Bakterielle cellemembranaktiviteter af PHMB

Hvis den antibakterielle aktivitet af PHMB (fig. 1a) skyldes membranforstyrrelse, som det er almindeligt rapporteret6,7,8,9,10 , ville det forventes at permeabilisere bakterielle cellebarrierer ved væksthæmmende og sub-væksthæmmende koncentrationer. For at afprøve denne model fastlagde vi først de minimale hæmmende koncentrationer (MIC) og tidsdræbende egenskaber for PHMB over for Escherichia coli (stammerne K-12 og MG1655) og Salmonella enterica serovar Typhimurium (stamme LT2). Som tidligere rapporteret2,4 udviste PHMB potente væksthæmmende og dræbende egenskaber (Supplerende tabel 2 og Supplerende figur 1). Efter behandlingen undersøgte vi også cellerne ved hjælp af lysmikroskopi. Uventetvis lyste væksthæmmende koncentrationer af PHMB ikke cellerne, hvilket blev overvåget ved hjælp af lysfeltmikroskopi. For at vurdere skader på cellebarrieren, som kunne være usynlige for mikroskopi, blev E. coli K-12-kulturer dyrket til mid-log-fase, behandlet med PHMB i tilstedeværelse af den fluorescerende membranintegritetssonde SYTOX®Green og derefter overvåget ved hjælp af fluorimetri. Denne sonde er nyttig som indikator for membranbeskadigelse, fordi den normalt udelukkes fra intakte bakterier, og fordi dens fluorescenskvanteudbytte stiger ved DNA-binding. Derfor forventes intakte bakterier at vise lav fluorescens, og fluorescensen forventes at stige efter beskadigelse af cellebarrieren16. Som forventet viste nyligt dyrkede E. coli-kulturer store stigninger i fluorescens efter behandling med den kendte cellevægsforstyrrende substans polymyxin B eller varmebehandling (fig. 1b). Uventetvis resulterede PHMB-behandling i forholdsvis lavere fluorescensniveauer. Det mest påfaldende er, at højere koncentrationer af PHMB resulterede i fluorescens på baggrundsniveau. Disse observationer er ikke forenelige med membranafbrydelse som den vigtigste antibakterielle mekanisme og rejser derfor yderligere tvivl om den etablerede model.

Figur 1
figur1

PHMB’s virkninger på cellemembranpermeabilitet og indtrængen i bakterier.

(a) Struktur af polyhexamethylenbiguanid (PHMB; CAS# 27083-27-8); alternative kemiske navne: polyhexanid; eksempel på handelsnavne: For eksempel: Vantocil™, Cosmocil™, Baquacil™, Prontosan®. Se supplerende tabel 1 for yderligere oplysninger. PHMB består af gentagne basiske biguanidin-enheder, der er forbundet med hexamethylen-kulbrintekæder, hvilket giver en kationisk og amfipatisk struktur med en høj kapacitet for hydrogenbindinger, elektrostatiske og hydrofobiske interaktioner. PHMB-præparater består typisk af polymerer af blandet længde med amin-, guanidin- og cyanoguanidin-endegrupper (f.eks. gennemsnitligt n = 13,8, 3,035 g/mol44). b) Virkninger af PHMB, varme, polymyxin B (positiv kontrol) og triclosan (negativ kontrol) på cellepermeabilitet for SYTOX®Green. MIC-værdierne for de testede antibakterielle stoffer er angivet med farvekodede lodrette pile, øverst. (c) Fluorescensmikroskopi af PHMB-FITC’s indgang i forskellige bakterier. PHMB-FITC (2 μg/mL) blev tilsat til bakteriekulturer, og cellerne blev modfarvet med DAPI. (d) Konfokalt billede, der viser lokalisering af PHMB-FITC (grøn) i B. megaterium; bakterierne blev modfarvet med den membranlokaliserende sonde hvedekim-agglutinin (WGA) konjugeret til Alexa Fluor-555 (rød) og visualiseret som levende (øverst) og fikserede (nederst) celler; Bar = 5 μm. (e) Fluorescensintensitetsprofilplotanalyse af den cellulære lokalisering af PHMB-FITC- og WGA-fluorescens (den hvide linje angiver det tværsnit, der blev anvendt til analysen). Den grønne linje angiver niveauerne af FITC og position (hovedsagelig inden for cellen). Den røde linje angiver niveauerne af WGA og position (hovedsageligt inden for membranen).

