Die Differenzialzentrifugation ist eine Methode zur Trennung der verschiedenen Bestandteile einer Zelle auf der Grundlage ihrer Masse. Zunächst wird die Zellmembran mit Hilfe eines Homogenisators aufgerissen, um die Bestandteile der Zelle freizusetzen. Das entstandene Gemisch wird als Homogenat bezeichnet. Das Homogenat wird zentrifugiert, um ein Pellet zu erhalten, das die dichtesten Organellen enthält. Die dichtesten Verbindungen bilden bei niedrigeren Zentrifugationsgeschwindigkeiten ein Pellet, während die weniger dichten Verbindungen wahrscheinlich in dem flüssigen Überstand über dem Pellet verbleiben. Der Überstand kann jedes Mal mit höherer Geschwindigkeit zentrifugiert werden, um die weniger dichten Organellen zu erhalten. Durch eine schrittweise Zentrifugation, bei der die Zentrifugationsgeschwindigkeit jedes Mal erhöht wird, lassen sich die Bestandteile nach ihrer Masse trennen. Nach dem ersten Zentrifugationsschritt findet man am ehesten den recht dichten Zellkern, gefolgt von den Mitochondrien, dann kleinere Organellen und schließlich das Zytoplasma, das lösliche Proteine enthalten kann.
Bei der Gleichgewichtssedimentation wird ein Gradient einer Lösung verwendet, um die Teilchen auf der Grundlage ihrer individuellen Dichten (Masse/Volumen) zu trennen. Ein entscheidender Aspekt dieser Art der Sedimentation ist, dass sie völlig unabhängig von der Form des Moleküls ist. Sie wird zur Reinigung der Differentialzentrifugation verwendet. Es wird eine Lösung hergestellt, bei der sich der dichteste Teil des Gradienten am Boden befindet. Die zu trennenden Partikel werden dann in den Gradienten gegeben und zentrifugiert. Jedes Teilchen bewegt sich weiter, bis es eine Umgebung mit vergleichbarer Dichte erreicht. Ein solcher Dichtegradient kann kontinuierlich oder inkrementell hergestellt werden. Bei der Verwendung von Saccharose zur Herstellung von Dichtegradienten kann man z. B. eine Lösung mit 40 % Saccharose vorsichtig auf eine Schicht mit 45 % Saccharose aufschwimmen lassen und darüber weitere Schichten mit geringerer Dichte hinzufügen. Das Homogenat, das in einem verdünnten Puffer zubereitet und kurz zentrifugiert wurde, um Gewebe und ungebrochene Zellen zu entfernen, wird dann aufgeschichtet. Nach einer Zentrifugation von typischerweise einer Stunde bei etwa 100.000 x g lassen sich von einer Schicht zur nächsten Scheiben mit zellulären Bestandteilen beobachten, die sich aufgrund der Dichteänderung befinden. Durch sorgfältige Anpassung der Schichtdichten an den Zelltyp können spezifische zelluläre Komponenten angereichert werden.
Das Sedimentationsgleichgewicht ist sehr nützlich, da sich kein Pellet bildet. Die Rotationsgeschwindigkeit erzeugt genügend Kraft, damit das Protein den Rotor verlässt, aber es wird nicht zu einem Pellet kondensiert. Dies liegt daran, dass ein Konzentrationsgefälle des Proteins entsteht. Die Diffusion wirkt der Entstehung des Gradienten entgegen, und nach einer gewissen Zeit ist ein perfektes Gleichgewicht zwischen Sedimentation und Diffusion erreicht.
Das Sedimentationsgleichgewicht ist auch praktisch, um die Wechselwirkungen zwischen Proteinen zu untersuchen. Insbesondere wird es verwendet, um den nativen Zustand oder die native Konformation des Proteins zu bestimmen. Der Nativzustand gibt Aufschluss über die genaue Struktur in drei Dimensionen. Dazu gehört die Information, ob es sich um ein Monomer, Dimer, Trimer, Tetramer usw. handelt. Ein Monomer ist ein Protein, das aus einer Untereinheit besteht. Ein Dimer besteht aus zwei Proteinuntereinheiten, die um 180 Grad gedreht sind. Ein Trimer besteht aus drei Untereinheiten usw. Mit dieser Art von Experimenten lässt sich auch feststellen, ob die Proteine Oligomere bilden können (identische Polypeptidketten, die zwei oder mehr Einheiten eines Proteins bilden). Darüber hinaus dient das Sedimentationsgleichgewicht der Bestimmung von Gleichgewichtskonstanten für Protein-Protein- und Protein-Ligand-Wechselwirkungen. Der Wert dieses Kd liegt häufig zwischen 1nM-1mM. Er wird durch Messung der Gleichgewichtskonstante (Kd) berechnet. Ein letzter Verwendungszweck ist die Bestimmung stöchiometrischer Verhältnisse zwischen Proteinkomplexen. Ein Beispiel hierfür ist ein Ligand und sein Rezeptor oder ein Antigen-Antikörper-Paar