Synthese und antimikrobielle, resistenzmodulierende Aktivität von 2,4-Dinitrophenylhydrazon-Derivaten als Wirkstoffe gegen einige ESKAPE-Humanpathogene

Abstract

Eine Bibliothek von sechs neuartigen Phenylhydrazonen wurde synthetisiert und auf ihre antimikrobielle und resistenzmodulierende In-vitro-Aktivität gegen eine Reihe von Gram-positiven, Gram-negativen und Pilzarten untersucht. Die Verbindungen wurden in guten Ausbeuten von 60-92 % w/w hergestellt und mit Hilfe von Schmelzpunkt-, UV-Spektroskopie-, Infrarot- und Kernspinresonanztechniken (1H, 13C und DEPT-Q) charakterisiert. Mit Hilfe der Massenspektroskopie wurde die Identität einer der aktivsten Verbindungen, 5, bestätigt. Die Phenylhydrazone zeigten Aktivität gegen alle sechs ausgewählten Mikroorganismen, wobei die minimale Hemmkonzentration (MHK) der aktivsten Verbindungen 1 und 5 bei 138 µM (Klebsiella pneumoniae) bzw. 165 µM (Streptococcus pneumoniae) lag. Verbindung 1 zeigte darüber hinaus eine hohe resistenzmodulierende Aktivität mit 1,078 µM gegen Streptococcus pneumoniae und Klebsiella pneumoniae.

1. Einleitung

Der Welt gehen in den letzten Jahrzehnten aufgrund der zunehmenden Prävalenz multiresistenter Organismen die wirksamen Antibiotika aus. Dies hat zu einer Zunahme resistenter Infektionen geführt, was Wissenschaftler dazu veranlasst, unermüdlich die Möglichkeit der Synthese von Analoga aktiver oder leitender Verbindungen als neuartige antimikrobielle Mittel zur Eindämmung dieser Infektionen und der daraus resultierenden Krankheiten zu erforschen. Infektionskrankheiten sind im Laufe der Jahrhunderte zu einer großen Bedrohung für die Existenz der Menschheit geworden, da sie die Gesellschaft weiterhin stark beeinträchtigen. Krankheitserreger wie Bakterien, Viren, Pilze und Parasiten tauchen immer wieder auf und sind vor allem im 21. Jahrhundert auf dem Vormarsch, obwohl es zahlreiche Versuche gibt, sie einzudämmen. Jährlich sterben etwa 17 Millionen Menschen an Infektionskrankheiten, und es treten mindestens dreißig neue Krankheiten auf. Derzeit kämpft die Welt mit der durch das Coronavirus verursachten Pandemie COVID-19, die innerhalb von drei Monaten weltweit bereits über 25 000 Menschenleben gefordert hat (WHO, 2020). Diese Krankheiten bedrohen die Gesundheit von Millionen von Menschen, zumal es weder ein Heilmittel noch einen Impfstoff gibt. Der zunehmende Trend bei mikrobiellen Infektionen ist weitgehend auf das immerwährende Problem der Antibiotikaresistenz zurückzuführen, die immer mehr zunimmt. Zu den wichtigsten Ursachen für die antimikrobielle Resistenz gehören eine verlängerte Chemotherapie und die Nichteinhaltung von Dosierungsschemata.

Die zunehmende Resistenz gegen Antibiotika hat zu einer steigenden Tendenz von Krankheitserregern wie Methicillin-resistentem Staphylococcus aureus (MRSA), multiresistenter Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB) und multiresistenten Escherichia coli (MDR-Escherichia coli) geführt. Darüber hinaus sind bei der Behandlung nosokomialer Infektionen die ESKAPE-Erreger (Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa und Enterobacter-Arten) von größter Bedeutung. Ihr Vorhandensein bei Infektionen ist eine besorgniserregende Situation im Gesundheitssektor, da die meisten von ihnen gegen viele Antibiotika resistent sind und das Verständnis des Resistenzmechanismus dieser Stämme bei der Entwicklung neuer antimikrobieller Wirkstoffe nützlich ist.

Die Weltgesundheitsorganisation hat deutlich gemacht, dass der Trend der zunehmenden Infektionskrankheiten aufgrund einer Reihe von Faktoren, einschließlich der Land-Stadt-Migration, der Zunahme der Weltbevölkerung, der mikrobiellen Anpassung und des Klimawandels, anhalten würde. Diese Faktoren begünstigen das Auftreten und die Ausbreitung von Krankheitserregern, so dass alle Beteiligten, einschließlich der medizinischen Chemiker, ständig aufgefordert sind, Strategien zur Entdeckung neuer chemotherapeutischer Wirkstoffe zu entwickeln, um die Bedrohung durch die antimikrobielle Resistenz zu überwinden. Resistenzmodulierende Aktivität einer Verbindung ist die Fähigkeit der Verbindung, einen kontrollierenden Einfluss auf die bereits bekannten Standards zu haben, insbesondere in positiver Weise. Aufgrund der zunehmenden Resistenz von Mikroorganismen gegen Antibiotika scheinen Wirkstoffe aus natürlichen oder synthetischen Quellen die Aktivität einiger antimikrobieller Standardwirkstoffe wie Amoxicillin (a), Ciprofloxacin (b) und Fluconazol (c) zu modulieren (Abbildung 1).

(a)

(b)

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Abbildung 1

Chemische Strukturen einiger Standardantibiotika : (a) Amoxicillin; (b) Ciprofloxacin; (c) Fluconazol.