PHMB trænger ind i bakterier

Hvis PHMB’s primære mål ikke er bakterielle cellebarrierer, eller ikke udelukkende cellebarrierer, så virker det sandsynligvis internt, og dette ville kræve celleindgang. For at teste for bakteriel indgang syntetiserede vi et PHMB-FITC-konjugat (Supplerende fig. 2a,b) og vurderede optagelsen i Gram-positive (Staphylococcus aureus), Gram-negative (Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium) og syrefaste (Mycobacterium smegmatis) bakterier ved hjælp af mikroskopi og flowcytometri (fig. 1c, Supplerende fig. 3). Der blev observeret kraftig celleassocieret grøn fluorescens i alle testede arter (fig. 1c). For at undersøge cellelokaliseringen mere grundigt blev den store bakterie Bacillus megaterium behandlet med PHMB-FITC, modfarvet med membranlokaliserende hvedekimagglutininin (WGA-rød) og undersøgt ved fluorescensmikroskopi (fig. 1d). Der blev observeret celleindgang i både levende og fikserede celler, og en analyse af fluorescensintensitetsprofilen viser, at PHMB-FITC blev lokaliseret i cytoplasmaet uden ophobning ved cellebarrieren (Fig. 1e).

Observationen af, at PHMB trænger ind i celler ved lave mikrogram/mL-koncentrationer, tyder på, at det kan trænge ind i levende celler. For at undersøge, om PHMB-optagelse i bakterier kræver energimetabolisme, blev E. coli-kulturer i mid-log-fase inkuberet ved 37 °C eller ved 4 °C i 2 timer for at reducere de cellulære ATP-niveauer. Efterfølgende blev cellerne behandlet med PHMB-FITC (0-6 μg/ml) og yderligere inkuberet på is i 2 timer. Celle-associeret PHMB-FITC-fluorescens blev kvantificeret ved fluorimetri (Supplerende figur 3b). Celler, der blev holdt ved 4 °C, udviste reduceret PHMB-FITC-optagelse i forhold til celler, der var inkuberet ved 37 °C, hvilket stemmer overens med en energiafhængig celleoptagelsesproces. Der blev også observeret grøn fluorescerende og bevægelige bakterier på flere tidspunkter under PHMB-behandlingen (Supplerende fig. 3). Da bakteriel motilitet er energiafhængig17 , tyder det på, at PHMB-FITC kommer ind i metabolisk aktive celler. Derfor trænger PHMB ind i diverse bakterier, og der blev observeret indgang i motile celler.

