Tetramisol (Sigma T1512, eine 10 mg/mL Stammlösung in H2O, verdünnt auf ca. 100 μg/mL in Eiersalzen) Die Zugabe ist optional; dieses Medikament lähmt die Würmer und erleichtert das Schneiden. Schneiden Sie sofort: Wenn die Würmer zu sehr geschrumpft sind, werden sie nicht viele Eier freisetzen. Verwenden Sie jeden Tag eine neue Skalpellklinge, da die Klingen schnell korrodieren. Überschüssiges Tetramisol führt dazu, dass sich in der NaOCl-Lösung ein Niederschlag bildet.
Für eine maximale Ausbeute können mehr Eier freigesetzt werden, indem die geschnittenen Würmer etwa 1 Minute lang mit einem gleichen Volumen der NaOCl-Lösung behandelt werden, die direkt auf den Schnitttropfen gegeben wird. Sobald die Eier freigesetzt sind, fügen Sie das gleiche Volumen EGM hinzu wie das verwendete NaOCl, um eine weitere Schädigung der Eier zu verhindern. Durch diese Behandlung werden Vorkernstadien abgetötet und einzellige Embryonen geschädigt. Die 3-minütige NaOCl-Behandlung ist auch vor der Behandlung mit Chitinase erforderlich, um einen gleichmäßigen Aufschluss zu gewährleisten. Bei Eiern, die sich noch nicht im Zweizellstadium befinden und deren Schale noch einigermaßen durchlässig ist, fügen Sie ein gleiches Volumen EGM hinzu, sobald die Würmer geschnitten werden. Danach können viele die 3-minütige NaOCl- und Chitinase-Behandlung überleben, und einige befinden sich nach der Chitinase-Behandlung und der Entfernung der Vitellinhülle immer noch im Ein-Zell-Stadium, wenn man schnell arbeitet.
Zufriedenstellende Transferpipetten werden aus SMI-Mikropipettor 5- bis 30-μL-Kapillaren (Fisher 21-380-9C) oder World Precision Instruments 4-Zoll-Kapillaren (1B100F-4) durch doppeltes Ziehen über einer sehr kleinen Flamme hergestellt. Dazu wird die Kapillare zunächst erwärmt und leicht gezogen, um einen dünnen Mittelteil zu erzeugen, dann kurz abgekühlt und anschließend wieder leicht erwärmt, während die Kapillare für den letzten Zug unter Spannung gehalten wird. Der ideale Zug ergibt eine Pipette mit einem ausgeprägten Schaft und einem schmalen, sich allmählich verjüngenden Abschnitt von etwa 3/4-1 Zoll. Ein kleiner Gasbrenner kann hergestellt werden, indem man eine große Spritzennadel in einen Korken steckt und eine Schraubklemme am Schlauch anbringt, um den Gasfluss zu regulieren. Alternativ können Pipetten mit gleichbleibender Größe durch Ziehen auf einem automatischen Ziehgerät hergestellt werden. Brechen Sie die Kapillare vor der Verwendung auf die gewünschte Spitze, etwa 100-150 μm (drei- oder vierfacher Eidurchmesser), indem Sie sie zwischen Daumennagel und Fingerspitze einklemmen oder eine Rasierklinge unter einem Seziermikroskop verwenden. Ein Mikroschmiedemikroskop kann bei der Herstellung gleichmäßiger Pipetten helfen, ist aber nicht erforderlich. Halten Sie den Pipettendurchmesser klein, um die Flüssigkeitsübertragung zu minimieren. Wenn Eier an der Innenseite der Pipette haften bleiben, können viele von ihnen durch Spülen mit NaOCl-Lösung oder EGM wieder entfernt werden. Stellen Sie sich darauf ein, dass Sie die Pipetten häufig wechseln müssen, und ziehen Sie vor einer Arbeitssitzung einen guten Vorrat heran.
Wenn der Chitinase-Verdau nicht innerhalb von 8 Minuten funktioniert, funktioniert er wahrscheinlich überhaupt nicht. Die häufigsten Probleme sind das Hypochlorit oder der physiologische Zustand der Würmer (der erste Legetag scheint härtere Eier zu ergeben). Das Hypochlorit sollte eine noch nicht abgelaufene Charge sein, und es wird normalerweise etwa einen Monat vor dem Verfallsdatum schlecht. Bewahren Sie den Vorrat gekühlt in einer dunklen, belüfteten Flasche auf, die fast bis zum Rand gefüllt ist. Mischen Sie ein 3-mL-Röhrchen kurz vor dem Start und bewahren Sie es auf Eis auf; es funktioniert etwa 3 Stunden lang und sollte dann ersetzt werden.