Resistenzmodulierende Aktivitäten von Produkten (sowohl natürliche als auch synthetische) auf Standardantibiotika haben in den letzten Jahren an wissenschaftlichem Interesse gewonnen. Ziel ist es, die antimikrobielle Wirksamkeit zu maximieren, um die mikrobielle Resistenz einzudämmen und somit potenzielle Arzneimittel zu entdecken. Eine wichtige Klasse solcher synthetischer Wirkstoffe mit vielversprechender resistenzmodulierender Wirkung sind Hydrazone. Hydrazone und ihre Analoga besitzen die Azomethinfunktionalität, eine wichtige Gruppe von Verbindungen mit einem breiten Spektrum an biologischen Aktivitäten. Hydrazone wurden aufgrund ihrer vielfältigen pharmakologischen Aktivitäten ausgewählt, wie z. B. krampflösende, entzündungshemmende, antimikrobielle, antiprotozoische und krebsbekämpfende Wirkungen. Sie spielen nicht nur in der Biologie, sondern auch in der Photochemie, der analytischen Chemie und der anorganischen Chemie eine wichtige Rolle. Hydrazone sind mit Ketonen und Aldehyden durch die Substitution von Sauerstoff durch die funktionelle Einheit -NNH2 verwandt. Aufgrund unterschiedlicher Syntheseprotokolle und detaillierter Studien zur Struktur-Wirkungs-Beziehung (SAR) wurden verschiedene Hydrazonderivate entwickelt und als pharmakologisch aktiv für verschiedene Ziele entdeckt. Es wurde festgestellt, dass einige Hydrazonderivate von Isonicotinoyl eine antituberkuläre Wirkung besitzen. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass das Benzoesäurehydrazonderivat 4-Hydroxybenzoesäure-Hydrazid (Nifuroxazid) gegen Darmwürmer aktiv ist, und das Derivat 4-Fluorbenzoesäure-Hydrazid zeigte antibakterielle Aktivität gegen Staphylococcus aureus ATCC 29213 bei 3,13 μg/mL und den anfälligen Mycobacterium tuberculosis-Stamm H37RV ebenfalls bei 3,13 μg/mL. Kürzlich synthetisierte Hydrazone, darunter Nifuroxazid, erwiesen sich als aktiv gegen Mycobacterium tuberculosis Stamm H37RV bei einer minimalen Hemmkonzentration von 0,78-6,25 μg/ml. Ein neuer Wirkstoff, 3,5-Dibenzoylvanillinhydrazon, und Übergangsmetallkomplexe wiesen eine beeindruckende antibakterielle Aktivität auf.

In dieser Studie wurden sechs neuartige Phenylhydrazonderivate erfolgreich durch nukleophile Kondensationsreaktion synthetisiert und ihre antimikrobiellen Aktivitäten und Resistenzmodulationseffekte untersucht.

2. Materialien und Methoden

2.1. Synthese: Allgemeine Materialien und Methoden

Ein Rundkolben (100 mL), der mit einem Magnetrührer ausgestattet war, wurde mit 2,4-Dinitrophenylhydrazin (1 Äq.) in Methanol (10 mL), das in einem Eisbad gehalten wurde, gefüllt. Die resultierende Suspension wurde gerührt und auf 0°C abgekühlt, bevor konzentrierte H2SO4 (98% v/v, 2 mL) tropfenweise zugegeben wurde, was eine blassgelbe Lösung ergab. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wurde ein Aldehyd- oder Ketonderivat (1,04 Äquivalente) in Methanol (5 ml) zugegeben und das Gemisch gerührt, bis sich allmählich ein Niederschlag bildete, der 24 Stunden lang stehen blieb. Der Verlauf der chemischen Reaktionen wurde durch Dünnschichtchromatographie (TLC) mit Hilfe von Aluminiumplatten, die mit Kieselgel (60 GF254) beschichtet waren, intermittierend überwacht. Die Platten wurden unter UV-Licht bei 254 nm und 366 nm sichtbar gemacht und anschließend zur Bestätigung der Identität mit Anisaldehyd besprüht. Das Rohprodukt wurde durch Saugfiltration filtriert und aus heißem absolutem Ethanol (96% v/v) umkristallisiert. Das feste Produkt wurde durch Saugfiltration erhalten, getrocknet und bei Raumtemperatur gelagert.

Die Strukturen der synthetisierten Verbindungen wurden durch Schmelzpunktbestimmungen, Massenspektroskopie, 1D-NMR (Proton und Kohlenstoff-13) und 2D-NMR (DEPT-Q)-Spektroskopie mit Unterstützung von Infrarot (IR)- und Ultraviolett-Vis-Spektroskopie (UV-Vis)-Techniken bestimmt.

