Indikationen der 16S rDNA PCR im weiten Bereich
Die 16S rDNA PCR im weiten Bereich kann sowohl lebensfähige als auch nicht lebensfähige Bakterien nachweisen, ähnlich wie die qPCR. Sie ist auch klinisch nützlich, wenn andere Techniken negative Ergebnisse liefern, z. B. bei kulturnegativer Endokarditis, septischer Arthritis, Meningitis oder langwierigen Infektionen.8 11 Die identifizierten Bakterien sind oft ungewöhnlich, selten, schwer zu kultivieren oder Bakterien, für die keine spezifische PCR verfügbar ist.8 9 Beispiele hierfür sind die Identifizierung von Helicobacter sp. als Ursache einer Osteomyelitis oder von Neisseria meningitidis als unerwartete Ursache einer septischen Arthritis mittels 16S rDNA-PCR, nachdem andere mikrobielle Diagnoseverfahren negative Ergebnisse geliefert hatten.12 13
Es ist auch möglich, zwischen verschiedenen Arten zu unterscheiden: Ureaplasma spp besteht aus zwei Bakterienstämmen, Ureaplasma parvum und Ureaplasma urealyticum, die durch Kultur nicht unterschieden werden können und jeweils im Verdacht stehen, bei Neugeborenen unterschiedliche Pathologien zu verursachen.7 14 15 Die 16S rDNA-Breitband-PCR mit anschließender Sequenzierung hat die Differenzierung und Identifizierung beider Arten ermöglicht und damit die Erforschung der artspezifischen Pathogenität unterstützt.8 16
Darüber hinaus können mit der 16S rDNA-Breitband-PCR bisher nicht charakterisierte Bakterien identifiziert werden. Die 16S rDNA-PCR mit großer Reichweite ermöglichte die Identifizierung von Bartonella henselae und Tropheryma whippelii als Erreger der Katzenkratzkrankheit bzw. der Whipple-Krankheit.17 18
Die große Reichweite der 16S rDNA-PCR macht sie jedoch anfällig für Kontaminationen. Die gesamte in einer Probe vorhandene bakterielle DNA wird amplifiziert, einschließlich derjenigen, die unvermeidlich in den Reagenzien vorhanden ist, was bedeutet, dass eine geringfügige Umweltkontamination nicht vollständig ausgeschlossen werden kann. Bei einer hohen Anzahl von thermischen Zyklen wird diese geringfügige Hintergrundkontaminations-DNA amplifiziert und führt zu einem falsch-positiven Ergebnis. Um dieses Risiko zu verringern, muss eine Sequenzierung durchgeführt werden, um zwischen einem echten Krankheitserreger und Kontaminanten (oft durch Wasser übertragene Bakterien, die höchstwahrscheinlich keine Krankheiten verursachen) zu unterscheiden. Mit Standard-Sequenzierungstechniken kann nur die dominanteste DNA-Sequenz identifiziert werden, was bedeutet, dass in Proben, in denen mehr als eine Bakterienart vorhanden ist (z. B. im Stuhl), die Ergebnisse nicht interpretierbar sind. Dies bedeutet, dass die 16S rDNA-PCR mit Standardsequenzierung für Proben von nicht sterilen Standorten nicht geeignet ist.
Um das Risiko einer Kontamination weiter zu verringern, wird die Anzahl der thermischen Zyklen im Vergleich zu spezifischen qPCRs reduziert, was jedoch gleichzeitig zu einer Verringerung der Empfindlichkeit führt.19 Dies bedeutet, dass die 16S rDNA-PCR mit breitem Spektrum immer weniger empfindlich sein wird als eine gut konzipierte spezifische qPCR in der Größenordnung von 1-2 logs. Ein letzter Nachteil besteht darin, dass diese Methoden auf Forschungs- oder Speziallabors beschränkt sein können, was bedeutet, dass die Proben möglicherweise verschickt werden müssen, was die Bearbeitungszeit verlängert.16 Ein Vergleich der wichtigsten Vor- und Nachteile von Kulturmethoden, qPCR und 16S rDNA-Breitband-PCR ist in Tabelle 1 dargestellt, und ein Flussdiagramm der vorgeschlagenen Untersuchungen bei Verdacht auf bakterielle Infektionen steriler Stellen, das sowohl qPCR als auch 16S rDNA-Breitband-PCR umfasst, ist in Abbildung 1C zu sehen.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Breitband-16S-rDNA-PCR eine wichtige Ergänzung zur mikrobiologischen Diagnostik ist, wenn ein starker Verdacht auf eine Infektion einer sterilen Stelle besteht, Kultur und qPCR für die wahrscheinlichsten Erreger jedoch negativ waren. Aufgrund des Risikos, eine bakterielle DNA-Kontamination nachzuweisen, werden weniger PCR-Zyklen als bei der qPCR durchgeführt, was zu einem weniger empfindlichen Test führt, so dass die qPCR zuerst eingesetzt werden sollte (Abbildung 1C). In der Forschung wird die 16S rDNA-PCR weiterhin zur Identifizierung neuer Bakterienarten, zur Charakterisierung der artspezifischen Pathogenität und als Goldstandard-Assay zum Vergleich bei der Evaluierung neuer Assays eingesetzt werden. Sie wird auch in Kombination mit modernsten Techniken, wie der Sequenzierung der nächsten Generation, eingesetzt. Damit lassen sich komplexe mikrobielle Populationen im Darm, im Stuhl, in der Vagina, in der Plazenta, in der Lunge und in der Umwelt charakterisieren.20 Da die Sequenzierung der nächsten Generation auf der Grundlage der 16S-rDNA-Breitband-PCR immer erschwinglicher und weithin verfügbar wird, haben diese Techniken das Potenzial, eine maßgeschneiderte Therapie zu ermöglichen, wenn unser Verständnis der komplexen Interaktion zwischen uns und unseren mikrobiellen Gemeinschaften zunimmt.21 So hat die Breitband-16S-rDNA-PCR von mikrobiellen Darmgemeinschaften deutliche Veränderungen bei Erkrankungen wie HIV, Frühgeburten und Mangelernährung aufgezeigt.22-24 Bei der Erforschung der potenziellen therapeutischen Möglichkeiten, die sich bei diesen verschiedenen Erkrankungen ergeben, wird die Breitband-16S-rDNA-PCR wahrscheinlich ein Eckpfeiler der weiteren Forschung sein.