsten konfluente, kraftigt den kooperative adfærd hos BT20-enkelceller, mens denne procedure ikke havde nogen indvirkning på den klonogene vækst af MDA-MB231-celler, der ikke voksede kooperativt. Desuden var fordoblingstiden for kooperative BT20-celler afhængig af både inkubationstiden og celletætheden i brønden, hvilket giver en selvindlysende biologisk forklaring på de upræcise klonogene overlevelsesfraktioner, der er opnået ved PE-baserede beregninger: En prolifererende celleklynges væksthastighed kan simpelthen være for langsom til at nå tærsklen på 50 celler pr. koloni inden for inkubationstiden for analysen. Derfor er den tilsyneladende “ikke-klonalitet” af en klynge af f.eks. 35 langsomt prolifererende celler på stoptidspunktet blot en uundgåelig konsekvens af forsøgsinkubationstiden, som – i det mindste til en vis grad – er vilkårligt valgt. I denne forbindelse analyserede vi desuden inkubationstidens indvirkning på de opnåede klonogene overlevelsesfraktioner og konstaterede, at det ikke er tilstrækkeligt at bestemme stoptidspunktet alene ved inspektion af kontrolskålene, som foreslået af andre: En for tidlig afslutning af inkubationstiden kan føre til overordentlig lave overlevelsesfraktioner på plader med mere aggressiv behandling, hvor reparation af skader før fortsættelse af cellevæksten kræver yderligere tid.
Væsentligt er det, at vores data er helt i overensstemmelse med banebrydende resultater fra banebrydende cellekulturforskere i 1940’erne og 1950’erne og blot afspejler et fænomen, som var genstand for omfattende undersøgelser på det pågældende tidspunkt. Puck og kolleger var de første til at offentliggøre en overlevelseskurve for bestrålede enkeltceller i 1956. Den største videnskabelige udfordring for denne grundlæggende præstation var imidlertid et på daværende tidspunkt uløst problem i forbindelse med pattedyrs celledyrkning: Cellelinjer stoppede med at vokse in vitro, så snart cellerne blev udplottet ved lav tæthed. Et forsøg på at overvinde dette problem blev gjort i 1948 af Sanford et al., hvor det lykkedes Sanford et al. at dyrke fibroblast-kolonier af enkeltcellede fibroblaster i små kapillærer, hvor diffusionen af celleafledte faktorer til mediet var stærkt reduceret, hvilket gav mulighed for tilstrækkelig autokrin vækststimulering . De påpegede betydningen af at prækonditionere kulturmediet med dyrkede celler og konkluderede, at et cellekulturmedium, der er tilstrækkeligt til at muliggøre uendelig vækst af en cellekultur med høj tæthed, i virkeligheden er “langt fra optimalt til vækst af en enkelt celle”. I tråd hermed beskrev Earle et al., at udpladning af den pågældende celletype ved meget lav tæthed resulterede i celledød , og dette arbejde dannede grundlag for den første publikation om klonogen vækst af pattedyrceller in vitro af Puck og Marcus i 1955 . Inspireret af behovet for konditioneret kulturmedium for at lette enkeltcellers vækst anvendte de et samdyrkningssystem af HeLa-enkelceller og et lag stærkt bestrålede feederceller af samme type. I overensstemmelse med de foregående undersøgelser konkluderede de, at hæmningen af enkeltcellers vækst i store forsøgsvolumener skyldtes “tab af en kortlivet, diffunderbar faktor” . I senere publikationer, som f.eks. den med den første overlevelseskurve for bestrålede pattedyrsceller, undlod Puck og kolleger ofte at anvende feederlag, da de havde udviklet avancerede dyrkningsteknikker, der tillod enkeltcellevækst med 100 % PE uden tilførsel af vækstfaktorer fra feederceller . De erklærede, at omhyggelige vaske- og trypsiniseringsprotokoller var afgørende i denne henseende, og de opfandt udtrykket “cooperative action” for at beskrive, at celler i en kulturskål kan være forskellige med hensyn til genotype såvel som fysiologisk tilstand . Vores resultater bekræfter disse observationer: Inden for et panel af 50 kræftcellelinjer observerede vi, at suboptimal vækst af enkelte celler i moderne, standardiserede kulturmedier suppleret med FCS stadig er et meget almindeligt fænomen, hvilket kan udledes af, at mere end halvdelen af cellelinjerne udviste kooperativ vækstadfærd. Hvis der findes suboptimale PE’er for en bestemt cellelinje, er det derfor sandsynligt, at klonogene assayet samtidig kan påvise både indflydelsen af den pågældende behandling og virkningen af det cellulære samarbejde. Det lå ikke inden for rammerne af denne undersøgelse at identificere specifikke vækstunderstøttende faktorer, som kan påvirke PE for de analyserede cellelinjer. Vi antager imidlertid, at suboptimale