2.1.1. 1-(2,4-Dinitrophenyl)-2-(diphenylmethylen)-hydrazin

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,50 g, 2,74 mmol, 1 Äq.) in Gegenwart von Benzophenon (0,53 g, 1,04 Äq., 2,64 mmol) ergab das Rohprodukt, das durch Umkristallisation aus heißem Ethanol gereinigt wurde, um das Produkt (0,84 g, 85%) als hellorangen Feststoff zu erhalten. (Pet. Ether 70%: EtOAc 30%): 0.90. Mpt: 141-143°C; UV-V ist (MeOH): 382 nm. Infrarot (unverdünnt) υmax cm-1: 3382 (OH), 3286 (NH), 1586 (C = CH), 848, 614 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3): 11.24 (1H, H-C1, s, NH), 9.09-9.10 (1H, H-C3, s, ArH), 8.41 (1H, H-C5, d, J = 2.4, ArH), 8.37-8.38 (1H, H-C6, m, ArH), 7.66-7.72 (5H, H-C4′, H-C5′, H-C6′, H-C5′, H-C3′, m, ArH), 7.35 (3H, H-C6″, H-C5″, H-C4″, m, ArH), 7.57 (2H, H-C5′, H-C3′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz; CDCl3) 155.7, 145.1, 136.5, 131.9, 130.5, 130.4, 130.1, 129.9, 128.6, 128.2, 127.9, 123.4, 116.6 ppm.

2.1.2. 1-Benzyliden-2-(2,4-dinitrophenyl) Hydrazin

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,90 g, 4,53 mmol, 1 eq.) in Gegenwart von Benzaldehyd (0,50 g, 1,04 eq., 4,71 mmol) ergab das Rohprodukt, das durch Umkristallisation aus heißem Ethanol gereinigt wurde, um das Produkt (1,01 g, 78%) als gelben Feststoff zu erhalten. (Pet. Ether 70%: EtOAc 30%): 0.83. Mpt: 178-180°C; UV-V ist (MeOH): 224 nm und 378 nm. Infrarot (unverdünnt) υmax cm-1: 3337 (OH), 3283 (NH), 3100 (C = CH), 1618, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.24 (1H, H-C1, s, NH), 9.09 (1H, H-C3, s, ArH), 8.30-8.31 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8.05 (1H, H-C5, m, ArH), 8.02 (1H, H-C6, m, ArH), 7.41-7.69 (2H, H-C2′, H-C6′, m, ArH), 7.40 (1H, H-C4′, m, ArH), 7.39 (2H, H-C3′, H-C5′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 147.9, 145.8, 144.9, 144.7, 131.0, 130.0, 129.0, 127.6, 123.5, 116.8 ppm.

2.1.3. 3-(2-2-(4-Dinitrophenyl) Hydrazono) Methylphenol

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0.78 g, 3.93 mmol, 1 eq.) in Gegenwart von m-Hydroxybenzaldehyd (0.50 g, 1.04 eq., 4,09 mmol) ergab das Rohprodukt, das durch Umkristallisation aus heißem Ethanol gereinigt wurde, um das Produkt (0,76 g, 64 %) als dunkelroten Feststoff zu erhalten. (Pet. Ether 70%: EtOAc 30%): 0.74. Mpt: 277-280°C. UV-Vis (MeOH): 392 nm. Infrarot (unverdünnt) υmax cm-1: 3420 (OH), 3257 (NH), 3116 (C = CH), 1607, 1584 (ArC = C). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.56 (1H, H-C1, s, NH), 10.04 (1H, H-C2′, s, ArOH), 8.88 (1H, H-C3, s, ArH), 8.86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8.35-8.37 (1H H-C5, d, J = 8.0, ArH), 8.08-8.34 (1H, H-C6), d, J = 12.0, ArH), 8.05 (1H, H-C5′, m, ArH), 7.66 (1H, H-C1′, s, ArH), 7.14 (1H, H-C4′, m, ArH), 6.87-6.89 (1H (H-C3′, m, ArH). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 160.5, 150.5, 144.9, 137.1, 130.2, 129.8, 129.5, 125.2, 123.6, 117.1, 116.4 ppm.

2.1.4. 4-(2-(2,4-Dinitrophenyl) Hydrazono) Methyl)-2-methoxyphenol

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,78 g, 3,93 mmol, 1 eq.) in Gegenwart von 4-Hydroxy-3-methoxybenzaldehyd (Vanillin) (0,50 g, 1,04 eq., 4,09 mmol) ergab das Rohprodukt, das durch Umkristallisation aus heißem Ethanol gereinigt wurde, um das Produkt (0,91 g, 70%) als hellroten Feststoff zu erhalten. (Pet. Ether 70%: EtOAc 30%): 0.66. Mpt: 270-273°C. UV-Vis (MeOH): 218 nm und 394 nm. Infrarot (unverdünnt) υmax cm-1: 3363 (OH), 3274 (NH), 3111 (C = CH), 1605 (ArC = C), 699 (ArH). 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.58 (1H, s, NH), 10.11 (1H, H-C4′, s, ArOH), 9.94 (1H, H-C3, s, ArH), 8.87 (1H, H-C5, s, ArH), 8.86 (1H, H-C7, s, N = CH), 8.35 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7.97 (1H, H-C2′, d, J = 4.0, ArH), 7.66-7.76 (1H, H-C6′, d, J = 8.0, ArH), 6.38-6.35 (1H, H-C5′, d, J = 12.0, ArH), (3H, H-C4′, Ar-OCH3). 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 150.7, 150.2, 148.6, 144.9, 137.1, 130.2, 125.6, 123.6, 123.1, 117.2, 116.1, 110.3, 56.2 ppm.

