Was ist Single-Molecule Real-Time (SMRT) Sequenzierung?

Von Dr. Maho Yokoyama, Ph.D.Überprüft von Christian Zerfaß, Ph.D.

Springen Sie zu:

• Wie funktioniert SMRT-Sequenzierung?
• Studying DNA Methylation in Bacteria; an Application of SMRT Sequencing

Die DNA-Sequenzierung funktioniert, indem DNA-Polymerase verwendet wird, um Nukleotide an eine Vorlage anzuhängen. Es gibt verschiedene Technologien für die DNA-Sequenzierung. Ein Beispiel ist die Einzelmolekül-Echtzeit-Sequenzierung oder SMRT-Sequenzierung.

Forscher bei der Untersuchung eines DNA-Sequenz-Dias. Credit: Shawn Hempel /

Wie funktioniert die SMRT-Sequenzierung?

Wie bei anderen DNA-Sequenzierungstechnologien besteht der erste Schritt nach der DNA-Extraktion in der Vorbereitung einer „Bibliothek“. Dieser Prozess bereitet die DNA für die Sequenzierung vor; in diesem Fall werden an beiden Enden eines doppelsträngigen DNA-Moleküls Adaptoren hinzugefügt, wodurch die DNA effektiv zu einer einzelsträngigen zirkulären Vorlage wird. Dies bedeutet, dass die DNA kontinuierlich sequenziert werden kann.

Diese DNA-Bibliothek bzw. die Template-DNA wird dann in einen DNA-Sequenzer gegeben, der „Zero-Mode-Wellenleiter“ enthält, an deren einem Ende die DNA-Polymerase immobilisiert ist. Ein einzelnes DNA-Molekül wird dann in diesen Nullmoden-Wellenleitern immobilisiert, und die DNA-Polymerase beginnt, neue Nukleotide zu einem de novo synthetisierten DNA-Strang hinzuzufügen, der komplementär zur Template-DNA ist. Die Basen in diesen Nukleotiden werden markiert, und der Einbau dieser Basen in den wachsenden DNA-Strang führt zur Lichtemission. Diese Lichtemission wird dann in Echtzeit abgelesen, und da die Emission von jeder Base unterschiedlich ist, kann die spezifische Base identifiziert werden.

Der Hauptvorteil der SMRT-Sequenzierung ist die Erzeugung langer Sequenzier-Lesevorgänge mit hoher Genauigkeit, was den Zusammenbau ganzer Genome verbessert. Das liegt daran, dass längere Sequenzierungs-Reads bedeuten, dass weniger „Bauarbeiten“ erforderlich sind, um das Genom zusammenzusetzen.

Untersuchung der DNA-Methylierung in Bakterien; eine Anwendung der SMRT-Sequenzierung

Was ist DNA-Methylierung?

Das Anfügen einer Methylgruppe an die DNA, auch bekannt als Methylierung, kommt in allen Reichen des Lebens vor. In Bakterien gibt es drei methylierte Nukleotide: m5C (C5-Methyl-Cytosin, das auch in Eukaryoten vorkommt), m6A (N6-Methyl-Adenin) und m4C (N4-Methyl-Cytosin, das nur in Bakterien vorkommt). Die Methylierung erfolgt nach der Synthese neuer DNA-Stränge an bestimmten Nukleotiden.

Die Methylgruppen ragen aus der DNA-Doppelhelix heraus und können daher die Bindung zwischen DNA und DNA-Bindeproteinen beeinflussen. Dies wiederum wirkt sich auf Prozesse wie die Chromosomenreplikation, die Reparatur von DNA-Fehlanpassungen sowie den Zeitpunkt der Gentranskription und die Bildung epigenetischer Linien aus.

Epigenetische Mechanismen: die Methylierung oder Acetylierung der DNA kann die Gentranskription aktivieren oder nicht. Image Credit: ellepigrafica /

Warum ist die DNA-Methylierung in Bakterien wichtig?