PHMB standser celledelingen og kondenserer bakteriekromosomer

Ved undersøgelse af E. coli ved mikroskopi bemærkede vi, at PHMB-behandlede celler ofte udviste en langstrakt morfologi, hvilket kan være karakteristisk for celledelingshæmning (Fig. 2a). For at måle virkningerne af PHMB på celleforlængelse titrerede vi PHMB i voksende kulturer af E. coli-stamme SS996 (vide infra) og målte cellelængder. Ved væksthæmmende koncentrationer blev mere end 80% af cellerne forlænget (Fig. 2b; Supplerende tabel 2). Vi observerede også, at E. coli, der blev behandlet med væksthæmmende koncentrationer af PHMB eller PHMB-FITC efterfulgt af DAPI-farvning, viste blå fluorescerende foci nær cellecentret (Fig. 2c). Disse strukturer lignede nukleoider18. For at lette visualiseringen af DNA-foci’erne genererede vi filamentøse/multinuklede populationer af E. coli ved at hæmme celledelingen ved hjælp af RNA-silensering af det essentielle celledelingsgen ftsZ19. RNA-silencering blev valgt til dette forsøg, fordi det giver mulighed for specifik og kontrollerbar undertrykkelse af translation af essentielle gen-transskriptioner20. Gener, der er essentielle for væksten, kan ikke slås ud ved hjælp af metoder til at nedbryde genomet, da dette ville resultere i ikke-levedygtige stammer. I fravær af PHMB viste filamentøse celler ensartet DAPI-farvning, mens PHMB-behandlede celler viste blå “perlesnore” (fig. 2d). På samme måde observerede vi i den store Gram-positive bakterie B. megaterium DAPI-farvede foci efter PHMB-behandling (Fig. 2e). Disse resultater, i både Gram-negative og Gram-positive arter, viser, at PHMB-eksponering fører til kondenserede kromosomer i bakterier.

Figur 2
figur2

PHMB-medieret celleforlængelse og kromosomkondensation i bakterier.

(a) E. coli blev behandlet med PHMB i 90 minutter og undersøgt ved bright field-mikroskopi. (b) Gennemsnitlig cellelængde som en funktion af PHMB-koncentrationen. MIC (pil) er angivet. (c) Mønsteret af kromosomfordelingen i celler efter PHMB-FITC-behandling. Kulturer af E. coli, stamme K-12, blev behandlet med PHMB-FITC, modfarvet med DAPI og undersøgt ved hjælp af fluorescensmikroskopi. Kromosomer fremstår som kondenserede DAPI-farvede foci; de er mere tydelige på det forstørrede billede. (d) Mønsteret for kromosomfordelingen i filamentøs/multinuklet E. coli efter PHMB-eksponering. RNA-silensering af ftsZ-ekspression blev anvendt til at standse celledelingen, og cellerne blev derefter ubehandlet eller behandlet med PHMB, farvet med DAPI og undersøgt ved fluorescensmikroskopi. (e) Mønsteret af kromosomfordelingen i B. megaterium-celler, der blev ubehandlet eller behandlet med PHMB, farvet med DAPI og WGA-rødt og undersøgt ved hjælp af fluorescensmikroskopi.

PHMB-medierede antibakterielle virkninger er uafhængige af stressresponsveje

Celleforlængelse og kromosomkondensering er karakteristiske morfologier, der ofte er forbundet med bakteriel SOS-respons21,22. Derfor overvejede vi, at disse virkninger kunne involvere dette respons. I tilfælde af PHMB-medierede virkninger syntes det imidlertid usandsynligt, at der var tale om et SOS-respons. For det første er SOS-reaktionen typisk forbundet med DNA-skader, og der er ingen beviser for PHMB-medierede genotoksiske eller epigenetiske virkninger23. For det andet skete den kondensation, der blev observeret efter ftsZ-silensering og PHMB-behandling, i en recA-stamme (TOP10), som er en SOS-responsmutant. Ikke desto mindre er antimikrobielle mekanismer notorisk vanskelige at afkode og kan involvere flere mekanismer. Derfor besluttede vi at vurdere den mulige involvering af et SOS-respons og andre stressresponsveje ved hjælp af en SOS-reporterstamme og et panel af E. coli stressresponsvejsmutanter.