2.1.5. (Z)-2-(2, 4-Dinitrophenyl) Hydrazono) Methylphenol

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,78 g, 3,93 mmol, 1 Äq.) in Gegenwart von Salicylaldehyd (0,50 g, 4,09 mmol, 1,04 Äq.) ergab das Rohprodukt, das durch Umkristallisation aus heißem Ethanol gereinigt wurde, um das Produkt (1,09 g, 92%) als leuchtend orangen Feststoff zu erhalten. (Pet. Ether 70%: EtOAc 30%): 0.84. Mpt: 176-180°C; UV-Vis (MeOH): 386 nm. Infrarot (rein) υmax (cm-1): 3334 (OH), 3267 (NH), 3059 (C = CH), 1583 (ArC = C), 759 (ArH) 1H NMR (400 MHz, CDCl3) 11.25 (1H, H-C3′, s, ArOH), 9.98 (1H (C1), s, NH), 9.11 (1H H-C3, s, ArH), 8.34-8.36 (1H, H-C1′, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C5, d, J = 4.0, ArH), 7.61-7.58 (1H, H-C6, d, J = 4.0, ArH), 7.31 (1H, H-C6′, m, ArH), 7.25 (1H, H-C4′, m, ArH), 7.24 (1H, H-C7, m, ArH), 6.95 (1H, H-C5′, m, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, CDCl3) 157.9, 151.3, 132.9, 131.4, 130.6, 123.7, 120.3, 117.2, 116.9, 115.3 ppm. HRMS (ESI): m/z berechnet für + C13H10N4O5: 302.2400, gefunden: 301.0000.

2.1.6. 4-(2-(2, 4-Dinitrophenylhydrazono) Methyl) Benzol-1, 3-diol

2, 4-Dinitrophenylhydrazin (0,69 g, 3,48 mmol, 1 eq.) in Gegenwart von 2, 4-Dihydroxybenzaldehyd (0,50 g, 1,04 eq., 3,62 mmol) ergab das Rohprodukt, das durch Umkristallisation aus heißem Ethanol gereinigt wurde, um das Produkt (0,66 g, 2,07 mmol, 60%) als dunkelroten Feststoff zu erhalten. (Pet. Ether 70%: EtOAc 30%): 0.51. Mpt: 270-274°C; UV-Vis (MeOH): 403 nm. Infrarot (unverdünnt) υmax (cm-1): 3364 (OH), 3094 (C = CH), 1612, 1584 (ArC = C) 592 (ArH). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) 11.58 (1H, H-C3′, s, ArOH), 10.11 (1H, H-C1, s, NH), 9.94 (1H, H-C5′, s, ArOH), 8.87 (1H, H-C3, s, ArH), 8.86 (1H, s, N = CH), 8.33 (1H, H-C4′, s, ArH), 8.36 (1H, H-C5, d, J = 12.0, ArH), 7.95-7.97 (1H, H-C6, d, J = 8.0, ArH), 7.54 (1H, H-C7, m, ArH), 6.38 (1H, H-C6′, d, J = 8.0, ArH) ppm. 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) 161.8, 159.1, 148.2, 144.6, 136.7, 130.1, 129.3, 128.8, 123.6, 116.9, 112.0, 108.7, 102.1 ppm.

2.2. Antimikrobielle Bewertung der Verbindungen

2.2.1. Quelle der Testorganismen

Reine Kulturen von Staphylococcus aureus (SA) (ATCC 25923), Escherichia coli (EC) (ATCC 25922) und Pseudomonas aeruginosa (PA) (ATCC 27853) wurden von der Mikrobiologieabteilung der Abteilung für Pharmazie, Fakultät für Pharmazie und pharmazeutische Wissenschaften, Kwame Nkrumah University of Science and Technology (KNUST), Kumasi, bezogen. Bei Klebsiella pneumoniae (KP), Candida albicans (CA) und Streptococcus pneumoniae (SP) handelte es sich jedoch um klinische Stämme, die aus dem Komfo Anokye Teaching Hospital, Kumasi, stammten und in der Abteilung für Pharmazie der KNUST kultiviert wurden.

2.2.2. Bestimmung der minimalen Hemmkonzentration (MHK)

Zur Bestimmung der minimalen Hemmkonzentrationen (MHK) der Hydrazonderivate und der Referenzarzneimittel Ciprofloxacin und Fluconazol wurde die Mikrobrühe-Verdünnungsmethode verwendet. 96-Well-Mikrotiterplatten wurden mit 125 µl doppelt starker Nährstoffbrühe gefüllt und verschiedene Konzentrationen der Hydrazonderivate hinzugefügt. Die Referenzarzneimittel im Bereich 12.5 µL/mL bis 40 µL/mL wurden in gleicher Weise behandelt. Ein Aliquot von 1 × 105 cfu/mL Testorganismen wurde in jede Vertiefung gegeben. Die Kontrollplatte wurde nur mit Nährbouillon und Testorganismen gefüllt. Die Test- und Kontrollplatten wurden bei 37 °C bebrütet (24 Stunden für Bakterien und 48 Stunden für Pilze). Danach wurden 20 µl von 1,25 mg/ml 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) in jede Vertiefung gegeben. Nach 20 Minuten wurde eine Violettfärbung beobachtet, die auf Wachstum hinweist. Die Mindestkonzentrationen der Hydrazonderivate und der Referenzarzneimittel, die keine Farbveränderung in den Vertiefungen zeigten, wurden als MHK-Werte angesehen. Die Bestimmungen wurden in Wiederholungen durchgeführt.