Bakterien werden von Viren infiziert und brauchen daher einen Schutzmechanismus, um virale Infektionen zu überwinden. Hier kommen Restriktionsmodifikationssysteme ins Spiel; dieses System besteht aus einem Restriktionsenzym, das die DNA an bestimmten Stellen abbaut, und einer DNA-Methyltransferase, die eine Methylgruppe an Adenin (A) oder Cytosin (C) anhängt.

Bei den meisten Restriktionsmodifikationssystemen dient die DNA-Methyltransferase dem Schutz der bakteriellen DNA vor dem Restriktionsenzym. Das Vorhandensein der DNA-Methyltransferase bedeutet, dass die bakterielle DNA methyliert wird, während die virale DNA nicht methyliert wird. Dies wiederum bedeutet, dass die virale DNA durch das Restriktionsenzym abgebaut wird, während die bakterielle DNA geschützt ist, da das Restriktionsenzym nicht auf methylierte DNA wirkt. Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass es Restriktionsenzyme gibt, die auf modifizierte DNA einwirken.

Neue Studien haben angedeutet, dass Restriktions-Modifizierungssysteme noch weitere Funktionen haben könnten. So führte das Ausschalten bestimmter Restriktions-Modifizierungssysteme zu einer Veränderung der Genexpression, die mit dem Unterschied in der DNA-Methylierung zusammenhängt. Restriktions-Modifikationssysteme können auch Doppelstrangbrüche und C-T-Mutationen verursachen und so die Evolution von Bakterien beeinflussen. In jüngster Zeit wurden Technologien entwickelt, mit denen die Methylierung eines gesamten bakteriellen Genoms, des so genannten „Methyloms“, bestimmt werden kann.

Wie wird das Methylom mit Hilfe der SMRT-Sequenzierung bestimmt?

Da die SMRT-Sequenzierung Ergebnisse in Echtzeit liefert, kann sie zum Nachweis von DNA-Modifikationen, einschließlich Methylierungen, verwendet werden. Die DNA-Polymerase baut Nukleotide mit einer konstanten Rate ein, aber diese Rate kann sich ändern, wenn das Nukleotid in der Vorlage verändert wurde. Dies kann während des Sequenzierungsprozesses festgestellt werden.

Blow at al. verwendeten die SMRT-Sequenzierung, um DNA-Modifikationen in 230 Mikroorganismen zu kartieren. Zu den gesuchten Modifikationen gehörten m5C, m6A und m4C. Die Autoren fanden heraus, dass 93 % dieser Mikroorganismen eine DNA-Methylierung aufwiesen, und sie fanden auch 834 Motive, die methyliert waren. Auf diese Weise konnten die Autoren feststellen, welche Motive die Ziele von 620 DNA-Methyltransferasen sind.

Interessanterweise stellten die Autoren fest, dass zwar 48 % der untersuchten Organismen eine DNA-Methyltransferase aufwiesen, es aber keinen Hinweis darauf gab, dass auch ein Restriktionsenzym vorhanden war. Daher ist es möglich, dass die DNA-Methylierung eine wichtige Rolle bei der Genomregulierung oder eine andere wichtige Rolle in Mikroorganismen spielt, die noch zu identifizieren ist.

Weitere Lektüre

• Alle Inhalte zur DNA-Sequenzierung
• DNA-Sequenzierung
• DNA-Sequenzzusammenstellung
• DNA-Mikroarray
• Hochdurchsatz-DNA-Sequenzierungstechniken

Geschrieben von

Dr. Maho Yokoyama

Dr. Maho Yokoyama ist Forscherin und Wissenschaftsautorin. Sie promovierte an der University of Bath, Großbritannien, mit einer Arbeit auf dem Gebiet der Mikrobiologie, in der sie funktionelle Genomik auf Staphylococcus aureus anwandte. Während ihres Promotionsstudiums arbeitete Maho mit anderen Wissenschaftlern an mehreren Arbeiten zusammen und veröffentlichte sogar einige ihrer eigenen Arbeiten in von Experten begutachteten Fachzeitschriften. Sie präsentierte ihre Arbeit auch auf wissenschaftlichen Konferenzen auf der ganzen Welt.

Zitate