For at teste, om PHMB-medierede virkninger på celleforlængelse og kromosomkondensering ændres af mutationer til SOS-responsvejen, evaluerede vi morfologiske reaktioner i tre mutante E. coli-stammer. Stamme SS996 er i stand til at initiere et SOS-respons, men på grund af en sulB-mutation fører responset ikke til celledelingsinhibering. Dette skyldes, at SS996 har en mutantallel af ftsZ (sulB103), hvis produkt er ufølsomt over for virkningen af den SOS-inducerede celledelingsinhibitor SulA24. Stamme JW2669 producerer ikke funktionel RecA og er derfor SOS-mangelfuld. Stamme AB2474 har en mutation i LexA-repressoren, som gør den ikke-spaltbar af RecA og derfor ikke er i stand til at inducere et SOS-respons (yderligere oplysninger om stammen findes i fig. 3 og supplerende oplysninger i tabel 3). Kulturer i mid-log-fase blev behandlet med PHMB, DAPI-farvet og observeret under et fluorescensmikroskop. Som det blev observeret med E. coli K-12, viste mutantstammerne langstrakte morfologier og kondenserede kromosomer efter PHMB-behandling (Fig. 3a). Derfor forekommer PHMB-medierede virkninger på celledeling og kromosomstruktur uafhængigt af et SOS-programmeret respons.

Figur 3
figur3

Effekter af PHMB på bakterielle SOS-reaktioner.

(a) Kromosomkondensering i E. coli-stammerne SS996 (sulB103; FtsZ-mutant ufølsom over for SulA), JW2669 (recA-; knock-out af recA) og AB2474 (lexA1, mutation, der forhindrer induktion af SOS-respons) efter behandling med PHMB i 2 timer. Cellerne blev farvet med DAPI for at afsløre DNA. (b) SOS-responsreporterekspression, kvantificeret ved fluorimetri. SOS-reporter E. coli-stammen SS996, der bærer en kromosomal sulAp-gfp-fusion, blev ubehandlet eller behandlet med PHMB, mitomycin C, en kendt SOS-inducerende faktor, eller triclosan, som ikke inducerer et SOS-respons. MIC-værdierne mod SS996 var PHMB, 0,75 μg/mL; triclosan, 2 μg/mL; mitomycin C, 0,06 μg/mL, og disse værdier blev anvendt til beregning af %MIC.

For mere direkte at måle, om PHMB inducerer et SOS-respons, anvendte vi E. coli-stammen SS996, som er en reporterstamme, der indeholder et sulAp-gfp kromosomalt SOS-respons/reportorsystem24,25. Hvis et SOS-respons forårsages af PHMB, bør PHMB-eksponering inducere GFP-ekspression i denne stamme. Kulturer af SS996 blev behandlet med PHMB i 18 timer, hvorefter den grønne fluorescens blev målt. Mitomycin C, som beskadiger DNA, blev medtaget som en positiv kontrol og triclosan, som hæmmer fedtsyrebiosyntesen, blev medtaget som en negativ kontrol. Som forventet inducerede mitomycin C en stor stigning i GFP-ekspression, mens triclosan ikke inducerede GFP-ekspression. I modsætning til mitomycin C inducerede PHMB ikke GFP-ekspression, hvilket indikerer, at PHMB ikke inducerer et SOS-respons (Fig. 3b).

Vi testede derefter, om stammer med defekte eller deregulerede SOS-responser adskiller sig i modtagelighed over for PHMB. For at teste recA-medierede virkninger på modtagelighed anvendte vi en stamme af E. coli, der mangler recA (JW2669), og en stamme, der overeksprimerer recA ved tilsætning af induktoren IPTG (ASKA JW2669), og bestemte MIC-værdier. Hverken deletion eller induceret overekspression af recA ændrede modtageligheden over for PHMB (Supplerende information, tabel 3, rækker med mørkegrå skraveret farve). I modsætning hertil var recA-stammen 2 gange mere modtagelig over for det SOS-responsinducerende lægemiddel nalidixinsyre, og recA-overekspression reducerede modtageligheden over for nalidixinsyre 8 gange. For at teste lexA-medierede virkninger på PHMB-modtagelighed anvendte vi lexA1(Ind-)-stammen AB2474, som ikke er i stand til at inducere et SOS-respons. I forhold til moderstammen var AB2474 1-fold mere modtagelig over for PHMB og 1-fold mindre modtagelig over for nalidixinsyre (Supplerende tabel 3, rækker med lysegrå skravering). Derfor viste ingen af de testede SOS-responsmutanter ændringer i modtagelighed over for PHMB, der indikerer involvering af et SOS-respons.