2.2.3. Resistenzmodulationsstudien

Für die Modulationsstudien wurden die 96-Well-Platten mit 125 µL doppelt starker Nährbouillon gefüllt und das gleiche Volumen an 40 µL Phenylhydrazonen zugegeben. Unterschiedliche Konzentrationen in den Bereichen 50 µL/ml bis 7,812 µL/ml und 15,625 µL/ml bis 7,812 µL/ml von Ciprofloxacin bzw. Fluconazol wurden hinzugefügt. In jede Vertiefung wurden 25 µL mit 1 × 105 cfu der Testorganismen gegeben, und die Platten wurden bei 37°C bebrütet (24 bzw. 48 Stunden lang für Bakterien und Pilze); danach wurden 20 µL MTT in jede Vertiefung gegeben. Das Auftreten einer Farbveränderung von trüben Vertiefungen zu violett wurde aufgezeichnet und mit den MHKs der Referenzmedikamente verglichen. Die Bestimmungen wurden in Wiederholungen durchgeführt.

3. Ergebnisse und Diskussion

3.1. Strukturanalyse der Phenylhydrazone

Der für die Synthese der Verbindungen verwendete Syntheseweg folgte der Standardkondensationsreaktion zwischen Aldehyden oder Ketonen und Hydrazinen, wobei die kommerzielle Verfügbarkeit der Bausteine berücksichtigt wurde (Schema 1). Ein retrosynthetischer Trennungsansatz ermöglichte es uns, verschiedene Aldehyde und ein Keton als wichtige Zwischenprodukte für die Synthese der gewünschten Verbindungen zu identifizieren. Der Prozess beinhaltet einen geschwindigkeitsbestimmenden aromatischen nukleophilen Angriff von 2,4-Dinitrophenylhydrazin auf das Carbonyl in einer angesäuerten Lösung. Anschließend wurde das reaktive Zwischenprodukt dehydratisiert, um das Endprodukt, das 2,4-Dinitrophenylhydrazonderivat, zu erhalten.

Die Daten für die Syntheseverfahren sind im experimentellen Teil enthalten und werden in der Reihenfolge interpretiert: Schmelzpunktbereich (Mpt.) in Grad Celsius (°C), Wellenlänge des Absorptionsmaximums aus dem ultraviolett-sichtbaren Spektrum, Infrarotspektrum, 1H NMR , 13C NMR und HRMS als Bestätigungswerkzeug für SA5 (Verbindung 5) (eine der aktivsten Verbindungen).

3.1.1. UV-Vis-Spektroskopie

Die Spektren für alle sechs Verbindungen wurden sowohl im ultravioletten als auch im sichtbaren Wellenlängenbereich (200-800 nm) bestimmt, um BP1 zu bestätigen (siehe ergänzende Informationen), wobei Methanol als Blindprobe verwendet wurde. Die Absorptionsbanden bei 203 nm und 403 nm, die in den elektronischen Spektren der synthetisierten Phenylhydrazone erhalten wurden, können auf Übergänge zurückgeführt werden, die von den verschiedenen Substituenten-Auxochromen an den Phenylhydrazonen stammen. Es ist bekannt, dass Phenylhydrazone bei verschiedenen Wellenlängen im UV-Sichtbereich absorbieren.

So zeigte beispielsweise die Verbindung BP1, wenn sie in Methanol gelöst und im UV-Sichtbereich untersucht wurde, eine Absorption bei 203 nm, 314 nm und 382 nm, was auf eine umfangreiche Konjugation in den Phenylhydrazonen nach der Kopplung von Benzophenon und 2,4-Dinitrophenylhydrazin zurückgeführt werden könnte. Die Verbindung BP1 zeigte jedoch ein Absorptionsmaximum bei 382 nm, was auf eine verstärkte Konjugation zurückgeführt werden könnte. Auch die Verbindungen BA2, MHB3, VL4, SA5 und DHB6 zeigten ein Absorptionsmaximum bei 378 nm, 392 nm, 394 nm, 386 nm bzw. 403 nm, wie in den begleitenden Informationen angegeben.

Die umfangreiche Konjugation kann auf das Vorhandensein von Chromophoren in den Phenylhydrazonen zurückgeführt werden, zu denen BP1 (zwei aromatische Ringchromophore), MHB3 (meta-Hydroxy-Auxochrom), VL4 (ein Hydroxy- und Methoxy-Auxochrom), SA5 (ortho-Hydroxy-Auxochrom) und DHB6 (zwei Hydroxy-Auxochrome) gehören. Dies deutet darauf hin, dass die Hydrazone mit Auxochromen und zusätzlichem Chromophor eine erweiterte Konjugation aufweisen, die zu einer Verschiebung nach rechts führt (bathochrome Verschiebung).

3.1.2. Infrarotspektroskopie

Das Infrarotspektrum gibt eine Vorstellung von den funktionellen Gruppen in einer Verbindung. Aus dem Infrarotspektrum von Verbindung 5 als Probe geht hervor, dass das Vorhandensein einer breiten Bande, die sich von ca. 3300 cm-1 ausdehnt und in den aliphatischen CH-Bereich von ca. 3000 cm-1 abfällt, auf das Vorhandensein einer funktionellen Hydroxygruppe hinweist, in diesem Fall die eines Phenols, wie in den begleitenden Informationen beschrieben.