vækstbetingelser for enkeltceller af en given cellelinje kan skyldes meget forskellige parametre, såsom lave koncentrationer af klassiske vækstfaktorer og/eller hormoner (f.eks. epidermal vækstfaktor eller østrogen), men også forskellige lav- og højmolekylære metabolitter, som mindst en del af enkeltcellerne udviser auxotrofi for. Desuden vil ernæringstilskuddet til enkeltceller i en kulturskål sandsynligvis blive påvirket af de fysisk-kemiske parametre i det omgivende medium og plastmaterialet, herunder graden af proteinbinding af de respektive auxotrofiske faktorer eller deres adsorption til plastoverfladen. Teoretisk set kan dette problem løses ved at træffe foranstaltninger, der genopretter den maksimale PE under forhold med lav tæthed, således at der (gen)etableres en lineær korrelation mellem S og C (b = 1). Pucks anbefalinger om anvendelse af feederceller, konditionerede medier og/eller indlejring af enkeltceller i blød agar kan være tilstrækkelige til at opnå dette for udvalgte cellelinjer og skulle øge robustheden af PE-baserede beregninger i overensstemmelse hermed. Det er imidlertid indlysende, at det kan være mere end udfordrende at forfine og standardisere testbetingelserne, så enkeltcellers overlevelses- og vækstrater er optimale for hver enkelt celletype af interesse . Vi besluttede at acceptere suboptimale forsøgsbetingelser for enkeltcellers vækst og udviklede i stedet en beregningsmetode til analyse af klonogene overlevelsesdata, som tager højde for dette velbeskrevne fænomen. Det er klart, at vores fremgangsmåde, hvor vi anvender effektregression og interpolation, lå uden for de tekniske muligheder i 1950’erne, hvor overlevelsesdata blev tilpasset efter øjemål . Men på en eller anden måde røg relevansen af cellulært samarbejde ud af fokus i løbet af de følgende årtier. Selv om der i tidens løb blev rapporteret om nogle få rapporter om ikke-linearitet i koloni-dannelsesassays, blev den begrænsede ydeevne af PE-baserede analyser ikke behandlet .
Interessant nok rapporterede disse undersøgelser om en mindre end lineær stigning i koloniantal med stigende antal udsåede celler for visse celletyper under specifikke betingelser. I overensstemmelse hermed opnåede vi for nogle få cellelinjer i vores panel også b-værdier lidt under 1,0. Tre forskellige scenarier kan forklare denne observation, hvoraf de to skyldes metodologiske artefakter: For det første kan b-værdier lidt under 1,0 skyldes optælling af brønde med et stort antal overvoksede kolonier, hvor små kolonier er overset af forskeren (se brønde markeret med “nd” i fig. 1a). For det andet kan cellevæksten i skåle med et stort antal celler blive hæmmet i ret tidlige stadier på grund af et hurtigt fald i næringsstofkoncentrationen, hvilket resulterer i kolonier, der ikke kan opføres. En tredje – og biologisk mindre intuitiv – mulighed er en konkurrencemæssig adfærd i forbindelse med cellevækst, f.eks. på grund af sekretion af væksthæmmende faktorer. Det er vigtigt, at regressions- og interpolationsmetoden tager højde for alle disse fænomener, fordi den tager højde for enhver afvigelse fra linearitet som afspejlet af b-værdien.
Det er desuden bemærkelsesværdigt, at b-værdierne for forskellige cellelinjer for ubehandlede sammenlignet med bestrålede forhold ikke er identiske. I de fleste af disse tilfælde har b-værdierne for bestrålede celler tendens til at være højere end de respektive b-værdier for ubehandlede kontroller, hvilket indikerer, at det cellulære samarbejde øges ved bestråling. Følgelig bliver intervallet af overlevelsesfraktionsværdier for C = 5 til 100 kolonier større end i tilfælde af næsten identiske b-værdier (se cellelinjerne HCC1806 og A549). Dette betyder, at det teknisk set ikke er muligt at uddrage mere præcise overlevelsesværdier ved hjælp af den klonogene testprocedure – medmindre et fast antal kolonier (C) blev udvalgt til analyse. Desuden kan cellelinjer med overordentlig høje b-værdier for behandlede celler være af særlig interesse med hensyn til undersøgelser af behandlingsresistens. For eksempel kan stråleinducerede overlevelsesfaktor(er), der udskilles af en bestemt celletype, identificeres på grund af en tilsvarende høj b-værdi.
Sammenfattende viser vores data behovet for omhyggeligt at analysere data fra kolonidannelseseksperimenter og for at tage hensyn til den undervurderede indvirkning af cellulært samarbejde på beregninger af overlevelsesfraktion. Dette kan i høj grad øge pålideligheden af det klonogene assay – og modstandsdygtigheden af enhver hypotese baseret på det.