Slutteligt undersøgte vi, om andre (ikke-SOS) stressresponsveje påvirker modtagelighed over for PHMB. Vi testede en række kendte E. coli-stressresponsmutanter parallelt med deres forældre for modtagelighed over for PHMB. Ingen af mutanterne viste ændringer i MIC-værdierne, der tyder på en funktionel involvering af nogen af stressresponsvejene (Supplerende tabel 3). Derfor forekommer de antibakterielle virkninger af PHMB uafhængigt af det panel af stressresponsmekanismer, der er testet.

PHMB kondenserer bakterielle kromosomer in vitro

Hvis PHMB kondenserer bakterielle kromosomer inde i cellerne, kan dette ske via direkte eller indirekte virkninger på DNA. Vi mistænkte direkte virkninger, fordi PHMB er blevet vist at binde til DNA-fragmenter in vitro15. Vi besluttede at undersøge PHMB’s DNA-bindingsegenskaber ved hjælp af isoleret E. coli-kromosomalt DNA. PHMB-DNA-interaktioner blev først undersøgt ved hjælp af en elektroforisk mobilitetsforskydningsanalyse (EMSA) og en farvestofeksklusionsanalyse. PHMB blev blandet med kromosomalt DNA isoleret fra E. coli K-12, og blandingerne blev fraktioneret i agarose/TBE-geler, efterfulgt af DNA-farvning med ethidiumbromid. PHMB:DNA-blandinger med et wt:wt-forhold på ≥0.5 viste en klart forsinket elektroforetisk mobilitet, som indikeret ved tilbageholdelse af DNA i brønden (fig. 4a). Lignende resultater blev opnået for PHMB-FITC. Den hæmmede mobilitet og tilbageholdelse i brøndene er i overensstemmelse med stabile interaktioner mellem PHMB og DNA. EMSA-analyserne viste også en reduceret ethidiumbromidfluorescens i tilstedeværelse af PHMB eller PHMB-FITC, hvilket tyder på, at ethidiumbromid blev forhindret i at binde til DNA på grund af dannelsen af PHMB:DNA-komplekser. Denne observation blev yderligere undersøgt ved hjælp af det DNA-bindende farvestof SYTOX®Green i et farvestofudelukkelsesassay. I fravær af PHMB bandt SYTOX®Green isoleret E. coli-DNA, hvilket indikeres af en stor stigning i fluorescensen i forhold til til tilsætning af farvestof alene. Forudgående tilsætning af PHMB reducerede imidlertid fluorescensen >80 % (fig. 4b). PHMB danner derfor komplekser med bakterie-DNA på en måde, der forsinker den elektroforetiske mobilitet og maskerer DNA’s adgang til DNA-ligander. Resultaterne af hvert af disse eksperimenter tyder på, at PHMB binder direkte til DNA.

Figur 4
figur4

PHMB-binding til bakterielt kromosomalt DNA in vitro.

(a) PHMB eller PHMB-FITC blev blandet med isoleret kromosomalt DNA fra E. coli stamme K-12, og prøverne blev analyseret ved EMSA. Mønstre af forsinket mobilitet i gelet indikerer DNA-binding af PHMB. (b) PHMB-medieret udelukkelse af SYTOX®Green-binding til isoleret E. coli-kromosomalt DNA, hvor reduceret fluorescens indikerer DNA-binding af PHMB. (c) Cirkulær dichroisme-spektroskopi af blandinger af PHMB og isoleret E. coli-kromosomal DNA. (d) Plot af ellipticitet som en funktion af PHMB:DNA-forholdet.