Aus dem IR-Spektrum (ergänzende Informationen) ging auch hervor, dass Verbindungen wie MHB3, VL4, SA5 und DHB6 einen starken Peak ihrer C = C-Streckbande im Bereich von 1138-1620 cm-1 aufwiesen, verglichen mit BP1 und BA2, die keine Hydroxyfunktion haben, wie in Tabelle 1 gezeigt. Das Vorhandensein von C = N, das durch die Kondensationsreaktion zwischen dem Hydrazin und den Carbonylen gebildet wird, wurde durch aromatische sp2-hybridisierte Kohlenstoffe (C = C) im Benzol überlagert, die je nach Substituentenanhängen bei 1138-1640 cm-1 schwingen. Da die C = N-Schwingungsfrequenzen in den Bereich von 1580-1600 cm-1 fallen, können ihre Banden in Gegenwart ihrer aromatischen C = C-Gegenstücke nicht klar unterschieden werden, wie aus den experimentellen Daten hervorgeht.

3.1.3. Kernspinresonanz (NMR)-Spektroskopie

NMR-Bestimmungen wurden für alle sechs synthetisierten Phenylhydrazone unter Verwendung einer eindimensionalen (1D) NMR-Technik (1H und 13C) und einer zweidimensionalen NMR-Technik, distortionless enhancement by polarization transfer for quaternary carbons (DEPT-Q), durchgeführt. Diese Daten werden den einzelnen Verbindungen im experimentellen Teil zugeordnet. Die Strukturen wurden mit 1H-NMR-, 13C-NMR- und DEPT-Q-Spektraldaten bestätigt, wie in den ergänzenden Informationen für die Verbindungen BP1, BA2, MHB3, VL4, SA5 und DHB6 dargestellt. Die chemische Verschiebung von DHB6 (Verbindung 6) (Abbildung 2, Tabelle 1) und die Protonen-NMR-Daten (ergänzende Informationen) zeigen, dass das Hydroxy-Proton mit einem Singulett-Signal weit im unteren Bereich der Resonanz liegt. Es resonierte weiter unten im Feld als das sekundäre Aminproton, da der elektronegative Sauerstoff eine stärkere Abschirmwirkung ausübt. Diese chemische Verschiebung war etwas höher als die der Hydroxylgruppe (9,94 ppm), da erstere näher an der chemischen Umgebung des elektronegativen Stickstoffatoms in der Iminbindung liegt. Daher folgte auf das erste Hydroxy-Singlet-Signal bei 11,54 ppm ein Singlet-Signal des sekundären Aminoprotons bei 10,11 ppm aufgrund der Elektronegativität der Stickstoffgruppe vor dem anderen Hydroxysignal. Das aromatische Proton, das zwischen zwei elektronegativen Nitrogruppen liegt, war das nächste Signal, das bei 8,86 ppm im unteren Bereich mitschwang. Es folgte das Proton in der Nähe der tertiären Aminogruppe. Die tertiäre Aminogruppe, die an das Iminproton gebunden ist, verursachte eine Abschirmung und eine Resonanz der Iminprotonen im unteren Feld bei 8,86 ppm mit einem Singulett-Signal. Das einsame Proton, das der Nitrogruppe in para-Position am nächsten liegt, war das nächste Signal mit einem Dublett-Peak bei 7,95-7,97 ppm. Das andere einsame Proton, das der weniger elektronegativen sekundären Aminogruppe am nächsten liegt, lieferte ebenfalls ein Doppelsignal bei 7,64-7,66 ppm. Die beiden anderen einsamen Protonen (eines zwischen dem Diol und das andere ortho zur Iminbindung) ergaben ein Multiplettsignal bei 7,52-7,54 ppm, während das Proton, das der para-Hydroxygruppe am nächsten liegt und zwei Kohlenstoffbindungen von der Imingruppe entfernt ist, ein Dublettsignal bei 6.38 ppm.

Abbildung 2

Chemische Struktur von DBH6 (Verbindung 6).

DEPT-Q wird zur Unterscheidung der primären, sekundären, tertiären und quaternären Kohlenstoffe verwendet. In DEPT-Q erscheinen die Methyl- (CH3) und Methin- (CH) Signale oben in der positiven Phase, während die Methylen- (CH2) und quaternären Signale unten in der negativen Phase erscheinen. Das DEPT-Q-Spektrum von DHB6 (ergänzende Informationen) zeigt das Vorhandensein von aufwärts gerichteten Kohlenstoffsignalen, die in diesem Fall nur sechs Methinkohlenstoffe repräsentieren, die bei 161,8, 159,1, 148,2, 136,7, 130,1 und 112,0 auftreten und die aromatischen Methinkohlenstoffe und sieben quaternäre Kohlenstoffe bestätigen, die bei 148,2, 130,1, 129,2, 123,6, 116,9, 108,7 und 102,9 auftreten. Die DEPT-Q für die anderen Verbindungen sind in den zusätzlichen Informationen zu finden.

3.1.4. Massenspektroskopie

Massenspektroskopie wird zur Bestimmung des genauen Molekulargewichts und der Fragmentierung von Verbindungen unter Verwendung von Ionisierungstechniken verwendet. Die Verbindung SA5 Phenylhydrazon war eine der aktivsten Verbindungen nach der antimikrobiellen Bewertung. Aus dem Massenspektrum der Elektrospray-Ionisierung (ESI) ergab sich im negativen Modus ein Molekül-Ionen-Peak von 301,0000 (M-H+), der die tatsächliche Masse mit einem Toleranzbereich von 0,24 (0,41 %) gegenüber der theoretischen Masse von 302,2400 darstellt. Dies bestätigte das Molekulargewicht der Verbindung SA5.

Die Massenspektroskopie wurde verwendet, um das Molekulargewicht einer der aktivsten Verbindungen zu bestätigen und wurde daher nicht auf die anderen angewendet.