Nach der Enzymbehandlung und insbesondere nach der Permeabilisierung sind die Embryonen ziemlich klebrig und verklumpen; dies kann minimiert werden, indem man jeweils nur einen oder wenige auf einmal pipettiert. Kleine Klumpen lassen sich aufbrechen, indem man sie einige Male mit etwas Kraft aus der Pipette ausstößt.
Permeabilisierungspipetten werden auf die gleiche Weise wie die Transferpipetten von Hand gezogen, wobei Kwik-fil-Injektionskapillaren (1B100F-4 von World Precision Instruments) verwendet werden. Der Innenfaden kann dabei helfen, die Dotterhülle zu durchtrennen. Der ideale Zug ergibt eine lange, allmähliche Verjüngung des Dünnschnitts, so dass er auf den gewünschten Durchmesser geschnitten werden kann. Die Pipetten werden mit einer frischen Skalpellklinge auf Parafilm unter dem Präpariergerät geschnitten. Ein Adapter für die Mundpipette kann mit einem Tygon-Schlauch mit kleinem Durchmesser hergestellt werden, der auf eine an einem Mundrohr befestigte Spritzennadel geschraubt wird. Füllen Sie die Pipettenspitze bis zur größeren Bohrung mit EGM und testen Sie die erste Charge chitinazierter Embryonen; schneiden Sie die Pipettenspitze zurück, wenn sie zu klein ist. Die ideale Größe hängt vom Alter des gewünschten Embryos ab; die sehr frühen Stadien sind zerbrechlicher und benötigen eine etwas größere Bohrung; Embryonen, die größer als acht Zellen sind, lassen sich mit weniger Schaden komprimieren und kommen oft mit intakter Dotterhülle aus den größeren Pipetten. Solche nicht permeabilisierten Embryonen entwickeln sich bis zum Schlüpfen weiter.
Zum Befüllen und Reinigen der Permeabilisierungspipetten wird eine Spritze auf die Mundpipette gesetzt; die eigentliche Permeabilisierung erfolgt durch den Luftdruck im Mund. Pipetten können mehrere Stunden an der Luft stehen, ohne auszutrocknen, da die Bohrung so klein ist, aber wenn sie austrocknen, verstopfen sie schließlich. Bewahren Sie die Pipetten auf (eine gute Pipette ist wertvoll und hält mehrere Wochen), indem Sie die Spitze mehrmals mit destilliertem Wasser spülen und die Pipettenspitze in ein Röhrchen mit sterilem destilliertem Wasser oder 0,1 M HCl hängen, wobei Sie ein Klebeband als „Fahne“ an der Pipette befestigen, damit sie nicht vollständig einsinkt.
Wenn die Pipette richtig eingestellt ist, dauert es nur wenige Minuten, eine Reihe von Embryonen zu permeabilisieren, indem sie einzeln in die Pipette gesaugt und vorsichtig wieder ausgestoßen werden. Je nach Innendurchmesser der Pipette werden sie mehr oder weniger komprimiert herauskommen, sich aber innerhalb weniger Minuten wieder aufrichten. Wenn bei der Permeabilisierung viel Lyse entsteht, war entweder der Aufschluss unvollständig oder die Pipettenbohrung zu klein. Da die Zellmembranen 4-5 Minuten nach Beginn der Zytokinese recht labil sind, kann es vorkommen, dass Embryonen, die während oder kurz nach der Spaltung geteilt werden, lysieren oder Blastomere fusionieren und später eine anormale tetrapolare Spaltung durchlaufen. Eine sehr feine Wimper (ein traditionelles Instrument der Elektronenmikroskopie), die mit Klebstoff auf einem Zahnstocher befestigt ist, ist das beste Werkzeug für eine schnelle manuelle Blastomerentrennung; eine Glasnadel funktioniert auch, bricht aber leicht. Die Wimpern können mit Alkohol und einem Taschentuch gereinigt werden. Blastomere lysieren, wenn sie unmittelbar nach einer Teilung abgetrennt werden; 5-10 Minuten nach der Spaltung ist der beste Zeitpunkt für erfolgreiche Manipulationen, es sei denn, Sie benötigen frühere Trennungen. AB/P1-Trennungen sind am einfachsten. Vierzellige Embryonen können ebenfalls getrennt werden. Um P2 und EMS-Blastomere zu erhalten, kann P1 nach der ersten Teilung und EMS/P2 nach der zweiten Teilung getrennt werden. Die Blastomere der P-Linie lassen sich anhand ihrer relativen Größe und ihrer linearen Anordnung erkennen. Bei geringer Ausbeute können MS, E, P3 und C von den vier Nachkommen eines ursprünglich isolierten P1-Blastomers getrennt werden. Die Identifizierung von Zellen anhand ihrer Größe kann durch die Untersuchung auf unterschiedliche Zellzyklusperioden bestätigt werden.