For at lære mere om, hvordan PHMB-binding til DNA påvirker strukturen af chomosomalt DNA, brugte vi biofysiske metoder og mikroskopi. Kombinationer af PHMB og isoleret E. coli kromosomalt DNA blev undersøgt ved cirkulær dichroisme (CD) spektroskopi. PHMB alene viste ikke et karakteristisk CD-spektrum, mens isoleret kromosomalt DNA viste et typisk DNA-spektrum med en positiv maksimal ellipticitet omkring 260 nm, et negativt kryds ved 252 nm og et negativt lavpunkt ved ca. 245 nm. Dette gav os mulighed for at vurdere ændringer i DNA’s CD-spektrum efter tilsætning af PHMB. Blandinger af PHMB og DNA viste reduceret ellipticitet ved 260 nm, hvilket tyder på strukturelle ændringer i DNA’et ved PHMB-binding (fig. 4c,d). Desuden viste dynamisk lysspredning (DLS), at PHMB-binding til DNA resulterer i dannelsen af nanopartikler på ca. 50-60 nm med et lavt polydispersitetsindeks (supplerende figur 4a). Endelig viste transmissionselektronmikroskopi (TEM) og fluorescensmikroskopi også, at PHMB-binding til DNA resulterer i dannelsen af nanopartikler (supplerende figur 4b,c). Disse resultater bekræfter derfor tidligere rapporter om, at PHMB binder DNA26 , og afslører, at PHMB binder isoleret bakterielt kromosomalt DNA og kan kondensere kromosomer til en population af nanopartikler med lav polydispersitet.

Den antibakterielle virkning af PHMB undertrykkes af en dsDNA-ligand

Vores resultater for PHMB’s virkninger på bakterier kan ikke forenes med membranforstyrrelsesmodellen for PHMB’s primære antibakterielle virkningsmekanisme. Vi foreslår snarere en ny model, hvor PHMB trænger ind i bakterier og derefter kondenserer kromosomer, som illustreret i fig. 5a. Hvis den nye model er korrekt, vil den også forudsige funktionelle interaktioner mellem PHMB og andre DNA-ligander, og denne idé gav os en måde at teste modellen på. Kort sagt, hvis denne model var korrekt, ville det forventes, at DNA-ligander med lille molekylvægt ville undertrykke PHMB’s antibakterielle styrke ved at konkurrere om DNA-bindingssteder i kromosomer. For at teste denne mulighed blev parvise kombinationer af PHMB og Hoechst 33258 anvendt i vækstfølsomhedsassays. Hoechst 33258 er en DNA-ligand, der fortrinsvis binder sig til den mindre rille i AT-rige sekvenser27 , og den er cellepermeabel, hvilket gør den velegnet til dette konkurrenceeksperiment.

Figur 5
figur5

Model for den antibakterielle virkningsmekanisme for PHMB og undertrykkelse af væksthæmning.

(a) Forslag til antibakteriel virkningsmekanisme for PHMB. (b) Parvise væksthæmningsinteraktioner mellem PHMB og Hoechst 33258 og negative kontrol-ikke-DNA-bindende ligander (triclosan og trimethoprim) i forskellige bakteriearter. (c) Forholdet mellem bakteriegenomets AT-indhold og antibakterielle interaktioner med PHMB. Plot af væksthæmmende interaktioner og DNA AT-indhold i forskellige arter. Interaktionsværdierne er fraktionelle hæmmende koncentrationsindikatorer (FICI) mellem PHMB og Hoechst 33258 eller ikke-DNA-bindende ligander i den negative kontrol (trimethoprim og triclosan). (d) Bacillus megaterium-væksthæmning ved PHMB og undertrykkelse ved kombinationer med DNA-liganden Hoechst 33258 (blå linjer). Se supplerende tabel 4 for artsliste og hæmningsværdier.