4. Antimikrobielle Bewertung

4.1. Minimale Hemmkonzentrationen (MHK)

Die minimale Hemmkonzentration (MHK) ist die geringste Konzentration eines antimikrobiellen Mittels, die das sichtbare Wachstum des Erregers nach 24 Stunden (Bakterien) und 48 Stunden (Pilze) Inkubation hemmt. Die MHKs der Phenylhydrazone und zweier Standardantibiotika (Ciprofloxacin und Fluconazol) wurden mit dem Mikrobrühe-Verdünnungstest gegen eine Gruppe von sechs pathogenen Mikroorganismen ermittelt: Gram-negative, Gram-positive und C. albicans (Pilz, klinischer Stamm).

Alle Verbindungen zeigten eine schwache antimikrobielle Aktivität gegen die Testorganismen bei den in Tabelle 2 angegebenen Testkonzentrationen. BP1 zeigte die höchste antimikrobielle Aktivität unter den sechs Verbindungen gegen die ausgewählten Testorganismen. BA2 hatte jedoch die geringste antimikrobielle Aktivität mit einer MHK von 699 µM gegen alle Testorganismen. MHB3 hatte eine MHK von 562 µM gegen C. albicans und 662 µM und mehr gegen die übrigen Testorganismen. VL4 wies eine MHK von 602 µM gegen alle Testorganismen außer S. pneumoniae (MHK = 300 µM) auf. Die MHKs von SA5 gegen S. pneumoniae und K. pneumoniae lagen bei 165 µM bzw. 331 µM, während es gegen S. aureus, E. coli, P. aeruginosa und C. albicans eine höhere MHK von 662 µM aufwies. DHB6 zeigte Aktivität gegen S. pneumoniae, K. pneumoniae und C. albicans mit einer MHK von 314 µM, während es für S. aureus, E. coli und P. aeruginosa eine MHK von 628 µM und mehr aufwies. Als antibakterielles Referenzarzneimittel wurde Ciprofloxacin verwendet, und die MHKs lagen bei 2,36 µM gegen P. aeruginosa, S. pneumoniae und K. pneumoniae, während 4,72 µM gegen S. aureus und E. coli festgestellt wurden. Das verwendete Referenzantimykotikum war Fluconazol, und die MHK betrug 327 µM gegen C. albicans. Die MHK der Phenylhydrazone gegen die beiden gramnegativen Organismen reichte von 552 µM bis 699 µM, während der Standard Ciprofloxacin bei 4,72 bzw. 2,36 µM lag (Tabelle 2).

4.2. Resistenzmodulationsaktivität

Die Tendenz der Phenylhydrazone bei Sub-MICs, die Aktivitäten einiger kommerzieller Antibiotika gegen bekannte resistente Stämme zu verbessern, wurde durch den Resistenzmodulationstest untersucht. Aus den Tabellen 2 und 3 geht hervor, dass BP1 (Verbindung 1) mit einer Sub-MIC von 50 µM gegen S. pneumoniae die MIC von Ciprofloxacin von 2,36 auf 1 senkte.078 µM, was einer Senkung der MHK von Ciprofloxacin um 54,32 % entspricht. BP1 verbesserte auch die Leistung von Ciprofloxacin bei einer MHK von 50 µM gegen K. pneumoniae von 2,36 µM auf 1,078 µM, was einer Senkung der MHK der Antibiotika um 54,32 % entspricht. BP1 wiederum modulierte die Aktivität von Fluconazol gegen C. albicans von 327 auf 2,156 µM, was einer Senkung der MHK von Fluconazol um 99,34 % entspricht. In ähnlicher Weise verbesserte BA2 die Aktivität von Ciprofloxacin gegen S. pneumoniae und reduzierte die MHK von Ciprofloxacin von 2,36 auf 1,36 µM, was einer Verringerung um 42,37% entspricht. Darüber hinaus modulierte BA2 auch die Aktivität von Fluconazol bei einer MHK von 50 µM gegen C. albicans und bewirkte eine Verringerung der MHK von 327 auf 1,23 µM, was einer Verringerung der MHK um 99,6% entspricht.

MHB3 modulierte die Aktivität von Ciprofloxacin gegen S. pneumoniae und Klebsiella pneumoniae und bewirkte eine Senkung der MHK der Antibiotika von 2,36 auf 1,29 µM. Dieser Rückgang der MHK bedeutet eine Verringerung um 45,33 %. MHB3 modulierte auch die Aktivität von Fluconazol bei einer MHK von 50 µM gegen Candida albicans und senkte die MHK von 327 µM auf 5,109, was einer maximalen Reduktion von 98,43% entspricht. VL4 verbesserte die Leistung von Ciprofloxacin bei einer Sub-MIC von 50 µM gegen S. pneumoniae und K. pneumoniae. Die MHK des Antibiotikums sank in beiden Fällen von 2,36 auf 1,176 µM. Dieser Rückgang der MHK entspricht einer Verringerung um 50,17 %. VL4 modulierte ebenfalls die Leistung von Fluconazol bei einer MHK von 50 µM gegen C. albicans und senkte die MHK von 327 µM auf 1,176 µM, was eine maximale Reduktion von 99,64% bedeutete.

Zusätzlich modulierte Verbindung 5 (SA5) die Aktivität von Ciprofloxacin bei einer MHK von 50 µM gegen S. pneumoniae und K. pneumoniae. Die MHK wurde in beiden Fällen von 2,36 auf 1,29 µM gesenkt, was einer Reduzierung um 45,34 % entspricht. SA5 modulierte wiederum die Leistung von Fluconazol bei einer MHK von 50 µM gegen C. albicans und senkte dessen MHK von 327 auf 1,29 µM, was eine gute Reduktion von 99,61% bedeutet. DHB6 (Verbindung 6) modulierte auch die Aktivität von Ciprofloxacin bei einer MHK von 50 µM gegen S. pneumoniae und K. pneumoniae und senkte die MHK in beiden Fällen von 2,36 auf 1,23 µM, was einer Reduzierung der MHK um 47,88% entspricht. DHB6 modulierte auch die Aktivität von Fluconazol bei einer Sub-MIC von 50 µM gegen C. albicans und senkte dessen MIC von 327 µM auf 1,23 µM, was einer 99,62%igen Reduzierung der MIC entspricht. SA5 und BP1 waren besser als die anderen vier Phenylhydrazone bei der Resistenzmodulation zusammen mit Ciprofloxacin, das eine MHK von 2,58 µM gegen P. aeruginosa hatte, gefolgt von BP1 (17,2 µM). Das Vorhandensein einer ortho-Hydroxygruppe in SA5 und einer aromatischen Ketongruppe könnte also für die resistenzmodulierende Aktivität in Kombination mit Ciprofloxacin gegen gramnegative P. aeruginosa und E. coli wesentlich sein. Auch das Vorhandensein einer Meta-Hydroxygruppe (MHB3), einer Hydroxy- und Methoxygruppe (VL4) und das Fehlen eines Substituenten am Benzaldehydteil von BA2 verbesserten die Aktivität und könnten für die künftige Arzneimittelentwicklung in Betracht gezogen werden. K. pneumoniae, das andere gramnegative Gegenstück, das schwere Infektionen verursacht, war mit 138 bis 699 µM empfindlicher gegenüber den Phenylhydrazonen. Durch die Kombination subinhibitorischer Konzentrationen der Phenylhydrazone mit Ciprofloxacin wurde die Resistenzbarriere von K. pneumoniae gesenkt, so dass die MHK von 5,46 µM auf 1,078 gesenkt werden konnte, ein Trend, der beeindruckender ist als der von P. aeruginosa und E. coli.

Die Phenylhydrazone hatten eine ähnliche Aktivität gegen die Gram-positiven Organismen, die von 87,3 bis 699 µM reichte, was auch für die resistenten Eigenschaften von Staphylococcus aureus und Streptococcus pneumoniae spricht.

5. Schlussfolgerung

Eine Bibliothek von sechs neuen Phenylhydrazonen wurde erfolgreich synthetisiert und charakterisiert: 1-(2, 4-Dinitrophenyl)-2-(diphenylmethylen)hydrazin , 1-Benzyliden-2-(2, 4-dinitrophenyl)hydrazin , 3-(2-2-(4-dinitrophenyl)hydrazono)methylphenol, 4-(2-(2, 4-Dinitrophenyl)hydrazono)methyl)-2-methoxyphenol , (Z)-2-(2, 4-Dinitrophenyl)hydrazono)methylphenol , und 4-(2-(2, 4-Dinitrophenyl)hydrazono)methyl)benzol-1,3-diol.

Im Rahmen der zukünftigen Entwicklung und Optimierung von Arzneimitteln können die Phenylhydrazone aufgrund ihrer synthetischen Machbarkeit und guten Ausbeute als strukturelle Grundgerüste in Betracht gezogen werden. Die Verbindungen wiesen schwache antimikrobielle Eigenschaften auf, zeigten aber eine starke widerstandsmodulierende Wirkung, wenn sie mit den Standardmedikamenten kombiniert wurden. Die Aktivitäten der Standardmedikamente verbesserten sich signifikant mit einer guten Reduzierung der MIC-Werte.

Abkürzungen

Datenverfügbarkeit

Daten der Forschung sind in den Archiven der Abteilung für Pharmazeutische Chemie, Fakultät für Pharmazie, Kwame Nkrumah University of Science and Technology verfügbar.

Interessenkonflikte

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte in Bezug auf die Veröffentlichung dieser Arbeit gibt.

Beiträge der Autoren

A.A., A.B., I.A., Y.D.B., C.D.K.A. und B.K.H. konzipierten die Forschungsarbeit und verfassten das Manuskript. C.D. K.A., A.B. und A.A. entwarfen und führten die Synthese der Verbindungen durch. C.D.K.A., A.A. und I.A. entwickelten den konzeptionellen Rahmen und verfassten das Manuskript. C.D.K.A. und B.K.H. interpretierten die spektralen Ergebnisse und führten die Strukturaufklärung durch. Y.D.B. und A.A. führten den antimikrobiellen In-vitro-Test durch und lieferten die experimentellen Daten und die Interpretation der Ergebnisse.

Danksagungen

Die Autoren sind allen Mitarbeitern und Technikern der Abteilung für Pharmazeutische Chemie, Fakultät für Pharmazie, KNUST, Kumasi, Ghana, für ihre Unterstützung sehr dankbar. Die Autoren sind Herrn Francis Amankwah vom Department of Pharmaceutics (Microbiology Section), KNUST, für die technische Unterstützung sehr dankbar.

Supplementary Materials

Die ergänzende Datei enthält alle Spektren. (Ergänzende Materialien)