Medikamentinteraktioner blev beregnet som fraktionelle hæmmende koncentrationsindeksværdier (FICI) ved hjælp af et panel af divergerende bakteriearter. FICI-værdierne for PHMB:Hoechst var signifikant højere end for PHMB kombineret med en af de to ikke-DNA-ligand antibakterielle stoffer (fig. 5b). FICI-værdierne for PHMB:Hoechst-kombinationer viser også en positiv korrelation med kromosom-AT-indholdet (fig. 5c). Med andre ord afhænger PHMB’s antimikrobielle virkninger af adgangen til DNA i cellerne. I B. megaterium var virkningerne af PHMB:Hoechst-kombinationer slående, hvor væksthæmning af PHMB blev undertrykt ved hjælp af subinhibitoriske Hoeschst 33258-koncentrationer (fig. 5d). Derfor reddede den lille molekylære DNA-ligand Hoechst 33258 bakterier fra hæmmende koncentrationer af PHMB.

Disse parvise lægemiddelinteraktioner afslører, at de antibakterielle virkninger af PHMB hovedsagelig forekommer via målretning af DNA i bakterier. I overensstemmelse med den cellepermeabilitetsændringsprofil, der er observeret for PHMB (fig. 1b), tyder resultaterne også på konkurrence mellem PHMB og en DNA-ligand om DNA-bindingssteder inde i cellerne. Derfor er resultaterne fra separate eksperimenter med to kendte DNA-ligander i overensstemmelse med vores nye model for PHMB-aktivitet.

PHMB trænger ind i pattedyrceller, men udelukkes fra kerner

Den fremherskende model for PHMB-aktivitet går ud på, at PHMB dræber bakterier gennem bakteriemembranbeskadigelse, og at polymeren ikke interagerer med pattedyrcellemembraner (se ovenfor). I betragtning af PHMB’s uventede egenskaber ved indtrængen i bakterieceller og vores nylige observationer af, at PHMB trænger ind i dyrkede makrofager28 og keratinocytter29 , besluttede vi imidlertid at foretage en direkte vurdering af PHMB’s evne til at trænge ind i et panel af pattedyrceller. PHMB-FITC blev tilsat til flere pattedyrcellelinjer og primære fibroblaster, og optagelsen blev vurderet ved fluorescensmikroskopi og flowcytometri. Vi observerede tydelig optagelse i alle testede celletyper (Fig. 6a,b). Disse betingelser førte heller ikke til forstyrrelse af pattedyrcellers membranintegritet (supplerende fig. 5a). En nøje inspektion af mikroskopibillederne afslører, at PHMB-FITC var indeholdt i vesikler og udelukket fra kerner (Fig. 6a). Hvis det er sandt, at endosomer indfanger PHMB, bør frigivelse i cytoplasmaet afbløde PHMB-FITC og føre til en stigning i fluorescensen. Dette skyldes, at FITC-fluorescens slukkes ved lav pH, og den sene endosomale pH-værdi er <630, mens den cytoplasmatiske pH-værdi er 7,4. Vi observerede, at tilsætning af chloroquin, et osmolytisk/buffermiddel31 , øgede fluorescensen af PHMB-FITC-behandlede celler (Fig. 6c), hvilket stemmer overens med polymerindfangning i endosomer. PHMB kommer derfor effektivt ind i pattedyrceller, men er indfanget i endosomer, hvilket tilsyneladende begrænser indgangen til kerner.

Figur 6
figur6

PHMB-indgang i pattedyrceller.

(a) Primære fibroblaster blev behandlet med PHMB-FITC (3,5 μg/mL), modfarvet med Hoechst 33258 og observeret ved fluorescensmikroskopi. (b) Flowcytometrianalyse af et panel af pattedyrceller behandlet med PHMB-FITC. Indsat: et repræsentativt eksempel på et flowcytometrihistogram af HeLa-cellepopulationer, der var ubehandlet (lilla population) eller behandlet med PHMB-FITC (0,4 μg/mL) (grøn population). (c) HeLa-celler blev behandlet med PHMB-FITC (3,5 μg/mL) og chloroquin (0-20 μM) i 2 timer. Virkningerne af chloroquin på fluorescens blev målt ved flowcytometri ved hjælp af geometrisk gennemsnitlig fluorescensintensitet (arbitrære enheder (A.U.), log-skala).

Articles

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.